Apoptoza.

Implicatii in patologia maligna

DANIELA NICOLETA PETRUSCA*, OLIVIA MIHAELA POPA**, L. MESTER***
*Centrul de Imunologie, Institutul de Virusologie “Stefan S. Nicolau”, Bucuresti
**Institutul de Genetica al Universitatii din Bucuresti, Aleea Portocalelor Nr. 1-3, Sector 6,
Bucuresti
***Universitatea din Bucuresti, Facultatea de Biologie
1.Introducere
Moartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala
a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie
inlaturate din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale si
functionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate la aproape
toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si maturarii. Pe parcursul dezvoltarii
embrionare modelarea celulara specifica si organogeneza sunt asigurate de un program
spatiotemporal definit genetic de proliferare si moarte celulara. In tesuturile adulte, moartea
celulara fiziologica apare de asemenea proeminent in interiorul tesuturilor ciclic stimulate sau
dependente hormonal, cum sunt endometrul, prostata si glanda mamara, dar si in turnoverul
.stady-state. al multor alte tesuturi. Moartea selectiva a celulelor este fundamentala pentru
dezvoltarea, reglarea si functionarea sistemului imun, incluzand eliminarea timocitelor autoreactive,
selectia negativa a limfocitelor T si B si distrugerea celulelor realizata de limfocitele
T citotoxice. Celulele ce au suferit deteriorari genetice ireparabile sunt de asemenea detectate
de procese endogene, probabil limitandu-se astfel diseminarea leziunilor genetice potential
nocive. Limfocitele ce invadeaza tesuturi privilegiate din punct de vedere imunologic sunt
rapid eliminate, astfel protejandu-se regiunile sensibile de o deteriorare produsa printr-un
raspuns inflamator (1). Conceptul unificator al tuturor acestor circumstante diverse este acela
ca procesul de moarte celulara este mediat de un set comun de evenimente si se desfasoara pe
cai biochimice similare conducand la o dispunere stereotipa a modificarilor structurale.
Aceasta moarte celulara este numita apoptoza.
Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin care
celulele sistematic isi inactiveaza, isi dezasambleza si isi degradeaza propriile componente
structurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces. Acest proces poate fi activat
intracelular printr-un program de dezvoltare definit genetic sau extracelular prin intermediul
proteinelor endogene, citokinelor si hormonilor ca si de componente xenobiotice, radiatii,
stresul oxidativ si hipoxia. Abilitatea unei celule de a intra in apoptoza ca raspuns la un
semnal de .moarte. depinde de statusul sau proliferativ, pozitia ciclului celular si de expresia
controlata a genelor care promoveaza, inhiba si afecteaza programul de moarte. Reglarea
stricta a acestor parametri modulatori ai mortii trebuie mentinuta pentru asigurarea contextului
fiziologic propice aparitiei apoptozei. Disfunctiile ce apar in oricare dintre punctele caii de
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
158
moarte programata, pot duce la un proces apoptotic eronat determinand astfel la exprimarea
unor conditii fiziopatologice.
Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul sau de a controla
sistemele biologice.
Moartea celulara a fost considerata la inceput un proces haotic. Totusi, asa cum o
celula isi poate echilibra metabolismul, penduland intre anabolic si catabolic, tot astfel un
organism multicelular trebuie sa echilibreze ratele de proliferare celulara si de moarte celulara
pentru mentinerea homeostaziei. De asemenea, un organism trebuie sa indeparteze celulele
senescente, deteriorate sau anormale care ar putea sa interfere cu buna functionare a unui
organ sau s-ar putea transforma malign. Ca urmare, alterarile survenite in domeniul reglarii
mortii celulare ar putea contribui la patogeneza bolilor degenerative si neoplazice. Desi
moartea celulara .fiziologica. se cunoaste de decenii, interesul pentru aceasta problema a fost
reactualizat in 1972, cand Kerr, Wyllie si Currie au descris in detaliu modificarile
ultrastructurale caracteristice celulelor muribunde si au propus termenul de apoptoza pentru
descrierea acestui proces (2). Ei au evidentiat faptul ca moartea celulara fiziologica nu este un
proces randomic, ci are trasaturi morfologice distincte. De obicei apoptoza afecteaza celule
individuale si, odata initiata, se propaga rapid.Ingestia celulelor apoptotice de catre macrofage nu induce eliberarea
enzimelorsau a oxigenului singlet care e toxic. Fragmentarea celulelor are loc fara scurgerea
continutului celular in spatiul extracelular, iar indepartarea celulelor apoptotice nu provoaca
un raspuns inflamator. Absenta inflamatiei reprezinta o trasatura cruciala permitandu-se astfel
moartea celulei fara deteriorarea celulelor adiacente.
2. Apoptoza versus necroza
Moartea celulara poate fi accidentala sau programata intr-un organism multicelular.
Dovezile sprijina ipoteza existentei unui .program de sinucidere. inerent in celulele
vertebratelor care este activat atunci cand moartea celulei este dorita pentru binele restului
comunitatii celulare.In tesuturile vertebratelor s-au descris doua modele de moarte celulara cu morfologie
distincta: apoptoza si necroza (3, 4), insa mecanismele lor la nivel molecular nu sunt inca
complet intelese.NECROZA poate fi descrisa ca si colapsul metabolic celular si apare cand celula nu-si
mai poate mentine homeostazia ionica. Pe masura ce nivelurile de ATP se epuizeaza si
gradientul ionic transmembranar se disipa, celulele se umfla si organitele intracelulare se
dilata. Initial se observa inmuguriri reversibile ale membranei, modificari timpurii in
conformatia si functia mitocondriilor si celula devine rapid incapabila de a mentine
homeostazia. Depasind un prag, procesul devinde ireversibil. Membrana celulara poate deveni
situsul major al alterarilor pierzandu-si astfel capacitatea de reglare a presiunii osmotice,
celula se umfla si crapa. Deteriorarile membranelor interne permit eliberarea enzimelor
lizozomale, continutul celulei este imprastiat in spatiul tisular inconjurator si provoaca un
raspuns inflamator nespecific.
