Evidenţierea chimică directă a domeniilor sfingolipidice în membranele plasmatice ale

fibroblastelor

ABSTRACT
Sfingolipidele prezinta roluri importante atat in structura membranei plasmatice cat si in
semnalizarea celulara. Cu toate acestea, distribuția lor în membrana plasmatică nu este pe deplin
cunoscuta. In acest articol este analizata cantitativ organizarea sfingolipidelor pe întreaga
suprafață dorsală a celulelor intacte prin cartografierea distribuției ionilor 15N din sfingolipidele
marcate metabolic cu 15 N în membrana plasmatică, folosind spectrometrie de masă de înaltă
rezoluție. Multe tipuri de experimente de control (interne, pozitive, negative și temperatura de
fixare), împreună cu experimentele paralele care implică imagistica sfingolipidelor fluorescente -
atât în celulele vii, cât și în timpul fixării celulelor vii - exclud potențialele artefacte. Patch-uri
sfingolipidice la scară micrometrică formate din numeroase 15Microdomainele N-sfingolipide cu
diametre medii de -200 nm sunt întotdeauna prezente în membrana plasmatică. Epuizarea a 30%
din colesterolul celular nu a eliminat domeniile sfingolipidelor, dar a redus abundența și
organizarea pe termen lung în membrana plasmatică. În schimb, perturbarea citoscheletului a
eliminat domeniile sfingolipidelor. Aceste rezultate indică faptul că aceste ansambluri de
sfingolipide nu sunt plute lipidice și sunt în schimb un tip distinct de domeniu de membrană
plasmatică îmbogățită cu sfingolipid care depinde de actina corticală.
Cuvinte cheie: SIMS, izotop stabil

Organizarea spațială a lipidelor și proteinelor din membranele plasmatice ale celulelor eucariote
este esențială pentru coordonarea semnalizării lipidelor și a numeroase alte procese care apar la
suprafața celulei ( 1 ). Astfel, ipoteza potrivit căreia lipidele se autoorganizează în domenii
diferite ale membranei plasmatice distincte din punct de vedere compozițional și funcțional a fost
investigată de zeci de ani ( 2 ). În membrana plasmatică pot exista microdomini cu o varietate de
compoziții lipidice și dependențe de interacțiunile lipidice și proteice ( 3- 5 ), dar cea mai
convingătoare microdomină lipidică este pluta lipidică, deoarece astfel de domenii se
autoasamblează în membrane sintetice ( 6 , 7 ). Plutele lipidice sunt definite ca domenii ale
membranei plasmatice dinamice și mici (între 10 și 200 nm), care sunt îmbogățite cu colesterol și
sfingolipide ( 6 , 7 ). În ciuda cercetărilor intense, distribuțiile majorității speciilor de lipide,
inclusiv colesterolului și sfingolipidelor, în membranele celulare sunt încă dificil de determinat
( 7 ). Capacitatea de a vizualiza direct specii de lipide specifice fără utilizarea de etichete
potențial perturbatoare ar ajuta la adresarea întrebărilor restante privind domeniile lipidice
distincte din membrana plasmatică ( 7- 9 ).
Aici folosim o abordare imagistică chimică de înaltă rezoluție pentru a aborda întrebarea: Cum
sunt distribuite sfingolipidele în membranele plasmatice ale celulelor intacte? Ne-am concentrat
pe sfingolipide, deoarece ( i ) acestea sunt postulate pentru a fi separate în domenii lipidice
compozițional diferite, cum ar fi plutele lipidice ( 10)- 12 ) și ( ii ) metaboliții sfingolipidului
sunt molecule de semnalizare care reglează supraviețuirea și proliferarea celulelor ( 13 ). Am
studiat o linie celulară fibroblastă de șoarece transfectată care exprimă în mod stabil gripa
hemagglutinină (linia celulară Clona 15), deoarece se consideră că grupurile de hemagglutinină
din membranele plasmatice sunt asociate cu domeniile sfingolipidului și colesterolului ( 10-
12 ). Astfel, am sperat să creștem probabilitatea de a detecta domenii ale membranei plasmatice
îmbogățite cu sfingolipide prin utilizarea liniei de celule Clona 15.
