Anticorpi anti-citoplasma neutrofile (imunofluorescenta)

190 Lei

Informatii generale
Anticorpii ANCA au fost descrisi pentru prima data in 1982 la pacienti cu glomerulonefrita de natura
autoimuna.
ANCA sunt anticorpi (de tip IgG, mai rar IgA si IgM) indreptati in principal impotriva antigenelor din
citoplasma granulocitelor neutrofile (tintele moleculare fiind enzimele din granulatiile primare sau azurofile
ale granulocitelor neutrofile) si monocitelor1;4;5.
Utilizand ca substrat neutrofile fixate cu etanol, la examenul prin imunofluorescenta indirecta au fost descrise
3 pattern-uri principale:
 citoplasmatic (c-ANCA), caracterizat prin fluorescenta granulara citoplasmatica difuza, cu accentuare
centrala interlobulara; antigenul este reprezentat de proteinaza 3 (PR3), un component atat al granulatiilor
azurofile din celulele mieloide, cat si al lizozomilor monocitari;
 perinuclear (p-ANCA), caracterizat prin fluorescenta perinucleara (inelara) omogena, fara
fluorescenta citoplasmatica; principalul antigen estemieloperoxidaza (MPO), o proteina a granulatiilor
neutrofile implicata in procese metabolice cum ar fi generarea de radicali de oxigen. Acest pattern apare
datorita migrarii antigenelor incarcate pozitiv (cationice) in timpul fixarii cu etanol spre membrana nucleara
care este incarcata negativ. Atunci cand in loc de etanol se utilizeaza formalina pentru fixarea neutrofilelor,
antigenul tinta este imobilizat si se obtine o fluorescenta citoplasmatica.
 atipic ANCA (x-ANCA), caracterizat prin fluorescenta perinucleara neomogena; antigenele implicate
sunt catepsina G, elastaza, lactoferina, catalaza, enolaza, lizozimul, BPI (proteina bacterida care creste
permeabilitatea) sau alte antigene necunoscute. Spre deosebire de aspectul p-ANCA tipic, atunci cand in loc
de etanol se utilizeaza formalina pentru fixarea neutrofilelor nu se obtine fluorescenta4.
Au mai fost descrisi anticorpii GS-ANA (granulocyte-specific ANA = anticorpi anti-nucleari specifici
granulocitelor) care produc o fluorescenta nucleara sau perinucleara pe substratul fixat cu etanol, dar
negativa pe substrat Hep-2 si care apar la 20% dintre pacientii cu artrita reumatoida (prezenta lor ar putea fi
determinata de ingestia complexelor imune de catre neutrofile, antigenul tinta nefiind inca identificat) 1.
Anticorpii ANCA se depisteaza predominant la pacientii cu vasculita sistemica pauciimuna, caracterizata
histologic prin necroza fibrinoida prezenta in peretii venulelor, capilarelor si arteriolelor. Spre deosebire de
vasculita mediata prin complexe imune, in vasculitele asociate cu ANCA lipsesc depozitele de complexe imune
din peretele vascular, fiind prezente in schimb, mai ales in stadiile precoce de boala, polimorfonucleare.
Afectarea endoteliului vascular, indusa de neutrofile, detine de asemenea un rol important in patogenia
vasculitelor pauciimune.
Anticorpii c-ANCA se asociaza in mod specific cu boala Wegener. In cazul unei boli active cu vasculita
sistemica, glomerulonefrita necrotizanta si inflamatie de tip granulomatos a tractului respirator, sensibilitatea
clinica a c-ANCA este de 85-90%.
In lipsa afectarii renale sensibilitatea clinica este de numai 75%. Titrul anticorpilor c-ANCA se coreleaza cu
gradul de activitate a bolii; dupa terapia imunosupresoare titrul anticorpilor scade foarte mult sau se obtine
un rezultat negativ. c-ANCA mai pot aparea in poliangeita microscopica si in sindromul Churg-Strauss, insa cu o
prevalenta redusa (45% si, respectiv, 10%).
Anticorpii p-ANCA apar tipic in glomerulonefrita rapid progresiva idiopatica, sindromul Churg-Strauss,
poliangeita microscopica si panarterita nodoasa clasica (sensibilitate clinica de 65%, 60%, 45% si respectiv 15%).
