NEOPLASME MIELOPROLIFERATIVE

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR ÎN

LEUCEMIA MIELOIDĂ CRONICĂ

DR. CRISTINA MAMBET

 INTRODUCERE
• NEOPLASME MIELOPROLIFERATIVE (NMP)
- afecțiuni hematologice cu evoluție cronică
- proliferarea uneia sau mai multor linii celulare în măduva osoasă
- producție excesivă de eritrocite, trombocite sau granulocite
mature, funcționale

• 1951: Dameshek - „boli mieloproliferative”

- Policitemia vera (PV)
- Trombocitemia esențială (TE)
- Mielofibroza primară (MFP)
- Leucemia mieloidă cronică (LMC)

• Caracter clonal – studii de inactivare a cromozomului X

• Distincția LMC prin prezența cromomozomului Philadelphia și a

markerului molecular BCR-ABL1
 INTRODUCERE

• 2008: OMS propune înlocuirea termenului de „boli

mieloproliferative” cu NMP

• 3 NMP „clasice”: PV, TE şi MFP

• În categoria NMP mai sunt incluse: leucemia cronică cu neutrofile,

leucemia cronică cu eozinofile fără anomalii genetice precizate,
mastocitoza sistemică, precum și NMP neclasificabile (NMP-nc)

• 2016: Mastocitoza nu mai este considerată subgrup NMP ci o

categorie separată de boală datorită caracteristicilor clinice și
patologice unice
 LEUCEMIA MIELOIDĂ CRONICĂ (LMC)

▪ Afecțiune clonală a celulei stem hematopoietice

caracterizată prin proliferarea excesivă a celulelor seriei
granulocitare în toate stadiile de maturație

▪ Faza cronică: adesea asimptomatică

HLG + frotiu de sânge periferic: leucocitoză

(12 – 100 000/ µL) cu deviere la stanga a formulei
leucocitare până la mieloblast (<2%) + bazofilie +/-
eozinofilie +/- trombocitoză
LMC – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
LMC – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
LMC – FROTIU DE SÂNGE PERIFERIC
 LMC – EXAMENUL MĂDUVEI OSOASE

▪ Aspiratul medular – necesar pentru examenul citogenetic

▪ Confirmă faza bolii

▪ Faza cronică: MO hipercelulară cu hiperplazia seriei

granulocitare, granulocite imature, blaști < 10%, nr. ↑ de
bazofile și eozinofile, fără modificări displazice
LMC – FROTIU DE ASPIRAT MEDULAR
 LMC – DIAGNOSTIC DIFERENȚIAL

▪ REACȚIA LEUCEMOIDĂ

- asociată infecțiilor și
inflamațiilor
- bazofilie absentă
- prezență de granulații
toxice sau vacuolizări
citoplasmatice
- fosfataza alcalină leucocitară ↑ (versus 0 în LMC!)
 LMC – MARKERUL DE BOALĂ

▪ Neoplasm mieloproliferativ caracterizat prin anomalia

citogenetică recurentă t(9;22)(q34;q11) → cromozom 22
derivativ = cromozom Philadelphia (Ph) → consecința
moleculară: juxtapunerea genei tirozin kinazei ABL1
(Abelson) de pe cromozomul 9 lângă gena BCR
(Breakpoint Cluster Region) de pe cromozomul 22 cu
formarea genei de fuziune BCR-ABL1
CROMOZOMUL Ph
PROTEINA BCR-ABL1 = tirozin-kinază (TK)
cu activitate constitutivă
LMC – EXAMEN CITOGENETIC CLASIC

t(9;22)(q34.1;q11.2) 90-95%
 LMC – TEHNICA FISH

5-10%: variante de translocații care implică un al 3-lea sau al 4-lea cromozom sau
translocații criptice ce nu pot fi evidențiate la ex. citogenetic clasic
TRANSCRIPȚII DE FUZIUNE BCR-ABL1
 TRANSCRIPȚII DE FUZIUNE BCR-ABL1

M-bcr (p210)
- majoritatea
- pacienților cu LMC
- 1/3 pacienți cu LAL B Ph+

m-bcr (p190)
- activitate TK › M-bcr
- majoritatea pacienților cu LAL B Ph+

µ-bcr (p230)
- rar în LMC clasică
- asociată cu maturare neutrofilică proeminentă
 TRANSCRIPȚII DE FUZIUNE BCR-ABL1

