Streptococii:

Diagnosticul de referinta – Serotiparea

In majoritatea cazurilor, serotiparea streptococilor nu are consecinte clinice sau

terapeutice immediate. Este cel mai des realizata de laboratoarele de referinta cu scop in
studii epidemiologice si evaluarea eficacitatii vaccinurilor. Desi serotiparea clasica anticorp-
dependenta pentru serotipurile capsulare si proteinele de suprafata au fost folosite de ani de
zile, metodele moleculare au castigat teren deoarece nu necesita tehnici speciale sau
intretinerea reactivilor care se folosesc rar. Un alt avantaj este independenta secventelor ADN
fata de conditiile de cultura..

Pentru diferentierea unor clone distincte, sistemele de electroforeza in gel cu camp

pulsat (pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)) si sitemele de tipizare a secventei multilocus
(multilocus sequence typing (MLST) systems) au fost implementate pentru multe specii de
streptococ. S. pneumoniae cuprinde mai mult de 90 serotipuri cu antigene capsulare distincte
care pot fi detectate de testul Neufeld (reacție Quellung), care este încă considerată drept
gold standard pentru studii epidemiologice.

Reacția Quellung, denumită și reacția Neufeld, este o reacție biochimică în care

anticorpii se leagă de capsula bacteriană a Streptococcus pneumoniae, Klebsiella
pneumoniae, Neisseria meningitidis, Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae, Escherichia
coli și Salmonella. Reacția de anticorp permite vizualizarea acestor specii la microscop. Dacă
reacția este pozitivă, capsula devine opacă și pare să se mărească.

Fotografie la microscop a bacteriilor Streptococcus

pneumoniae care dezvăluie umflarea capsulară folosind
testul Neufeld quellung. Observați cei doi streptococi din
partea de sus a fotografiei care par să nu aibă o capsulă.
Culturi pure de pneumococci se cultivă pe o placa de agar sânge de oaie proaspăt preparat 5%
sau o placă de agar sânge de cal 10% la 35 ° C până la 37 ° C și 5% CO2 timp de 18 până la
24 ore. O cantitate mică de creștere bacteriană (mai mică de 10 µl anse) este
resuspendată într-o picătură de soluție salină tamponată cu fosfat sau fiziologic (standardul
McFarland de 0,5%). Câtiva microlitrii din suspensia salină sunt amestecate cu o cantitate
egală de antiseruri de iepure pneumococice specifice (ser de iepure cu anticorpi
antipneumococ) pe o lamelă de sticlă. Ulterior, eșantionul este evaluat pentru umflarea
capsulelor (o zonă limpede care înconjoară celulele bacteriene) prin microscopie cu contrast
de fază (imersie de ulei; mărire, × 1.000)

Urmând același principiu, kiturile disponibile în comerț (Pneumotest Statens Serum Institut,
Copenhaga, Danemarca) permit testarea rapidă a serotipurilor S.pneumoniae cu antiser
combinat printr-o metodă de control. (((((Following the same principle, commercially available
kits (Pneumotest Statens Serum Institut, Copenhagen, Denmark) allow rapid testing of
S.pneumoniae serotypes with pooled antisera by a checker-board method))))

Un test de detectare rapidă a antigenului folosind o combinație antiserice cuplate cu

margele/beads de latex (((pooled antisera coupled to latex beads))) (Statens Serum Institut)
a fost dezvoltat. Datorită discrepanțelor tulpinilor (((Due to strain discrepancies))), se
recomandă confirmarea reacției Neufeld Quellung. În plus, metodele PCR pentru
determinarea serotipului pneumococic a fost dezvoltată în ultimii ani. Pentru deosebirea
clonelor unice, în investigațiile pneumococice s-au utilizat scheme PFGE sau de tipuri de tip
MLST. Zece antibody-defined capsular polysaccharides au fost descrise pentru S. agalactiae
(Ia, Ib și II până la IX). Procentul de tulpini nescriptibile/nontypeable poate fi redus la
minimum prin optimizarea expresiei capsulare. În plus față de detectarea anticorpilor a
serotipurilor capsulare, tehnicile bazate pe PCR și secvențierea ADN permit depistarea
serotipurilor capsulare. Clone individuale de S. agalactiae au fost detectate fie prin MLST, fie
prin PFGE.

Serotiparea convențională a S. pyogenes se bazează pe specificitatea antigenica a

proteinelor T și M exprimate la suprafață. Proteina T rezistentă la tripsină face parte din
structurile pilus. Tipul T poate fi identificat prin aglutinarea cu teste serologice disponibile
comercial care utilizează aproximativ 20 de seruri anti-T acceptate. Proteinele M sunt factori
majori de virulență antifagocitară ai S. pyogenes .

Variația secvenței N-terminale a genelor care codifică acești antigeni cu înaltă protecție
stă la baza sistemului de serotipare prin precipitare a S.pyogenes. ((((N-terminal sequence
variation in genes encoding these highly protective antigens is the basis of the S.pyogenes
precipitation typing system)))) În prezent, 83 serotipuril M sunt validate fără echivoc și
recunoscute internațional ca fiind unice serologic și sunt desemnate M1 până la M93 în
clasificarea Lancefield (137). Serotipurile M care nu sunt incluse provin din organisme care nu
sunt S.pyogenes sau corespund unui serotip M existent.

Un sistem serotipare molecular se bazează pe secvențele de nucleotide care codifică

extremitățile amino ale proteinelor M. Secventa genei emm codifica proteinele M si s-a corelat
cu serotipurile Lancefield M. Aceasta metodologie permite atrebuirea unei secvente validate
de proteine M (emm1 prin emm124) si identificarea unui nou tip de secvente emm si a
devenit gold standard pentru S. pyogenes . O mare baza de date de aproximativ 350
secvente de gene emm din tulpinile folosite initial pentru serotipizarea Lancefield care include
secvente emm din streptococii beta-hemolitici ai grupurilor C, G si L sunt stocate la CDC
(http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep / strepblast.htm). O schemă MLST este de
asemenea disponibilă pentru S. pyogenes. Studiile genetice ale populației au demonstrat
asocieri stabile între tipul EMM și MLST printre izolate obținute la decenii între ele și / sau de
pe diferite continente.

In outbreak situations\situatii de focar? care includ S. pyogenes, restrictia digestiei mediate

enzimatic? (restriction enzyme-mediated digestion) a ampliconilor emm este o unealta
valoroasa pentru identificarea rapida a izolatelor ce contin gene similare cu emm. Pentru
grupuri (clusters) de izolare care au aceeași valoare de tip emm, profilurile PFGE pot fi utile
pentru a distinge tulpini similare.