Peste 90% din cazurile confirmate bioptic de glomerulonefrita necrotizanta pauciimuna sunt p-ANCA pozitive.
p-ANCA se mai depisteaza sporadic la unii pacienti cu o anumita forma de sclerodermie, caracterizata prin
hemoragie pulmonara si insuficienta renala normotensiva 3;5.
Anticorpii x-ANCA se asociaza cu hepatitele autoimune, colangita sclerozanta primitiva, bolile inflamatorii
intestinale (colita ulceroasa si boala Crohn), sindromul Felty 1;5. Majoritatea pacientilor adulti cu colita ulceroasa
prezinta anticorpi p-ANCA ce sunt sensibili la DNA-aza, proprietate ce poate ajuta in diagnosticul diferential al
anticorpilor p-ANCA din bolile inflamatorii de cei din hepatita autoimuna si colangita sclerozanta 4.
Ghidurile internationale (International Consensus Statement) recomanda testarea si raportarea ANCA
utilizand metoda imunofluorescentei indirecte in combinatie cu metoda imunoenzimatica care detecteaza
specificitatile ANCA pentru MPO si PR3. Deseori, sub presiunea optimizarii costurilor, screening-ul este realizat
prin imunofluorescenta si este urmat de metoda imunoenzimatica numai daca rezultatul este pozitiv. O inalta
sensibilitate diagnostica pentru anticorpii ANCA este dobandita atunci cand se utilizeaza simultan, din start,
imunofluorescenta si metoda imunoenzimatica. Acest lucru poate fi posibil utilizand o combinatie de
neutrofile fixate cu etanol, neutrofile fixate cu formalina, substrat Hep-2, ficat de primate si spoturi tip
microdrops cu amprente antigenice unice (MPO si PR3) in acelasi camp de incubatie. Astfel este posibila
prediferentierea autoanticorpilor prin compararea pattern-urilor fluorescente, iar acestea se pot confirma
reciproc. Prin combinarea substraturilor conventionale cu amprentele antigenice definite anti-MPO si anti-
PR3, rezultatul testului de screening poate fi confirmat direct.
Neutrofilele fixate cu etanol reprezinta substratul standard pentru anticorpii ANCA. Formalina previne
migrarea antigenelor neutrofile din citoplasma catre membrana nucleara si distruge antigenele nucleare. Pe
substratul fixat cu etanol, antigenele neutrofile citoplasmatice sunt incarcate pozitiv si migreaza spre
membrana nucleara incarcata negativ, rezultand un pattern p-ANCA. Daca neutrofilele sunt tratate cu
formalina, se realizeaza legaturi covalente intre proteine, migrarea este oprita si antigenele raman in
citoplasma. Astfel, probele avand un aspect p-ANCA pe substratul fixat cu etanol prezinta un aspect c-ANCA
pe substratul fixat cu formalina, in timp ce probele ANA pozitive devin negative sau isi reduc intensitatea cand
sunt trecute pe substratul fixat cu formalina. Frecvent, probele pacientilor sunt pozitive atat pentru anticorpii
ANCA, cat si pentru anticorpii ANA. Anticorpii ANA pot mima pattern-ul p-ANCA pe substratul fixat pe etanol,
de aceea este necesar sa se faca distinctia intre pattern-urile c-ANCA si p-ANCA adevarate de cele non-ANCA
(fals-pozitive)2.
Recomandari pentru determinarea anticorpilor ANCA (conditii clinice asociate)
• glomerulonefrita (in special forma rapid progresiva);
• hemoragie pulmonara;
• vasculita cutanata cu manifestari sistemice;
• noduli pulmonari multipli;
• afectiuni cronice distructive ale cailor respiratorii superioare;
• sinuzita sau otita cu evolutie indelungata;
• stenoza traheala subglotica;
• mononevrita multiplex sau alte neuropatii periferice;
• masa retroorbitara;
• boli inflamatorii de cauza neprecizata5.
Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese) 2.
Specimen recoltat - sange venos2.
Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator2.
Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare 2.
Volum proba – minim 2 mL ser2.
Cauze de respingere a probei - ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian 2.
Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 4°C; timp mai indelungat la -20°C3.