Necroza este indusa tipic de modificari extreme in mediul inconjurator al celulei, ce
determina leziuni severe si bruste, provocate de exemplu de ischemie, hipertermie mentinuta
sau traume fizice sau chimice. Se presupune ca necroza nu este influentata genetic (5),
(figura 1).

DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER

159
Figura 1. Ilustrarea secventei de modificari ultrastructurale care au loc in apoptoza (2-6) si necroza (7
si 8). (1)Celula normala. Apoptoza timpurie (2) se caracterizeaza prin compactarea si marginalizarea cromatinei,
condensarea citoplasmei si plierea membranelor, nucleara si plasmatica (3). In ultima etapa, nucleul se
fragmenteaza si protuberantele formate pe suprafata celulei se separa pentru a forma corpii apoptotici, care (4),
sunt fagocitati de celulele vecine si (5 si 6) degradate in lizozomi (7). Necroza este asociata cu gruparea
neregulata a cromatinei, umflarea organitelor si distrugerea focala a membranelor (8). Apoi membranele se
dezintegreaza dar, in general, celula isi mentine intreaga conformatie pana la indepartarea ei de catre fagocitele
mononucleare.
APOPTOZA este o forma de moarte celulara in care procesul este mult mai subtil.
Este adesea echivalata cu moartea celulara programata, dar este bine sa mentinem cele doua
concepte distincte - cel morfologic si cel escatologic. Apoptoza se refera la o serie de
modificari morfologice pe parcursul procesului de moarte celulara, modificari diferite de cele
observate in necroza, fiind asociata cu procesul normal de reglare a tesuturilor (fig. 1). La
vertebrate, moartea celulara este acceptata ca un proces obisnuit si chiar accentuat previzibil,
dar .programarea. ei nu se face in sensul acceptat la nevertebrate, ca o moarte a celulelor
individuale, care in anumite cazuri poate fi apreciata, cu mare acuratete, ca fiind programata
(6, 7). In ultima vreme suntem fortati sa acceptam observatia, aparent paradoxala, ca moartea
celulara este atat programata cat si stohastica. De exemplu, pe parcursul dezvoltarii
populatiilor de celule B, aproximativ 95 % din celule vor muri dintr-unul dintr-o varietate de
motive (rearanjament genic imperfect sau absenta stimularii) dar este imposibil de prevazut
dinainte care dintre ele se va produce.
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
160
Apoptoza apare in celule individuale dispersate, nu in grupuri de celule invecinate, asa
cum se intampla in necroza.
Se pare ca apoptoza prezinta cea mai comuna morfologie atunci cand moartea celulara
este determinata fiziologic. Referindu-ne la mamifere, exemplele includ moartea celulelor cu
perioada de injumatatire scurta (neutrofile); eliminarea celulelor T autoreactive; involutia
celulelor lipsite de factorii de crestere necesari; moartea morfologica a celulelor pe parcursul
evolutiei embrionare si postembrionare timpurii; si omorarea celulelor care servesc drept
tinte celulelor T, celulelor natural ucigase (NK), sau mecanisme citotoxice mediate celular
dependente de anticorpi.
Motivul pentru care celulele trebuie sa moara este diferit de la un tip celular la altul la
fel si mecanismul de declansare. Deseori semnalul de sinucidere provine din mediul
inconjurator, ca in expunerea la sau retragerea dintr-un mediu cu hormoni sau factori de
crestere. Acest aspect este incitant din punct de vedere conceptual, atata vreme cat se traduce
prin faptul ca soarta unei celule este dependenta de activitatea alteia; chiar daca moartea este
programata, locusul programului este in afara celulei care trebuie sa moara. In alte cazuri, de
exemplu turnoverul neutrofilelor, se pare ca celula are un ceas intern autonom care ar controla
programul de moarte a celulei (adevaratul program de moarte celulara autonom a fost
identificat la nematode si genele ce controleaza acest proces au fost elucidate (8). Caile de
activare a apoptozei vor fi diferite in diferite celule, dar mecanismul de moarte in sine va fi
mereu acelasi, ceea ce inseamna ca exista o cale finala comuna. Este foarte important ca in
studiul apoptozei sa incercam sa facem distinctia dintre procesele care sunt specifice celulei
de cele care sunt specifice mortii. Se pare ca exista multe mecanisme declansatoare ale cailor
de sinucidere, chiar si intr-un singur tip de celula. Nu toate acestea vor fi recunoscute imediat
ca fiind .programate.. De exemplu, pentru a activa calea apoptotica, timocitele pot fi
semnalizate de catre glucocorticoizi sau de o cross-linkare a receptorului pentru antigen, in
acest caz, ambii stimuli fiind considerati fiziologici. Dar, timocitele vor suferi un proces
apoptotic identic dupa expunerea la o doza mica de radiatii ionizante sau la o otrava.
Deoarece nici unul dintre acesti agenti nu este fiziologic, in acest caz moartea celulelor nu
poate fi strict definita ca fiind programata. Totusi definitia poate fi largita in sensul ca in
anumite celule, cand sunt deteriorate nespecific, se poate activa fiziologic o .moarte
programata.. Aceasta presupune ca deteriorarea sa nu fie foarte severa pentru ca programul sa
poata fi exprimat: daca timocitele sunt mentinute la 43ºC vor muri prin necroza, dar daca se
revine, suficient de rapid, la o temperatura de 37ºC, vor muri prin apoptoza. S-a sugerat ca, ar
fi prea periculos pentru limfocite sa incerce repararea unor astfel de tipuri de leziuni, atata
vreme cat o reparare imperfecta ar putea duce la instalarea autoimunitatii sau a leucemiei in
astfel de cazuri celulele activandu-si mecanismul apoptotic.
3. Fazele procesului apoptotic
Controlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului
celular este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel
putin 3 optiuni posibile (fig.2).
Celula poate fi:
1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de
apoptoza (celula aflata in faza G0);
2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0→G1→S→G2→mitoza)
3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata
(G0→D1→F→D2→fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata
(necroza) (figura 2).

DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER

161
Figura 2. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1 defineste
perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducerea
fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptotici.
Celulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza a
ciclului celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de
crestere ce regleaza progresia in interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt
independent determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei in cauza. Astfel,
acelasi factor de crestere (ex: factorul transformant de crestere . β1) poate avea efecte
agoniste sau antagoniste in cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al
proliferarii celulare in celulele mezemhimale sau inductor al arestului in G0 sau progresia prin
fazele apoptozei pentru celulele epiteliale).
Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:
- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil
angajata pe calea mortii;
- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;
- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.
Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru
prima data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punct
de vedere al mecanismului.
4. Morfologia apoptozei
Pe parcursul fazei de executie, apar modificari morfologice si biochimice coordonate
in interiorul nucleului, citoplasmei, organitelor si membranei plasmatice. Modificarile
morfologice care se observa cel mai usor sunt cele care apar in interiorul nucleului. Cromatina
condenseaza si formeaza agregate de-a lungul periferiei nucleare relevand un model
conformational semilunar. Caracterizarea morfologica a cromatinei demonstreaza o degradare
ordonata a ADN-ului de catre o nucleaza endogena dependenta de cation (9), intai in
fragmente mari de 30-50 kilobaze (10) pana la fragmente nucleozomale de 180-200 perechi
de baze (11). Totusi, clivarea cromatinei la fragmente nucleozomale nu are loc in toate
tipurile celulare si poate fi inhibata fara a bloca celelalte modificari ale apoptozei (12,13).
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
162
Odata cu condensarea cromatinei este alterata ultrastructura nucleara. Lamina nucleara si
reteaua de filamente intermediare care mentine integritatea anvelopei nucleare si distributia
porilor nucleari sunt clivate proteolitic (14-16). Astfel, distrugerea structurii retelei nucleare ar
putea permite alaturarea porilor nucleari (17) si faramitarea nucleului in fragmente ce contin
cromatina, care, majoritatea mentin vestigii ale membranei nucleare. Celelalte organite
citoplasmatice raman intacte din punct de vedere structural cu toate ca difunctiile
mitocondriale sunt asociate cu apoptoza (18) (figura 3).
Modificarile nucleare sunt precedate de reducerea potentialului transmembranar
mitocondrial, necuplarea transportului de electroni de la sinteza ATP-ului si cresterea
generarii de specii reactive de oxigen. In citoplasma apare cross-linkarea de proteine prin
actiunea transglutaminazelor (19), filamentele citoscheletale se agrega in formatiuni paralele
si reticulul endoplasmic se dilata si fuzioneaza cu membrana plasmatica creand cratere in
forma de sac la nivelul fuziunii. Se poate specula faptul ca celula sufera o alterare profunda a
citoscheletului. Cu toate ca, pana in momentul de fata, aceasta problema nu a fost studiata in
detaliu, exista exemple in care distrugerea citoscheletului duce la angajarea celulei pe calea
apoptotica, in timp ce, stabilizarea citoscheletului inhiba apoptoza. In apoptoza, membrana
celulara se umfla si se cuteaza intr-o masura mult mai mare decat in necroza, fenomenul a fost
numit zeioza. Integritatea structurala a membranei este ulterior compromisa prin pierderea
asimetriei fosfolipidice, a microvililor si a jonctiunilor intercelulare. Celula se sfericizeaza, se
indeparteaza de vecinii sai si se contracta dramatic si expulzeaza protuberante care se separa
in .corpi apoptotici. inveliti in membrana. In interiorul tesuturilor, celulele apoptotice si
corpii apoptotici sunt recunoscuti si fagocitati rapid de catre celulele vecine sau macrofage.

Figura 3. Stadiile apoptozei intr-un limfocit. Aceste stadii sunt observate mai bine in culturi izolate
atata vreme cat in vivo ar interveni fagocitoza: (a) Celula normala are o citoplasma dispersata si cromatina
nucleara heterogena. Volumul celulei e de aproximativ 90 fL. (b) Celula a pierdut o parte din volum si organitele
citoplasmatice sunt strans impachetate, se observa ingramadiri ale cromatinei. In acest stadiu sunt prezente
modificarile membranare care duc la fagocitoza. (c) Celula etaleaza zeioza. (d) Colapsul cromatinei cu aranjarea
ei in forma de semiluna de-a lungul anvelopei nucleare. Volumul celular este acum de 70 fL. (e) Nucleul are
acum aspectul unei gauri negre. (f) Nucleul se fragmenteaza in sfere, iar membrana se cuteaza vormand vezicule.
(g) Fragmentele celulare continute in corpii apoptotici care, pentru o vreme, continua sa excluda colorantul vital.
Recunoasterea celulelor apoptotice de catre fagocite poate implica interactii ale
lectinelor macrofagelor endogene cu resturi zaharidice N-acetil specifice exprimate pe
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
163
suprafata celulelor apoptotice, interactiile specific mediate de receptori cu fosfatidilserina din
stratul exterior al membranei plasmatice si interactiile trombospondina/receptori de suprafata
celulara, ce contin resturi incomplet caracterizate, de pe suprafata celulelor apoptotice (20).
Exista evidente ce sugereaza ca mecanismul de recunoastere poate fi diferit in functie de
populatia de fagocite. Semnificativ pentru strategia centrala a acestui tip de moarte celulara
este clerance-ul rapid si eficient al resturilor apoptotice de catre fagocitele vecine, amatoare
sau profesioniste, deoarece previne raspunsul inflamator care, altminteri, ar urma calea
distrugerii celulare si deversarea proteinelor intracelulare si a acizilor nucleici in spatiul
extracelular.
Odata ce faza de executie a apoptozei este activata, intregul proces demareaza rapid si
este complet terminat in cateva ore (21). Durata acestei faze este relativ invariabil in raport cu
tipul celular si stimulul apoptotic sugerand ca stadiul final al apoptozei trece printr-o cale
comuna. Totusi, stadiul de angajare, timpul de la receptarea stimulului apoptotic pana la
initierea fazei ireversibile de executie este extrem de variabil si depinde de tipul celular, de
stimulul apoptotic, de situarea in cadrul ciclului celular si de expresia diversilor factori
modulatori ai mortii. Multi factori care influenteaza angajarea sau susceptibilitatea celulara la
apoptoza sunt implicati direct in receptia si transmiterea semnalului apoptotic. Acesti factori
reglatori sunt frecvent selectati pentru a bloca procesul pe parcursul transformarii neoplazice
sau dezvoltarii rezistentei la medicamente si sunt subiectul modificarii virale.