Primeri specifici localizati in exonul b2 (M-BCR), exonul e1 (m-BCR ),

exon e19 (μ-BCR ) si exonul a3 ABL1
TRANSCRIPȚII DE FUZIUNE BCR-ABL1 –
DETECȚIE CALITATIVĂ
 DETECȚIE CANTITATIVĂ - ETAPE DE LUCRU
1. IZOLAREA ARN-ului total din
leucocite (după liza eritrocitelor;
proba de sange EDTA)

2. REVERSTRANSCRIEREA →
cDNA

3. REAL-TIME PCR
LightCycler 2.0
 REAL-TIME PCR
COMPONENTE: amestec de reacție, MgCl2, primeri,
perechi de sonde de hibridizare HybProbe (sonda donor
marcată cu fluoresceină la capătul 3’ și sonda acceptor
marcată cu fluorocromul Red 640 la capătul 5’)
REAL-TIME PCR
 CURBA DE AMPLIFICARE
Fluorescence

Cycles
DETECTIE ȘI CUANTIFICARE BCR-ABL1
PACIENT BI

BCR-ABL1: 8190 copii

ABL1: 31 100 copii
BCR-ABL1/ABL1 = 26.33%

CONTROL POZITIV

BCR-ABL1: 380 copii

ABL1: 46 000 copii
BCR-ABL1/ABL1 = 0.82 %

- 6 standarde pentru BCR-ABL1

(10-1000000 copii/reacție)
- Generarea unei curbe standard
- Pentru validarea cuantificării:
Nr. copii ABL1: > 10 000
 MONITORIZARE TERAPEUTICĂ
BCR-ABL1
- Standardizarea determinărilor bazale în studiul IRIS
- Exprimarea măsurătorilor BCR-ABL1 pe o scală internațională
(IS)
- Detectarea bolii minime reziduale

Răspuns molecular major (MMR):

valori BCR-ABL1/ABL1 < 0.1% IS

MR2 - BCR-ABL1/ABL1 < 1% IS

MR4 - BCR-ABL1/ABL1 < 0.01% IS
MR4.5 - BCR-ABL1/ABL1 <0.0032% IS
MR5 - BCR-ABL1/ABL1 <0.001% IS
 PROGRESIA LMC

FAZA ACCELERATĂ LMC

- leucocitoză persistentă (> 10 000/µL) care nu răspunde la TKI
- splenomegalie refractară
- trombocitoză persistentă (> 1 000 000/µL) care nu răspunde la TKI
- trombocitopenie persistentă (< 100 000/µL) care nu este indusă de
terapie
- bazofilie marcată (≥ 20% bazofile în sîngele periferic)
- 10-19% blaști în sânge periferic și/sau măduva osoasă
- anomalii citogenetice secundare (copie Ph suplimentară, trisomie 8,
trisomie 18, izocromozom 17q)

PUSEU BLASTIC LMC

- poate fi mieloid sau limfoid
- blocaj în maturație
- ≥ 20% blaști în sîngele periferic și/sau măduva osoasă
 REZISTENȚA LA TKI

- lipsă de răspuns la imatinib/răspuns suboptimal/creșterea persistentă

a nivelului BCR-ABL1

CAUZE
- amplificarea genei de fuziune cu suprarexpresia BCR-ABL1
- supraexpresia unei proteine asociată cu multirezistență la terapie
(MDR-1)
- prezența unor mutații punctiforme în domeniul kinazic ABL1
al genei de fuziune BCR-ABL1
 REZISTENȚA LA TKI
- lipsă de răspuns la imatinib/răspuns suboptimal/creșterea persistentă
a nivelului BCR-ABL1

CAUZE
- amplificarea genei de fuziune cu suprarexpresia BCR-ABL1
- supraexpresia unei proteine asociată cu multirezistență la terapie
(MDR-1)
- prezența unor mutații punctiforme în domeniul kinazic ABL1
al genei de fuziune BCR-ABL1
▪ G250, Y253, E255, T315, M351, F359, H396 - 66% din cazurile
de rezistență la imatinib
▪ Y253H, E255K/V, F359V/C/I, T315I - rezistență la nilotinib
▪ V299L, F317L/V/I/C, T315A, T315I – rezistență la dasatinib
Ponatinib – inhibă mutația T315I
 DETERMINAREA MUTAȚIILOR PUNCTIFORME
BCR-ABL1

- Nested-PCR pentru amplificarea domeniului kinazic BCR-ABL1

- Secvențiere Sanger a produșilor nested-PCR