Pentru a vizualiza sfingolipidele din membrana plasmatică, le-am etichetat izotopic și apoi s-au
cartografiat distribuțiile lor în membrana plasmatică, folosind un instrument SIMS (spectru de
masă ionică secundară) (Cameca NanoSIMS 50) cu rezoluție laterală de 50 nm și o adâncime de
analiză de < 5 nm la suprafața celulei ( 14- 16 ); această adâncime de analiză este mai mică decât
grosimea membranei plasmatice. Rapoartele anterioare stabilesc că imagistica NanoSIMS nu
modifică distribuția biomoleculelor în compartimentele subcelulare sau în membranele lipidice
( 14 , 17- 19 ). Astfel, această abordare ne-a permis să determinăm cantitativ organizarea
sfingolipidelor. Singingipipidele au fost segregate în microdomane cu diametrul de -200 nm care
s-au grupat în mod nerandomic în plasturi cu membrană plasmatică bogată în sfingolipide, cu
dimensiuni la scară micrometrică. Efectele epuizării colesterolului și perturbării cito-scheletului
asupra acestei organizații sfingolipide indică faptul că aceste ansambluri de sfingolipide nu sunt
plute lipidice și, prin urmare, ar trebui denumite în prezent domenii sfingolipide.

MATERIALE SI METODE
Materiale.
Acizii grași marcați în mod uniform 13 (98% atom) au provenit de la Laboratorii de izotopi
Cambridge. BSA fără acizi grași (FAFBSA) și acidul stearic 13 C 18 (99 atom% 13 C) au provenit
de la Sigma. FBS redus de lipide (LR-FBS) și ser de vițel au fost de la laboratoarele
HyClone. Reactivii poli- L- lisină și de fixare au fost din Științele Microscopiei
Electronice. Mediul standard de creștere a celulelor a constat în modificarea Dulbecco cu
glucoză ridicată a mediului Eagle (DMEM) completat cu 10% (vol / vol) ser de vițel, 10 4 unități
/ ml penicilină G și 10 mg / ml streptomicină. BODIPY-sfingosină și 15 N-sfingolipide
precursoare ( 15 N-sfingosină și 15N-sfinganina, raport molar 1: 1) au fost sintetizate așa cum este
raportat în ref. 49- 51 . Linia de celule Clona 15 a fost obținută prin tehnici standard pentru
selectarea celulelor transfectate stabil după expresia tranzitorie într-o linie de fibroblast de
șoarece NIH 3T3 cu o plasmidă ADN pentru hemagglutinină din tulpina de gripă Japonia
pandemică din 1957.
Etichetare metabolică și epuizare a colesterolului.
Celulele Clone 15 au fost cultivate într-un mediu de creștere standard suplimentat cu 6,4 μM 15 N
precursori sfinolipidici la 37 ° C în 5% CO 2 . În fiecare zi ulterioară, s -au adăugat 15 precursori
N-sfingolipid. După 3 d, celulele au fost trecute într-un mediu de creștere suplimentat cu 1% (vol
/ vol) ser de vițel, 10% (vol / vol) LR-FBS, 6,4 μM 15 N-preferenți sfingolipidici, 215 μM 13 C-
acizi grași (4 : raportul 1: 28 masa de ul- 13 acizi grași C / 13 acid stearic-C / FAFBSA), 50 pM
colesterol și 2 pM etanolamina. În fiecare zi ulterioară, ser de vițel 1% (vol / vol), 10% (vol / vol)
LR-FBS, 15 precursori sfinolipidici N, colesterol, 13S-a adăugat amestecul de acizi grași C și
etanolamină. În ziua a 6-a, celulele au fost trecute în vase care conținau substraturi de siliciu 5 ×
5-mm acoperite cu L -lisină. A doua zi, substratele cu celule aderente au fost preparate pentru
analiza NanoSIMS. Pentru experimentele care implică epuizarea colesterolului, celulele au fost
clătite cu PBS și incubate cu 15 ml de 10 mM mβCD în DMEM timp de 15 min la 37 ° C înainte
de prepararea pentru analiza NanoSIMS. Etichetarea a fost evaluată folosind celule atașate pe
vasul de cultură. Colesterolul la fracția totală de fosfolipide din celulele tratate cu mβCD și
celulele netratate a fost determinat așa cum este raportat în ref. 17. Pentru experimentele de
tulburare citoscheletală, celulele atașate la substraturi au fost incubate în mediul de creștere a
etichetei metabolice completat cu 0,83 μM de lat-A (soluție stoc: 100 μg lat-A în 1 ml etanol)
timp de 30 min la 37 ° C și apoi au fost conservate.