Perioada de fragmentare a ADN (figura 2, faza F) poate fi utilizata pentru dividerea
in serii temporale a evenimentelor implicate in apoptoza mai mult decat perioada sintezei de
ADN (figura 2, faza S) ce este utilizata pentru impartirea ciclului celular proliferativ (22). Pe
parcursul fazei D1 apoptotice, celula sufera o reprogramare genetica, proces pe parcursul
caruia gene care erau normal exprimate acum sunt supresate si invers (23-26). Aceste
modificari epigenetice au ca rezultat fragmentarea dublu catenara a ADN pe parcursul fazei F.
Pe parcursul acestei faze F morfologia nucleara se schimba (marginalizarea nucleara a
cromatinei urmata de condensarea nucleara si eventual de fragmentarea nucleului insusi), cu
toate ca membranele plasmatica si lizozomala sunt inca intacte si mitocondria inca
functionala. Pe parcursul urmatoarei faze, portiunea D2, apare inmugurirea membranei si
eventual fragmentarea celulara in clustere de corpi apoptotici inveliti in membrana.
5. Biochimia apoptozei
Celulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil, iar electrono-micrografiile
evidentiaza o citoplasma extrem de condensata cu organite ce par a fi normale. Cea mai
plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare
imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni
specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intr-un mod adecvat. A fost
observata umflarea cisternelor reticului endoplasmic.
Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de
degradarea lor, dar sincronizarea acestor evenimente in raport cu modificarile morfologice nu
este inca bine caracterizata. Totusi, initial s-a crezut ca tranzitia de la normal la contractarea
apoptotica se realizeaza atat de rapid incat nu poate fi observata o stare intermediara,
citometria in flux poate ajuta la caracterizarea modificarii si in combinatie cu sortarea celulara
poate inlesni o patrundere mai profunda in ordinea evenimentelor.
Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moarte
celulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ce
produce necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula
initial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
164
stimuli vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabila de
evenimente metabolice ce au loc in cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe
tipuri celulare apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul, poate
activa latent enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul apoptozei. Aceste
enzime includ o endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza invariabil ADN si o
transglutaminaza care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente
(calpaina) degradeaza citoscheletul (figura 4) (27-29).
In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, reclama
sinteza activa a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitele
mature, agentii care inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei;
din contra, in neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi
amplifica apoptoza. Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelor
contin proteine reglatoare care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-un
tip particular celular, comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate
determina daca sistarea sintezei de ARN si proteice previne sau induce apoptoza.

Figura 4. Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste mRNA pentru β-tubulina inainte de
aparitia modificarilor morfologice si a clivajului DNA. Intr-o etapa ulterioara, apar si in
citoplasma cantitati crescute de β -tubulina. Probabil ca, genele pentru β-tubulina sunt
degradate impreuna cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activa (30).
Agentii care interfera cu polimerizarea actinei, cum ar fi citocalasina B, s-a aratat ca previn
inmugurirea celulara ce duce la formarea corpilor apoptotici fara a bloca fragmentarea
nucleului sau clivajul DNA (31).
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
165
5.1. Activitatea endonucleazica, structura cromatinei si degradarea ADN in apoptoza
Nucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.
Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie
(figura 5), dar au fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor fluorescenti
cum sunt acridin oranjul sau Hoechst 33342. Modelul modificarilor difera de la un tip celular
la altul dar, in general, nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteaza
si, in final se leaga strans de anvelopa nucleara.
Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitati
regulate ce formeaza o .scara. ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la
nivelul regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un
milion de astfel de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are loc
sistarea transcriptiei (32).
In ultimii ani a existat o controversa cu privire la dimensiunile fragmentelor de
ADN, produse pe parcursul apoptozei, responsabile de angajamentul ireversibil pe calea
mortii celulare.
Figura 5. Modificarile structurale ale celulei pe parcursul apoptozei. Imaginea superioara reprezinta o celula
normala. Imaginea inferioara reprezinta o celula in cursul procesului de apoptoza; sagetile indica fragmente de
cromatina condensata.
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
166
Exista o serie de rapoarte ce precizeaza ca atunci cand celula intra in apoptoza ADNul
genomic este degradat in fragmente mici nucleozomale (repetari de cate 200 pb). Totusi au
existat rapoarte ce sustineau ca celulele pot intra in apoptoza pe criterii morfologice fara
producerea .scarii. de ADN nucleozomal (33-36, 37).
O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala a
ADN in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu
(Ca2+) (11, 38). De asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub
diferite forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular
(Cai) (39-43) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor de
aproximativ 23 kD (44, 45). Celulele raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului in
interiorul unei organite intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica. Astfel
de transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de proteinele
ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+ in
afara celulei un astfel de transport ar putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau
transportat in afara celulei (46).
In modelul propus de Filipski in 1990 (figura 6) este privit ca fiind ordonat in bucle
de cromatina bine stabilizate de cate 50 Kb, aceste bucle sunt infasurate in structuri
hexamerice numite rozete si continand aproximativ 300 Kb de ADN. Rozetele formeaza
subunitatea de baza a cromatidei rasucite.
Au fost studiate activitatile endonucleolitice asociate cu fragmentarea ADN cu masa
moleculara mare cu ajutorul tehnicii PFGE (pulsed field gradient gel electrophoresis). S-a
observat, in toate tipurile de celule studiate, o activitate dependenta de Mg2+ capabila de
producerea fragmentelor de la 50 Kb la 300 Kb, iar ionii de Ca au fost necesari pentru
fragmentarea ulterioara la oligonucleozomi (47-49). Aceaste experimente au sugerat ca ar
putea fi necesare doua enzime separate pentru fragmentarea completa a ADN pe parcursul
apoptozei. Totusi, utilizand chelatori ai Ca2+ intracelular (50) s-a observat ca pentru
degradarea ADN de masa moleculara mare sunt de asemenea necesare cantitati nanomolare
de calciu, complicand astfel explicatia fenomenului de clivare. De asemenea s-a observat ca
fragmentarea internucleozomala de ADN poate fi blocata de catre zinc, cunoscut inhibitor al
endonucleazelor Ca2+ si Mg2+ dependente (51, 52).