Metoda – imunofluorescenta indirecta2.
Valori de referinta, comunicarea rezultatelor si interpretarea rezultatelor
<1/10: Negativ
 In cazul unui rezultat pozitiv se va comunica titrul precum si aspectul c-ANCA, p-ANCA sau x-ANCA.
Vor fi exclusi obligatoriu anticorpii ANA care mimeaza p-ANCA.
Aspectele c-ANCA si p-ANCA trebuie confirmate prin teste imunoenzimatice 2.
Limite si interferente
Testul ANCA nu trebuie utilizat ca test screening la persoane asimptomatice.
Deciziile clinice nu trebuie sa se bazeze pe un singur rezultat ANCA pozitiv.
In afara afectiunilor mentionate mai sus anticorpii ANCA mai pot fi intalniti si in alte conditii clinice, cum ar fi:
lupus eritematos sistemic, lupus eritematos indus medicamentos, sindrom Sjögren, polimiozita si
dermatomiozita, artrita reumatoida, artrita reactiva, sindrom antifosfolipidic, sindroame mielodisplazice,
infectia HIV, endocardita bacteriana subacuta, cromomicoza, ameobiaza invaziva, fibroza chistica, precum si in
anumite neoplazii4

Anticorpi antinucleari (imunofluorescenta)

55 Lei

Informatii generale si recomandari pentru efectuarea testului

Identificarea anticorpilor antinucleari (ANA) reprezinta o parte importanta a imunologiei clinice.
Anticorpii antinucleari sunt anticorpi indreptati impotriva antigenelor nucleare si au fost descrisi intr-o
multitudine de afectiuni autoimune sistemice si organ-specifice.
Testul ANA isi are originea in fenomenul L.E care a fost evidentiat pentru prima oara in 1948 de catre
Haargraves, Richmond si Morton. Totusi, determinarea celulelor lupice s-a dovedit a fi un test putin sensibil si
dificil de standardizat.
In 1950, Coons si Kaplan au utilizat anticorpi specifici marcati cu fluoresceina pentru identificarea antigenelor
tisulare. In 1957, Holborow, Weir si Johnson au folosit pentru prima data tehnica imunofluorescentei pentru a
demonstra ca serul pacientilor LE pozitivi contine anticorpi care produc o fluorescenta nucleara omogena pe
tesuturile umane. In 1961, Beck a descris si alte tipuri de fluorescenta nucleara in serul pacientilor cu diferite
afectiuni reumatice utilizand sectiuni de ficat de sobolan.
Substratul ANA traditional a fost reprezentat mult timp de sectiuni de ficat, rinichi sau stomac de sobolan.
Inlocuirea acestui substrat a fost realizata cu mult succes de linia celulara Hep-2 (human epithelial type 2 cells)
izolata initial de la un carcinom laringian uman, aceasta permitand recunoasterea a peste 30 pattern-uri
nucleare si citoplasmatice determinate de peste 100 autoanticorpi diferiti. Avantajele utilizarii celulelor Hep-2
fata de substratul animal sunt:
 sensibilitate mai mare care permite identificarea mai multor pattern-uri;
 originea umana asigura o mai buna specificitate decat cea animala;
 nucleii celulelor sunt mai mari, iar detaliile nucleare pot fi evidentiate mai bine;
 dispunerea celulelor in monostrat faciliteaza o vizualizare buna a nucleilor;
 distributia antigenului este uniforma;
 rata diviziunii celulare este crescuta astfel incat antigenele exprimate predominant in timpul mitozei
sunt usor de localizat (de exemplu, pattern-ul de tip centromer).
Astfel, substratul Hep-2 permite recunoasterea autoanticorpilor indreptati impotriva antigenelor din toate
etapele mitozei (profaza, metafaza, anafaza, telofaza), ceea ce nu este posibil utilizand substratul animal 1.
Cele mai importante aspecte nucleare descrise la examenul prin imunofluorescenta indirecta sunt:
 ASPECT NUCLEAR OMOGEN: fluorescenta omogena difuza a intregului nucleu in interfaza celulara;
intensitatea fluorescentei este mai pronuntata in regiunea cromozomiala la celulele in mitoza; citoplasma este
negativa. Apare asociat in principal cu lupusul eritematos sistemic (LES) comun si lupusul indus
medicamentos, dar mai poate sa apara in artrita reumatoida, artrita cronica juvenila si scleroza sistemica
(alaturi de aspectul fin patat). Antigenele implicate sunt: ADN dublu catenar (dsDNA), histone, Ku.