Microscopie cu fluorescență.
Celulele au fost imaginate folosind o configurație TIRFM construită în jurul unui microscop
Zeiss Axiovert 200 echipat cu un obiectiv NA de 100 × 1,45 NA și un laser de 488 nm
( 52). Celulele au fost cultivate în prezență de 2,5 μM BODIPY-sfingosină timp de 2 ore la 37 °
C, urmate de 2 h în mediu de creștere fără marcaj. Pentru imagini cu celule vii, celulele au fost
păstrate în DMEM cu 2% (vol / vol) ser de vițel în camere sigilate menținute la 37 ° C, folosind
un stadiu controlat la temperatură (Delta-T; Bioptech). Celulele utilizate pentru imagistica cu
celule vii au fost spălate de două ori cu PBS, fixate cu 4% glutaraldehidă timp de 30 min și
reimaginate. Pentru vizualizarea localizării sfingolipidului și hemagglutininei, celulele vii
marcate cu BODIPY-sfingosină au fost incubate cu fragmente Fab de anticorp
antihemagglutinină conjugat cu Cy5.5 la 37 ° C timp de 20 min în stadiul controlat la
temperatură. Imagistica TIRFM a indicat membranele bazale ale celulelor au fost complet
marcate cu anticorp antihemagglutinină după 20 de minute.
Conservarea celulelor.
Substraturile cu celule aderente au fost clătite cu PBS și Hendry's Phosphate Buffer
(HPB). Celulele au fost fixate timp de 30 min la RT sau 37 ° C în glutaraldehidă 4% în HPB, s-
au clătit o dată timp de 5 min în HPB și s-au clătit de două ori timp de 5 min în apă triplă
distilată. Celulele s-au prefixat în soluție de tetroxid de osm 0,4% timp de 15 minute la RT, s-au
clătit de trei ori 5 minute în apă și s-au uscat la aer.
Analiza SIMS.
Probele au fost acoperite cu ∼3 nm de iridiu (99,95% Ir) pentru a preveni încărcarea în timpul
analizei, așa cum este descris în metodele SI . SIMS a fost efectuat pe un Cameca NanoSIMS 50
la Laboratorul Național Lawrence Livermore cu un fascicul de ioni primari de 0,129 pA, 15
keV 133 Cs + concentrat pe un punct de 69 nm. Patru scanări repetate de 512 × 512 pixeli cu o
durată de timp de 1 ms / pixel au fost obținute pentru fiecare regiune de analiză de 15 × 15 µm,
rezultând o dimensiune a pixelilor (29 × 29 nm) mai mică decât diametrul
fasciculului. Cele 12 C 1 H - , 13 C 1 H - , 12 C 14 N - și 12 C15 N - ioni secundari și electroni secundari
au fost colectați simultan. O putere de rezoluție masa de ~6,700 a fost folosit pentru a separa
interferențele izobare de izotopi de interes, de exemplu, 12 C 15 N - de la 13 C 14 N - la masa 27.
Doza ion primar a fost 4,48 x 10 14 ioni / cm 2 .
Analiza imaginii.
Datele NanoSIMS au fost prelucrate cu un pachet software personalizat (L’image; LR Nittler,
Instituția Carnegie din Washington, Washington, DC) rulat cu PV-Wave (Visual
Numerics). Imaginile de îmbogățire cantitative de 15 N și 13 C care arată distribuțiile de 15 N-
sfingolipide și respectiv 13 C-lipide au fost construite folosind un algoritm de netezire mediu de 3
× 3 pixeli. Îmbogățirea izotopilor este 12 C 15 N - / 12 C 14 N - sau 13 C 1 H - / 12 C 1 H -raportul
împărțit la raporturile standard de abundență naturală (0,00367 și respectiv
0,011237). Semnificația statistică a creșterilor locale în îmbogățirea 15 N a fost evaluată cu
ajutorul Instrumentului pentru statistici MATLAB. Gruparea, distanțele cele mai apropiate cu
vecinul și distanțele domeniu-domeniu au fost evaluate în raport cu ref. 10 .