In continuare s-a demonstrat faptul ca fragmentarea internucleozomala a ADN in
apoptoza nu este randomica (53). Fragmentarea apare preferential in elementele repetate ale
ADN care au un rol in organizarea structurala a cromatinei.

Figura 6. Modelul Filipski et al. (1990) ce prezinta structura cromatinei. Sagetile corespund situsurilor de
clivare ale cromatinei.
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
167
De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta din regiunea
domeniilor .rozeta. si/sau .bucla. ce contin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazei
secundare de degradare. S-a aratat ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu este
alterata pe parcursul apoptozei (54). Aceasta indica faptul ca in conditiile unui nivel ridicat de
Ca2+ fragmentarea de ADN are loc in interiorul .buclelor. de ADN la un numar strict de loci
si nu e dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitatea
generala a regiunilor linker (55). Luand in considerare toate aceste date se poate spune ca
fragmentarea endogena a ADN pe parcursul apoptozei se produce in 3 etape (fig. 6). Prima
etapa incepe cu activarea unei endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de
atasare a matricei si citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari ale
cromozomului la matricea nucleara. Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficienta
pentru activitatea ei. Nu este nici o cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-au
evidentiat astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de
apoptoza. A doua etapa implica propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceasta
propagare are o dependenta de Ca2+ sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G
si toata cromatina este redusa la fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se cliveaza ADN
internucleozomal la regiunile linker din interiorul .buclelor. si genereaza .scara. ADN.
Aceasta clivare este relativ independenta de secventa (in termeni legati de situsurile ce leaga
nucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica. De asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza
(56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar putea realiza extensia finala a
fragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul. Toate aceste etape de degradare
sunt catalizate de o enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati DNaza-I like.
ADN-ul mitocondrial nu sufera fragmentare (57). Se presupune ca aceasta clivare a
ADN-ului nuclear, intr-o etapa timpurie a procesului, poate avea un rol protector prin evitarea
transferului de material genetic potential activ celulelor vecine dupa fagocitarea corpilor
apoptotici (58). Exista si tipuri celulare in care apoptoza tipica, care include modificarile
nucleare, este observata microscopic ca fiind lipsita de clivajul nucleozomilor ADN. Totusi,
in putinele sisteme in care a fost studiata, au fost observate anumite forme de deteriorare a
ADN (ruptura monocatenara extinsa, rare fragmentari dublu-catenare), necesare modificarilor
morfologice profunde. Nu exista un consens privind rolul pe care il joaca fragmentarea ADN
ce are loc inaintea mortii celulare. Desi transcriptia este oprita, ea insasi nu este atat de rapid
letala precum este apoptoza, ceea ce inseamna ca sunt implicate si alte procese. S-a constatat
faptul ca acidul aurin tricarboxilic, care inhiba nucleaza, este un ihibitor al tuturor aspectelor
legate de apoptoza; dar este incorect sa concluzionam ca, prin urmare, distrugera ADN este
pasul critic in procesul apoptozei, atata vreme cat aurinul inhiba multe alte reactii metabolice
celulare.
5.2. Modificarile membranei plasmatice
Fagocitarea rapida a corpilor apoptotici de catre celulele adiacente, cat timp
membranele lor celulare sunt intacte (pentru prevenirea inflamatiei si lezarii tesuturilor in care
se formeaza, in special cand procesul apare in conditii fiziologice) implica operarea unui
mecanism de recunoastere foarte specific si exista dovezi care sustin existenta mai multor
astfel de mecanisme (59).
In mod normal, fosfolipidele membranei plasmatice sunt distribuite asimetric. Lipidele
ce contin colina, cum ar fi fosfatidilcolina (FC) si sfingomielina sunt concentrate pe fata
externa a membranei plasmatice in timp ce aminofosfolipidele cum sunt fosfatidiletanolamina
(FEA) si fosfatidilserina (FS) abunda pe fata interna a membranei plasmatice. Dintre toate
fosfatidilserina (FS) este restrictata in majoritatea celulelor exclusiv la fata interna a
membranei (60). Pierderea asimetriei fosfolipidice si expunerea FS a fost prima oara
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
168
demonstrata pentru limfocite (61) dar aceasta descoperire a fost confirmata intr-o serie de
tipuri celulare (62).
Externalizarea FS este rapida sugerand mai degraba un transport facilitat decat o
difuzie pasiva a lipidelor prin bistrat. Aceasta activitate se presupune ca este mediata de o
proteina enzimatica activata de calciu, ATP independenta si nespecifica din punct de vedere al
fosfolipidelor transportate (63).
Din punct de vedere biologic, expunerea FS la suprafata e considerata a fi un ligand
pentru inlaturarea rapida a celulelor ce-l exprima. O alta consecinta biologica este legata de
faptul ca FS serveste drept cofactor pentru cascada de coagulare (64) domeniu in care datele
incep sa se contureze sugerand ca FS poate avea o serie de efecte anti-inflamatoare sau
imunosupresive.
6. Recunoasterea si inlaturarea celulelor apoptotice
Evenimentul final, comun pentru majoritatea celulelor apoptotice este reprezentat de
recunoasterea si indepartarea lor de catre fagocite. Celulele apoptotice sunt indepartate
inaintea lizei lor, acest eveniment sugerand ca ele exprima modificari specifice pe suprafata
ce semnalizeaza fagocitelor legarea si inglobarea lor. Aceste fagocite pot fi profesioniste
(macrofagele) sau amatoare (fibroblaste, celule epiteliale si celule musculare netede din
peretii vaselor de sange). Pana acum au fost descrisi mai multi receptori pe macrofage si alte
celule ce leaga celulele apoptotice si mediaza inglobarea lor. Acestia sunt reprezentati de
receptori lectin-like (65), receptorul pentru vitronectine αvβ3 (66), CD36, receptorul de
recunoastere al fosfatidilserinei (67), inca necaracterizat, CD14 (68) si receptori scavanger
(69). De curand, s-a demonstrat ca transportorul ABC1, de asemenea implicat in inglobarea
celulelor mamaliene apoptotice, mediaza transportul anionic fiind omolog genei ced-7
asociata cu fagocitoza corpilor apoptotici in C. elegans. Mecanismul prin care acesti receptori
mediaza fagocitoza celulelor apoptotice nu este cunoscut, iar liganzii acestor receptori nu sunt
inca bine caracterizati. Cu toate acestea comun multor celule ramane expunerea
fosfatidilserinei pe fata externa a membranei plasmatice, acest fosfolipid parand a fi
recunoscut intr-o maniera stereospecifica de catre subseturi de macrofage, de catre celule
melanoma, de celule musculare netede din peretii vaselor de sange si de celule Sertoli. In mod
normal, fosfolipidele de membrana sunt distribuite asimetric.