 ASPECTUL NUCLEAR OMOGEN INELAR: similar cu cel nuclear omogen, dar cu cresterea intensitatii
fluorescentei marginale nucleare in interfaza celulara; citoplasma este negativa. Este un aspect intalnit comun
in LES, mai ales in forma activa. Antigenul este reprezentat de dsDNA.
 ASPECT MATRICE NUCLEARA: fluorescenta patata ce da nastere unei retele nucleare spongioase in
interfaza celulara. Acest aspect se poate intalni in LES, boala mixta de tesut conjuctiv sau in boli cronice
reumatice. Antigenele implicate sunt proteine ribonucleare heterogene (hnRNP).
 ASPECT PATAT FIN: fluorescenta nucleara patata cu aspect fin si distributie uniforma in interfaza
celulara. Apare in LES, sindromul Sjögren, sclerodermie, miozita si boala mixta de tesut conjunctiv. Antigenele
sunt reprezentate de SS-A, SS-B, Ku, Ki si Mi-2.
 ASPECT PATAT GROSIER: fluorescenta nucleara patata cu aspect grosier in interfaza celulara. Apare in
LES, boala mixta de tesut conjunctiv, sindroame overlap, sindrom Raynaud si psoriazis. Sunt implicate
urmatoarele antigene: U1-snRNP sau Sm (proteine ribonucleare mici).
 ASPECT DE TIP CENTROMER: fluorescenta nucleara patata cu aspect fin in interfaza celulara; in cursul
mitozei fluorescenta este prezenta la nivelul cromozomilor. Apare in principal in sindromul CREST.
 ASPECT NUCLEOLAR OMOGEN: fluorescenta omogena a nucleolilor. Apare in sclerodermie, miozita,
sindrom overlap miozita-sclerodermie. Antigenul este constituit din complexul PM-Scl cu rol in biosinteza
ribozomilor.
 ASPECT NUCLEOLAR PATAT: fluorescenta patata a nuclelolilor; in cursul mitozei fluorescenta este
prezenta la nivelul cromozomilor, cu doua aspecte posibile: omogen (antigenul este reprezentat de Scl-70 –
ADN topoizomeraza I) si punctat (antigenele implicate sunt ARN polimeraza I si NOR-90); este asociat cu
sclerodermia.
 ASPECT NUCLEOLAR ”IN GRAMEZI” (”CLUMPY”): fluorescenta nucleolara in blocuri. Este intalnit in
sclerodermie; antigenul implicat este fibrilarina – o proteina alcalina asociata cu ribonucleoproteina nucleolara
U3-snRNPs.
 ASPECT DE PUNCTE NUCLEARE: fluorescenta punctiforma (aproximativ 10 puncte/nucleu) care apare
in nucleoplasma separat de nucleoli. Se asociaza clinic cu: ciroza biliara primitiva, sindromul Sjögren, ocazional
LES. Antigenele implicate includ complexe de multiproteine (Sp-100), cu rol insuficient cunoscut.
 ASPECT CENTRIOL/CENTROZOM: fluorescenta sub forma de spoturi fine la cei 2 poli ce corespund
fusului mitotic. Apare in sindromul Raynaud, mai rar in sclerodermie, sindromul Sjögren sau sindromul CREST.
Antigenul este reprezentat de centrozom = sistem de microtubuli ce are rol in formarea fusului mitotic.
 ASPECT MEMBRANA NUCLEARA: fluorescenta fina inelara a membranei nucleare cu scaderea
intensitatii fluorescentei in nucleoplasma. Apare in hepatita cronica asociata sau nu cu vasculita,
trombocitopenie si LES. Antigenele implicate sunt polipeptide care furnizeaza situsuri de ancorare pentru
cromozomi in interfaza celulara: laminine A, B1, B2, C.