REZULTATE
Etichetarea metabolică a atins un nivel ridicat de încorporare specifică moleculelor 13 C
și 15 N.
Am etichetat metabolic celule Clona 15, folosind acizi grași marcați în mod uniform 13 C
și 15 precursori ai sfingolipidelor, 15 N-sfingosină și 15 N-sfinanină, astfel
încât sfingolipide rezultate în N (adică, sfingomielină, ceramidă și glicosfingolipide ) a atins o
15

distribuție în stare constantă în membrana plasmatică fără 15 N-încorporarea în proteine

( 20 ). Acizii grași uniform marcați cu 13 C au variat în lungimea lanțului și gradul de saturație
pentru a promova încorporarea lor în toate speciile de sfingolipide și glicerolipide, producând
probabil o distribuție uniformă de 13Lipide C în membrana celulară. Această etichetare globală a
majorității lipidelor cu carbon-13 a permis evaluarea integrității membranei plasmatice și
detectarea variațiilor dependente spațial ale sensibilității analizei sau a grupării lipidice
artificiale. Aproximativ 80% din N sphingomyelin -palmitoyl, sphingolipid celular cel mai
abundent am detectat, conținea un 15 N-izotop, și 13 C 16 Acid -palmitic a fost încorporată în ~
80% din N -palmitoyl sfingomielina ( Fig. S1 ). Puțin (<2%) 15 N-îmbogățirea
fosfatidiletanolaminei din cauza catabolismului 15 N-sfingolipid a fost detectat ( metode SI ),
deci 15Incorporarea N în speciile nesingingolipide a fost neglijabilă. Folosind metodele raportate
anterior ( 21 ), am stabilit că% dintre ~ 60 acizii grași din glycerolipids celulare au fost
uniform 13 marcate C. Celulele au fost pregătite pentru analiza SIMS prin fixare chimică în
glutaraldehidă, urmată de osmicare, o procedură cunoscută pentru imobilizarea lipidelor,
deoarece tetroxidul de osm acționează ca un reticulant multivalent ( 22 ). Această procedură
produce o membrană a cărei organizare este păstrată în timpul procesului de uscare inevitabil
necesar pentru introducerea în vidul camerei de analiză NanoSIMS ( 22)). Celulele bine
conservate, cu microextensii intacte și morfologii normale, au fost identificate prin imagistică cu
microscopie electronică de scanare de joasă tensiune (SEM) și apoi analizate cu NanoSIMS.
Imaginile NanoSIMS arată domenii îmbogățite cu sfingolipide în membrana plasmatică.
Probele au fost acoperite cu un strat subțire (3 nm) de iridiu care împiedică încărcarea în timpul
analizei NanoSIMS; lucrările anterioare stabilesc că aceste acoperiri metalice nu modifică
distribuția lipidelor la suprafața celulei ( 23 ). Pentru a vizualiza distribuțiile de 13 lipide C și 15 N-
sfingolipide în membrana plasmatică, 12 C 1 H - , 13 C 1 H - , 12 C 14 N - și 12 C 15 N -ioni secundari au
fost obținuți simultan în NanoSIMS. Deoarece ratele de număr de ioni pot varia cu reglarea
instrumentului, topografia eșantionului și alți factori independenți de concentrație, imagini de
îmbogățire cantitative de 13 C și 15 N au fost construite prin normalizarea numărului de ioni
specific lipidelor la fiecare pixel, în funcție de numărul principal de specii (adică , 13 C 1 H -
/ 12 C 1 H - sau 12 C 15 N - / 12 C 14 N -). Această normalizare funcționează deoarece variațiile
independente de concentrație ale ratelor de număr ale izotopului specific lipidelor
(adică 12 C 15 N - ) sunt proporționale cu variațiile independente de concentrație ale ratelor de
număr ale speciilor de izotopi abundenți corespunzători (adică 12 C 14 N - ) ( 14 , 24 , 25 ), așa
cum s-a demonstrat prin experimente de control ( Fig. S2 ). Raporturile rezultate sunt
proporționale cu abundența locală a moleculelor marcate izotopic. Aceste raporturi au fost
împărțite în raporturi standard de abundență naturală, producând „factori de îmbogățire izotopi”
care cuantifică cantitatea de13 lipide C și 15 N-sfingolipide în comparație cu celulele nemarcate
( 24 ) ( Fig. S2 ). Factorii de îmbogățire a izotopilor au fost codați color și s-au mapat la pixelul
corespunzător din imagine. După calcularea mediei mobile pe o fereastră de 3 × 3 pixeli,
rezoluția laterală a imaginii de îmbogățire a fost de 87 nm, comparativ cu diametrul de 70 nm al
fasciculului de analiză. Pe baza condițiilor noastre de funcționare și a vitezei de pulverizare
determinată pentru probele biologice ( 26 ), adâncimea de sputtering (<2 nm) a fost mult mai
mică decât grosimea membranei plasmatice (7,5 nm) ( 27 ), asigurând un număr minim de ioni
secundari colectate din citoplasma de bază.