Macrofagele sunt .fagocite profesioniste. ce indeparteaza celulele si corpii apoptotici,
dar la acest proces pot participa si alte tipuri celulare, ca de exemplu celule epiteliale si
tumorale ce pot ingloba celule apoptotice vecine. In timpul inglobarii celulelor apoptotice,
macrofagele nu elibereaza agenti de tipul eicosanoizilor si citokinelor (70). Lipsa acestui
raspuns pare a fi determinata de mecanismul prin care celulele apoptotice sunt ingerate, dat
fiind ca celulele apoptotice, opsonizate pentru a putea fi preluate de receptorii Fc ai
macrofagelor, induc, de exemplu, eliberarea de tromboxan. Totusi, daca celulele apoptotice
nu sunt preluate de catre macrofage, ele se umfla si se dezintegreaza eliberandu-si continutul.
Daca ar avea loc un astfel de eveniment pe parcursul clearance-ului neutrofilelor din situsurile
inflamate, eliberarea continutului granulelor citoplasmatice ar avea consecinte nefaste. Mai
mult decat atat, evadarea nedorita a materialului nuclear din leucocitele moarte, poate fi de
asemenea periculoasa, nucleozomii eliberati din limfocitele apoptotice neingerate pot stimula
sinteza de ADN si imunoglobuline in limfocitele viabile (71). Prin urmare, este posibil ca
dezintegrarea limfocitelor apoptotice (presupus neingerate) sa constituie o sursa de ADN
nucleozomal circulant, observat de altfel la anumiti pacientii cu lupus sistemic eritematos,
contribuind la stimularea policlonala a celulelor B tipica pentru aceasta afectiune autoimuna si
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
169
tintind autoanticorpi catre paturile vasculare, cum ar fi glomerulii renali, in care componentele
nucleozomale circulante s-ar putea lega (72).
Exista mai multe mecanisme posibile de recunoastere a celulelor apoptotice de catre
fagocite si de asemenea, mai multe statusuri tinta etalate de celulele apoptotice.
Lectinele fagocitelor
Un mecanism obisnuit de interactie intercelulara il reprezinta legarea carbohidratilor
de la suprafata celulara a unei celule de lectinele altei celule, mecanism ce poate fi inhibat
specific de catre zaharuri simple recunoscute de lectine.
Unele din consecintele apoptozei sunt reprezentate de modificarile specifice ale
carbohidratilor de pe suprafata membranei celulare. Se presupune ca pierderea, printr-un
mecanism inca necunoscut, a unui reziduu terminal de acid sialic din lanturile laterale
glicoproteice ar putea sa expuna N-acetilglucozamina, N-acetilgalactozamina si galactoza,
mascate in conditii normale, restituind aceste reziduuri accesibilitatii interactiunii cu
presupusele lectine macrofagice (73) (figura 7).

Figura 7. Trei mecanisme prin intermediul carora fagocitele ar putea recunoaste celulele ce intra in apoptoza.
Receptori trombospondinici ai fagocitelor
Macrofagele umane derivate din monocite (HMDM) pot recunoaste neutrofile si
limfocite umane apoptotice prin intermediul receptorilor pentru vitronectina (VnR) αvβ3 si
receptorii scavenger din clasa B (CD36) (74). Acesti receptori se leaga de trombospondina ce
serveste drept punte intre macrofage si celulele apoptotice. Se pare ca aceasta recunoastere
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
170
este independenta de expunerea fosfatidilserinei le suprafata membranei celulei apoptotice si
pare a fi legata de fenotipul macrofagului si nu de tipul celulei apoptotice.
Receptorii pentru fosfatidilserina
Este clar ca macrofagele pot recunoaste fosfatidilserina intr-o maniera dependenta de
doza si de stereospecificitate, fapt ce sugereaza existenta receptorului pentru FS. Au fost
descrisi o serie de receptori cu rol in medierea recunoasterii FS si anume CD68, CD14,
anexinele, receptorii scavenger, beta2 glicoproteina I si gas-6. Exista si date care sugereaza
recunosterea FS de pe celulele apoptotice de catre fagocite .amatoare.. Nu se stie totusi daca
acesti receptori sunt specifici pentru FS. Cel mai probabil este ca mai multi receptori pot lega
FS, dar ramane inca sub semnul intrebarii daca ei pot recunoaste FS pe suprafata celulara.
Foarte multi ani semnificatia fagocitarii celulelor intacte .nedorite. a fost subestimata.
Pana nu demult, inglobarea celulelor apototice a fost considerata ca o inlaturare protectiva a
celulelor nedorite (75). Recent clearance-ului celulelor apoptotice i-a fost atribuit o noua
semnificatie. In functie de context, inlaturarea celulelor apoptotice de catre fagocite poate
supresa inflamatia, poate modula deletia directionata a celulelor gazda sau a parazitilor
invadanti de catre macrofage si poate regla raspunsul imun (figura 8).

Figura 8. Clearance-ul fagocitic al celulelor apoptotice.

7. Genetica apoptozei
In pofida numeroaselor progrese ce s-au realizat in cercetarea stiintifica este foarte
dificila identificarea moleculelor responsabile de apoptoza cu ajutorul demersurilor
biochimice si moleculare in sistemele mamaliene. Din fericire, nematodul Caenorhabditis
elegans reprezinta un model particular de studiu al reglarii genetice a apoptozei extrem de util
(76). Pe parcursul dezvoltarii embrionare si larvare a nematodului sunt eliminate 131 din 1090
celule in cadrul unui program foarte bine caracterizat, invariant din punct de vedere spatiotemporal.