 ASPECT PCNA (PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN): fluorescenta patata variabila (prezenta
doar in unele celule) in interfaza celulara. Apare la 3-6% dintre pacientii cu LES. Ca antigen este implicata
ciclina, cu rol in replicarea si repararea ADN-ului.
In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile nucleare descrise:
In concluzie, pattern-ul fluorescentei nucleare reflecta specificitatea pentru diferite afectiuni. Astfel,
imunofluorescenta indirecta permite diagnosticul primar in cazuri clinice incerte, monitorizarea tratamentului
(prin titrul ANA) si poate furniza informatii decisive pentru investigatiile ulterioare 1;2;5.
Pregatire pacient - à jeun (pe nemancate) sau postprandial (dupa mese) 3.
Specimen recoltat - sange venos3.
Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant cu/fara gel separator3.
Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul prin centrifugare 3.
Volum proba – minim 0.5 mL ser3.
Cauze de respingere a probei - ser intens hemolizat, lipemic sau puternic contaminat bacterian 3.
Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la 4°C; timp mai indelungat la -20 °C3.
Metoda – imunofluorescenta indirecta3.
Valori de referinta si interpretarea rezultatelor
<1/100: Negativ3.
Rezultatele se exprima sub forma unui titru (dilutia pana la care poate fi detectata fluorescenta).
In cazul unui rezultat pozitiv alaturi de titru este mentionat si aspectul obtinut in imunofluorescenta.
Aproximativ 98% dintre pacientii cu LES activ vor prezenta un rezultat pozitiv la screening-ul ANA prin
imunofluorescenta. Cu toate acestea a fost identificat un grup de pacienti cu boala lupica “ANA negativi”.
Aspectele nuclear omogen si/sau nuclear omogen inelar se coreleaza cu LES, activitatea bolii si cu nefrita
lupica.
Aspectul de tip centromer se coreleaza in mod tipic cu sindromul CREST (confirmare prin determinare
cantitativa imunoenzimatica).
Aspectele de tip nuclear patat se asociaza cu prezenta anticorpilor fata de antigenele nucleare extractibile
(ENA): U1-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 si Jo-14.
In unele cazuri, pe substratul Hep-2 se pot obtine diverse pattern-uri de fluorescenta citoplasmatica:
-patat fin, cu pete fluorescente dispersate, de dimensiuni mici, in majoritatea cazurilor pe un fond omogen sau
patat fin dens; antigenele sunt reprezentate de aminoacil-t-ARN-sintetaze, in special Jo-1; se asociaza cu
polimiozita/dermatomiozita;
-patat fin dens, cu fluorescenta granulara difuza, aproape omogena, in intreaga citoplasma; antigenele includ
rRNP – fosfoproteine ribozomale; este intalnit la pacientii cu LES care prezinta manifestari SNC;
-polar, cu fluorescenta perinucleara grosiera, cu granule dispuse in gramezi la un pol al celulei ce corespund
lamelelor aparatului Golgi; se intalneste rareori in LES, in sindromul Sjögren, boala mixta de tesut conjunctiv,
granulomatoza Wegener, infectii virale (EBV, HIV);
-reticular grosier, cu fluorescenta difuza reticulara si granulara grosiera ce cuprinde aproape intreaga
citoplasma; antigenele sunt proteine din membrana interna a mitocondriilor (in special M2); se asociaza cu
ciroza biliara primitiva;
-reticular fin, cu fluorescenta difuza reticulara si granulara fina corespunzatoare reticulului endoplasmatic; se
asociaza cu afectiuni hepatice cronice;
-fibrilar, cu o fluorescenta lineara a fibrelor de stres din citoschelet; antigenele implicate sunt reprezentate de
actina si miozina; se intalneste in hepatita autoimuna, ciroza biliara primitiva, boala mixta de tesut conjunctiv;
-segmentar, cu fluorescenta unor segmente mici de fibre; antigenele sunt α-actinina, vinculina, tropomiozina;
se asociaza cu miastenia gravis, boala Crohn, colita ulceroasa.
In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile citoplasmatice descrise:

In toate aceste cazuri este necesara confirmarea rezultatului pe substraturi specifice sau determinarea prin
metode imunoenzimatice2.
Limite si interferente
Persoanele peste 80 ani prezinta o incidenta crescuta (50%) de ANA in titruri joase 4.