Imaginile cu electroni secundari ale celulelor fibroblastelor Clona 15 au fost colectate simultan la
ionii secundari pentru a permite raportarea datelor izotopice cu locația și morfologia celulelor
( Fig. 1 și Fig. S3 ). Nivelurile ridicate de încorporare a izotopilor 15 N în sfingomielina celulară
au permis localizarea și densitatea sfingolipidelor în membrană cu un raport semnal-zgomot
ridicat. Creșterile locale în îmbogățirea 15 N au fost dispersate într-o matrice cu o îmbogățire mai
mică de 15 N pe suprafețele celulelor Clona 15 ( Fig. 2 și Fig. S3 ). Experimentele de control au
exclus posibilitățile ca aceste creșteri locale în 15Îmbogățirea cu N au fost artefacte induse de
topografia celulelor ( Fig. S2 ), acoperirea cu iridiu ( Fig. S4 ) sau materialul marcat cu izotop
adsorbit în celulă ( Fig. S5 ). În consecință, aceste creșteri locale în îmbogățirea 15 N sunt
domenii ale membranei plasmatice îmbogățite cu 15 S -sfingolipide. Aceste microdomane
sfingolipide au fost detectate la fiecare din cele peste 25 de celule studiate. Pe baza analizei
subregiunilor de 3 × 3 pixeli de 59,301 pe celula Clona 15 prezentată în Fig. 2 , un factor de
îmbogățire 15 N ≥12 este cel puțin 2 SD peste media 15 factor de îmbogățire a N N pentru
regiunile libere de domeniu (înseamnă 15Factorul de îmbogățire a N pentru regiunile fără
domeniu = 7,8, 1 SD = 2,1) și, prin urmare, reprezintă o creștere semnificativă statistic
în îmbogățirea locală a 15 N-sfingolipidă a membranei plasmatice . Cele 15 domenii îmbogățite cu
sfingolipid pe această celulă ( Fig. 2 ) și altele ( Fig. S3 și Tabelul S1 ) au fost mai abundente pe
corpul principal al celulei decât pe extensiile sale. Deșeurile de pe substratul din apropierea
celulei au fost, de asemenea, îmbogățite cu 15 N-sfingolipide, în conformitate cu rapoartele
conform cărora fibroblastele depun lipide împreună cu alte materiale celulare atunci când
migrează ( 28 ).