Astfel, s-a identificat un numar mare de mutatii ce afecteaza stadii specifice ale
procesului apoptotic si genele corespunzatoare care au fost ordonate intr-o schema genetica
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
171
(figura 9). Aceste gene sunt implicate in decizia de a intra pe calea mortii, in executia acestei
cai, in inglobarea celulelor muribunde si in degradarea resturilor celulare din cadrul
inglobarii. Doua dintre aceste gene, ced-3 si ced-4 sunt necesare pentru toate formele de
apoptoza din cadrul dezvoltarii si se considera a codifica efectorii finali ai cai apoptotice. O
alta gena reglatoare cheie, ced-9, este necesara pentru supresia apoptozei in celulele
programate sa supravietuiasca (77). Aceasta gene codifica o proteina omologa cu familia Bcl-
2 din sistemul uman. Mai mult decat atat, expresia lui Bcl-2 poate inhiba apoptoza in
nematode si poate chiar substitui partial pierderea functiei lui Ced-9, ceea ce indica faptul ca
cel putin cateva componente ale caii apoptotice sunt conservate in evolutie. Mutatiile
survenite in 6 gene afecteaza inglobarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine nonprofesionale.
Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera
comparabila cu omologii lor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si
extensia citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1 activeaza atat in
celula muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide.
Ced-1 este analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza,
probabil, inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 (78).

Figura 9. Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce afecteaza
apoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii afecteaza doar un numar mic de gene.
Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea
mortii. Activitatea lui ced-3 si ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.
8. Semnificatia apoptozei in cancer si in terapia cancerului
Implicatiile apoptozei in patologie
Dereglarea procesului apoptotic, ce are ca rezultat o moarte celulara excesiva,
insuficienta sau prematura, constituie fundamentul initierii si progresiei multor maladii
umane. Se presupune ca o exacerbare a apoptozei celulelor neuronale ar putea contribui la
progresia si severitatea mai multor dereglari neurodegenerative ce includ maladia Alzheimer,
scleroza laterala amiotrofica, atrofia musculara spinala, maladia Parkinson, maladiile
neuromotorii si chiar atacul cerebral. Apoptoza excesiva la nivelul celulelor T circulante este
corelata cu sindromul imunodeficientei severe si SIDA, in vreme ce manifestarea insuficienta
a acestui proces constituie mecanismul de declansare al anumitor boli autoimune si
limfoproliferative. Inhibarea procesului apoptotic prin pierderea mutatiilor functionale in
genele activatoare ale mortii sau castigarea unor mutatii functionale in genele supresoare de
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
172
moarte este incriminata in transformarea neoplazica. Virusurile si-au dezvoltat mecanisme
care manipuleaza calea apoptotica pentru a-si asigura perpetuarea propriei supravietuiri,
inhiband apoptoza celulelor infectate pentru a permite replicarea virala si activand apoptoza
mecanismelor celulare de aparare ale gazdei. Tinand cont de aceste realitati, manipularea
cailor apoptotice prin interventie farmacologica sau genetica promite noi oportunitati
terapeutice pentru o serie de maladii.
Circumstantele aparitiei apoptozei se impart in doua mari categori. Apoptoza apare in
tesuturile normale, unde raspunde de deletia celulelor si este de asemenea observata in
contexte patologice specifice. Cel putin intr-o parte din situatiile din categoria a doua, poate fi
sustinut teoretic faptul ca vine in sprijinul unei semnificatii biologice. Supravietuirea celulelor
in curs de distrugere ar putea fi nociva gazdei. In contrast, necroza este totdeauna patologica
fiind consecinta lezarii majore a celulei si nu ii poate fi atribuita nici o functie homeostatica
(9).
Celulele raspund la leziune, daca pot, prin apoptoza. Daca un medicament induce
apoptoza intr-un limfocit, de obicei ne furnizeaza mai multe date despre celula decat despre
medicament, deci astfel de experimente trebuie interpretate cu precautie. Implicatiile acestui
proces in terapie sunt evidente: un medicament care inhiba apoptoza poate fi folosit in
prevenirea pierderii celulei acordand timp altor forme de terapie sa inlature infectia. In cancer,
dimpotriva, va avea valoare terapeutica o cale de stimulare a apoptozei in celulele maligne.
Modul de obtinere al acestui efect cu specificitate adecvata reprezinta o provocare la fel ca in
cazul agentilor chemoterapeutici uzuali. Desigur, celulele T citotoxice, una din cele mai
stralucite inventii ale naturii, stiu cum sa ucida specific.
O alta potentiala terapie e reprezentata de anticorpii declansatori ai apoptozei, dar
foarte importante sunt si imunotoxinele ce ascund liganzi ce induc apoptoza.
Concomitent cu explorarea potentialului terapeutic al apoptozei este necesara
descoperirea mecanismelor si moleculelor implicate.
Evolutiei i-au trebuit milioane de ani pentru dezvoltarea unui sistem desavarsit,
capabil sa elimine celulele nedorite; noua ne revine dificila sarcina de a descoperi cum sa
inducem organismului comutarea procesului pe .on. sau .off., la comanda.
Legaturile intercelulare caracteristice formelor superioare de viata nu ar fi posibile fara
un mecanism de indepartare individuala a celulelor care nu mai sunt necesare sau care nu mai
functioneaza normal. Reglarea defectiva a mortii celulare programate ar putea juca un rol in
etiologia cancerului, SIDA, bolilor autoimune si bolilor degenerative ale sistemului nervos
central. Manipularea farmacologica a apoptozei ofera noi posibilitati de profilaxie si tratament
acestor maladii.
Transformarea maligna
Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge
fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau
tratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate
sau initiate promoveaza carcinogeneza.
In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct
de vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor
corespund pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale
(hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti,
singulari sau multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule
.bizare., cu nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice. Aceste modificari reprezinta
semnele citologice ale malignitatii. Exista si exceptii, in anumite varietati de cancer, celulele
tumorale au un aspect morfologic foarte apropiat de celulele normale; ca urmare diagnosticul
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
173
de malignitate este dificil de hotarat si in astfel de situati se apeleaza la alte criterii, in
particular arhitecturale.
Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune.
Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prin
numarul de mitoze pe unitatea de camp microscopic, are o valoare data contribuind la
evaluarea prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat,
ca cel care se poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer,
diagnosticul de malignitate se bazeaza pe indicele mitotic (79).
Apoptoza si cancerul
Oncologii au fost traditional preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate
acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre
studiul apoptozei (2, 11, 80).
Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani in
urma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare ce apar
in tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si
activarea in tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea,
chemoterapia citotoxica, ablatie hormonala (81,82). Totusi, in ultimii ani, extinderea
cunostintelor despre controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei ei
potential oncologice depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia
celulelor tumorale. In particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsii
unor anumite proto-oncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri
viitoarelor cercetari.
Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea anormala de celule
se produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii
celulare, determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult
mai incet decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda datorita prelungirii
timpului de viata al celulei.
Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentru
replicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri:
poate intarzia diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza sau poate
progresa fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.
Apoptoza este o metoda eficienta de prevenire a transformarii maligne deoarece ea
indeparteaza celulele care poseda alterari genetice. Apoptoza anormala poate promova
dezvoltarea cancerului, atat prin permiterea acumularii de celule in diviziune, cat si prin
blocarea indepartarii variantelor genetice cu potential malign ridicat. Inca nu se cunosc
factorii care determina celula sa urmeze una din cele trei cai: intrarea in apoptoza dupa
leziune, repararea deteriorarii sau continuarea ciclului celular. Paradoxal, anumite gene care
stimuleaza diviziunea celulara, cum este c-myc, participa la deciderea caii de urmat (81).
Concentratiile de ARN si proteina pentru c-myc cresc timpuriu in apoptoza si
supraexprimarea acestor oncogene induce apoptoza in fibroblaste (82).
Oncogena bcl-2 ar putea fi .supresorul general al mortii celulare. pentru genele care
regleaza direct apoptoza (83). Toate celulele hematopoetice si limfoide, multe celule epiteliale
si neuronii contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul
endoplasmic. Limfoamele foliculare de celule B poseda o concentratie crescuta de proteina
Bcl-2, datorita translocatiei [t(14:18)] care plaseaza gena bcl-2 sub controlul unui promotor
puternic, cel al genei ce codifica pentru lantul greu al imunoglobulinei. Proteinele virusului
Epstein-Barr cresc nivelul expresiei genei bcl-2 in celulele limfomului Burkitt (84).
Comparativ cu limfocitele B normale, acelea care exprima bcl-2 supravietuiesc mai
mult in cultura dupa privarea de factori de crestere si sunt rezistente atat la radiatii ionizante
Apoptoza. Implicatii in patologia maligna
174
cat si la glucocorticoizi. De asemenea, concentratiile crescute de Bcl-2 protejeaza celulele de
apoptoza indusa de catre c-myc (85). Soarecii transgenici, care au fost inginerizati pentru a
supraproduce proteina Bcl-2, in limfocitele B, deseori dezvolta limfoame imunoblastice cu
celule mari si difuze. La jumatate din aceste tumori cu grad avansat de dezvoltare se remarca
translocatia genei c-myc (86).
Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului
celular inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau
deletii la nivelul genei p53 (87). Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea
lega si inactiva proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului
prin permiterea duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare
completa. Totusi, p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta
ca o .apoptogena. directa (o gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53
normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza
(88) (figura 10).
Figura 10. Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.
In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli externi, uneori
numiti semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseaza
evenimentele metabolice comune atat replicarii cat si apoptozei; semnalul de progresie abate
celula spre replicare, altminteri survine apoptoza.
DANIELA NICOLETA PETRUSCA, OLIVIA MIHAELA POPA, L. MESTER
175
Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge celulele incapabile sa
strabata .punctul de vama. inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competente
activate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o
leziune intr-o perioada critica.
Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agenti
alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibile (89). In
urma acestor observatii este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de
interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducand
la apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca,
in diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care degradeaza
ADN pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferi
apoptoza poate fi importanta in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de
crestere, care sunt de obicei rezistente la agenti citostatici.
Aparitia spontana a apoptozei in tumori
Apoptoza poate fi gasita in toate tumorile virtuale, netratate. Desi s-au efectuat putine
studii cantitative precise (90), evaluarile histologice indica faptul ca extinderea apoptozei in
anumite tumori umane se apropie de ceea ce s-a observat in tesuturile cu involutie rapida
evidentiind semnificatia sa cinetica, uneori considerabila.
Factorii responsabili pentru aparitia spontana a apoptozei in tumori sunt, indubitabil,
diversi. Apoptoza, deseori este proeminenta mai ales la locusul de confluenta cu necroza,
unde se presupune ca ischemia moderata este implicata in initierea ei, aceasta este o cauza
cunoscuta a activarii apoptozei in tesuturile non-neoplazice (91, 92).
S-a aratat ca, TNFα (factorul de necroza tumoral) induce apoptoza in liniile de celule
tumorale in vitro, astfel, o serie de fenomene apoptotice observate in vivo in tumori ar putea fi
atribuite eliberarii acestei citokine de catre macrofagele infiltrante. In alte cazuri, apoptoza
poate fi rezultatul atacului tumorii de catre limfocitele T citotoxice. Totusi, un nivel ridicat al
apoptozei este observat si in locusurile preneoplazice si in nodulii ce se dezvolta in ficat dupa
administrarea de carcinogeni chimici (93), este improbabil ca factorii mentionati ar putea fi
operativi in aceste circumstante. Este posibil ca prezumtivele mecanisme reglatoare ale
populatiilor celulare, descrise mai sus, actioneaza intr-o etapa timpurie a procesului de
carcinogeneza, cu o apoptoza crescuta ce echilibreaza temporar cresterea proliferarii celulare.
In sfarsit, nivelurile crescute de apoptoza in tumori pot fi rezultatul unui proces intrinsec al
acestor celule. Ratele de apoptoza gasite in tumori similare difera fiind rezultatul expresiei
diferitelor oncogene.