DISCUŢIE
Acum putem respinge ipotezele conform cărora domeniile îmbogățite cu sfingolipid în
membrana plasmatică sunt nanoscopice sau inexistente ( 7- 9 ), deoarece am imaginat direct
domeniile sfingolipidelor pe suprafețele dorsale ale celulelor intacte prin combinarea etichetării
metabolice cu SIMS de înaltă rezoluție. Singingipipidele sunt îmbogățite în microdominii cu
membrană cu diametrul de 200 nm, care se grupează în domenii mai mari, în principal, în
interiorul plasmelor cu diametrul de 5-10 mm pe corpul celulei. Aceste domenii sfingolipide sunt
foarte dependente de citoschelet, dar nu și de hemagglutinină, iar aglomerarea lor este perturbată
de depletarea colesterolului. Aceste domenii nu pot fi atribuite perturbațiilor induse de etichete în
interacțiuni moleculare sau sfingolipidă traficului , deoarece 15N-sfingolipidele pe care le-am
imaginat au fost biosintetizate de celulă și au aceeași structură chimică ca și sfingolipidele
native. Deși am obținut imagini chimice ale celulelor fixe, datele noastre indică faptul că
reprezintă imagini ale organizațiilor sfingolipide care au fost prezente în celulele Clone 15
vii. Această concluzie este susținută de ( i ) excluderea creșterilor artificiale în abundența locală
de 15 N-sfingolipide cauzată de vezicule adiacente membranei, resturi marcate izotopic pe
suprafața celulei sau aglomerarea lipidică nespecifică indusă de conservarea celulelor; ( ii )
absența modificărilor în organizarea fluorescentă a sfingolipidului în timpul și după fixarea
glutaraldehidei; ( iii ) asemănare cu aspectul15 domenii N-sfingolipide detectate cu SIMS și
domeniile sfingolipide fluorescente imaginate în membranele celulelor vii de TIRFM; ( iv )
excluderea reorganizării sfingolipidului indusă de temperatură în timpul conservării; și ( v )
controale analitice. Aceste experimente au pus bazele dezbaterii asupra existenței domeniilor
lipidice din punct de vedere compozițional în membrana plasmatică, care se află în literatura de
specialitate de zeci de ani și ne conduc să respingem modelele de organizare a membranelor care
prezintă compoziții lipidice omogene spațial.
Am efectuat acest studiu cu celule Clona 15, deoarece ne-am așteptat ca aceste celule să conțină
domenii sfingolipide care să poată fi detectate cu NanoSIMS. Această așteptare s-a bazat pe
ipoteza că peticele pe scară micrometrică ale lipidelor de membrană de colorare întunecată
asociate cu grupurile de gripă cu hemagglutinină au fost plute îmbogățite cu colesterol și
sferolipid, care s-au îmbinat din cauza interacțiunilor favorabile cu hemagglutinina
( 10 , 12). Deși am detectat domenii sfingolipide în membranele plasmatice ale celulelor Clone
15, descoperirile noastre au contrazis în mare măsură această ipoteză. Nu au fost necesare
interacțiuni hemagglutinină-sphingolipid pentru formarea domeniului sfingolipid. De asemenea,
colocalizarea incompletă între domeniile hemagglutininei și sfingolipidele din celulele Clone 15
sugerează că proteina asociată plutei, hemagglutinina ( 10 , 12)), nu este un marker de încredere
pentru domeniile sfingolipidelor. Mai mult decât atât, proprietățile domeniilor sfingolipidelor
observate, care includ dimensiunile scării micrometrului și răspunsurile lor la reducerea
colesterolului celular, nu sunt în concordanță cu cele ale plutei lipidice. În mod specific, deși
abundența și organizarea domeniilor sfingolipidelor au fost influențate de colesterol, aglomerarea
de sfingolipide non-ramice a fost afectată mai drastic de întreruperea cito-scheletului decât de
epuizarea colesterolului. De fapt, organizarea alterată de sfingolipide observată după tratamentul
cu mβCD a fost probabil cauzată de modificări induse de depletia colesterolului în organizarea
citoscheletului ( 31)- 33 , 35 ) și nu printr-o pierdere a interacțiunilor de colesterol -
sfingolipide. Deoarece interacțiunile colesterol-sphingolipid par să joace un rol minor în
formarea domeniului sfingolipid, concluzionăm că domeniile sfingolipide nu sunt plute lipidice
și sunt în schimb un domeniu de membrană plasmatică îmbogățit cu sfingolipid distinct. Pe baza
rapoartelor privind o diferență de mărime între domeniile GM1 și GM3 și segregarea lor una de
cealaltă ( 4 , 36 , 37), ne așteptăm ca membrana plasmatică să conțină mai multe tipuri de
microdominii care diferă în compoziția și dimensiunea subspeciei sfingolipide. În consecință,
peticele de sfingolipid la scară micrometrică pe care le-am observat în celulele Clonei 15
constau, probabil, din microdominii care sunt îmbogățite cu o subspecie sfingolipidă
diferită. Studii suplimentare care implică imagistica simultană a numeroase subspecii
sfingolipide sunt necesare pentru a testa aceste ipoteze.
Dacă membrana plasmatică conține domenii sfingolipide cu dimensiuni de până la micrometre,
de ce domeniile membranei plasmatice îmbogățite cu sfingolipid sunt de dorit să aibă diametre
sub 200 nm? Așteptarea domeniilor sfingolipide la scară nanometrică se bazează în primul rând
pe presupunerea că toate domeniile sfingolipidului sunt plute lipidice, care sunt definite ca
domenii nanoscale îmbogățite cu sfingolipide, colesterol și glicozilfosfatidilinositol (GPI)
proteine ancorate ( 6 , 7). În consecință, trebuie luată în considerare modul în care a fost dedusă
mărimea plutei. Deoarece interacțiunile de coeziune dintre colesterol, sfingolipide și proteine
ancorate GPI sunt postulate pentru a induce formarea plutei lipidice, dimensiunile domeniului
<200 nm au fost deduse din aglomerarea și difuzia de proteine ancorate GPI și sfingolipidele
( 36 , 38)- 40 ). Cu toate acestea, numeroase studii au demonstrat că gruparea și difuzarea
împiedicată a proteinelor și lipidelor ancorate GPI sunt reglate de organizarea cortinei de actină,
care este perturbată de depletarea colesterolului ( 4 , 32 , 41- 44 ). Relația indirectă între
proprietățile biofizice dependente de colesterol și compoziția lipidică locală în membrana
plasmatică face ca infimarea dimensiunii domeniului sfingolipid de la un comportament biofizic
să fie mai puțin fiabilă decât imaginea directă a componentelor sfingolipidelor. Vizualizarea
distribuției sfingolipidelor prin utilizarea unor analogi sfinolipide marcate fluorescent sau a unor
etichete de afinitate specifice sphingolipidului a evidențiat domenii ale membranei plasmatice
care diferă în compoziția și dimensiunea subspecii spingolipide ( 4 , 36 , 37 , 45- 47 ). Așa cum
am menționat mai sus, GM1 și GM3 sunt localizate în domenii separate care au diametre <300
nm ( 4 , 36 , 37 ), în timp ce sfingomielina este îmbogățită în domenii ale membranei plasmatice
cu dimensiuni la scară micrometrului ( 45- 47 ). Deoarece domeniile sfingomielinei la scară
micrometrică sunt incompatibile cu intervalul de mărime preconizat pentru plutele lipidice,
aceste descoperiri au fost respinse în mare parte sub formă de artefacte cauzate de clustering-ul
indus de fluorofor sau de reticularea anticorpilor. Studiile noastre de microscopie cu fluorescență
și utilizarea unei metode de imagistică chimică complementară care utilizează etichete de izotopi
stabili nonperturbing confirmă faptul că domeniile sfingolipide au dimensiuni la scară
micrometrului. În total, aceste descoperiri indică faptul că majoritatea domeniilor sfingolipide
din membrana plasmatică nu sunt plute lipidice, deci dimensiunile domeniilor sfingolipide nu pot
fi deduse din proprietățile atribuite plutelor lipidice.
Detectarea SIMS de înaltă rezoluție a sfingolipidelor marcate metabolic oferă dovezi directe
pentru patch-urile îmbogățite cu sferolipid la scară micrometrică compuse din numeroase
microdominii din membranele plasmatice ale celulelor fibroblastice. Aceste domenii sunt
organizate pe mai multe niveluri ierarhice. Deși organizarea lor de lungă durată este influențată
de epuizarea colesterolului, proprietățile domeniilor sfingolipide observate indică faptul că nu
sunt plute lipidice. În schimb, datele noastre susțin un model în care schele de proteine constând
din citoschelet și proteinele sale asociate compartimentează membrana plasmatică
( 3 , 5 , 48). Prin adăugarea unei dimensiuni unice de analiză - imagistică compozițională
specifică chimic la scara de zeci de nanometri - se obține o perspectivă unică asupra cauzelor și
consecințelor funcționale ale organizării membranei plasmatice.