Anticorpi antinucleari

(imunofluorescenta)
Informatii generale si recomandari pentru efectuarea
testului
Identificarea anticorpilor antinucleari (ANA) reprezinta o
parte importanta a imunologiei clinice.
Anticorpii antinucleari sunt anticorpi indreptati impotriva
antigenelor nucleare si au fost descrisi intr-o multitudine de
afectiuni autoimune sistemice si organ-specifice.
Testul ANA isi are originea in fenomenul L.E care a fost
evidentiat pentru prima oara in 1948 de catre
Haargraves, Richmond si Morton. Totusi, determinarea
celulelor lupice s-a dovedit a fi un test putin sensibil si dificil
de standardizat.
In 1950, Coons si Kaplan au utilizat anticorpi specifici marcati
cu fluoresceina pentru identificarea antigenelor tisulare. In
1957, Holborow, Weir si Johnson au folosit pentru prima data
tehnica imunofluorescentei pentru a demonstra ca serul
pacientilor LE pozitivi contine anticorpi care produc o
fluorescenta nucleara omogena pe tesuturile umane. In
1961, Beck a descris si alte tipuri de fluorescenta nucleara
in serul pacientilor cu diferite afectiuni reumatice utilizand
sectiuni de ficat de sobolan.
Substratul ANA traditional a fost reprezentat mult timp de
sectiuni de ficat, rinichi sau stomac de sobolan. Inlocuirea
acestui substrat a fost realizata cu mult succes de linia
celulara Hep-2 (human epithelial type 2 cells) izolata initial
de la un carcinom laringian uman, aceasta permitand
recunoasterea a peste 30 pattern-uri nucleare si
citoplasmatice determinate de peste 100 autoanticorpi
diferiti. Avantajele utilizarii celulelor Hep-2 fata de substratul
animal sunt:

sensibilitate mai mare care permite identificarea mai

multor pattern-uri;

originea umana asigura o mai buna specificitate decat

cea animala;
nucleii celulelor sunt mai mari, iar detaliile nucleare pot
fi evidentiate mai bine;
dispunerea celulelor in monostrat faciliteaza o
vizualizare buna a nucleilor;
distributia antigenului este uniforma;
rata diviziunii celulare este crescuta astfel incat
antigenele exprimate predominant in timpul mitozei sunt
usor de localizat (de exemplu, pattern-ul de tip centromer).
Astfel, substratul Hep-2 permite recunoasterea
autoanticorpilor indreptati impotriva antigenelor din toate
etapele mitozei (profaza, metafaza, anafaza, telofaza), ceea
ce nu este posibil utilizand substratul animal 1.
Cele mai importante aspecte nucleare descrise la examenul
prin imunofluorescenta indirecta sunt:

ASPECT NUCLEAR OMOGEN: fluorescenta omogena

difuza a intregului nucleu in interfaza celulara; intensitatea
fluorescentei este mai pronuntata in regiunea cromozomiala
la celulele in mitoza; citoplasma este negativa. Apare asociat
in principal cu lupusul eritematos sistemic (LES) comun si
lupusul indus medicamentos, dar mai poate sa apara in
artrita reumatoida, artrita cronica juvenila si scleroza
sistemica (alaturi de aspectul fin patat). Antigenele implicate
sunt: ADN dublu catenar (dsDNA), histone, Ku.
ASPECTUL NUCLEAR OMOGEN INELAR: similar cu cel
nuclear omogen, dar cu cresterea intensitatii fluorescentei
marginale nucleare in interfaza celulara; citoplasma este
negativa. Este un aspect intalnit comun in LES, mai ales in
forma activa. Antigenul este reprezentat de dsDNA.
ASPECT MATRICE NUCLEARA: fluorescenta patata ce da
nastere unei retele nucleare spongioase in interfaza celulara.
Acest aspect se poate intalni in LES, boala mixta de tesut
conjuctiv sau in boli cronice reumatice. Antigenele implicate
sunt proteine ribonucleare heterogene (hnRNP).
ASPECT PATAT FIN: fluorescenta nucleara patata cu
aspect fin si distributie uniforma in interfaza celulara. Apare
in LES, sindromul Sjgren, sclerodermie, miozita si boala

mixta de tesut conjunctiv. Antigenele sunt reprezentate de

SS-A, SS-B, Ku, Ki si Mi-2.
ASPECT PATAT GROSIER: fluorescenta nucleara patata
cu aspect grosier in interfaza celulara. Apare in LES, boala
mixta de tesut conjunctiv, sindroame overlap, sindrom
Raynaud si psoriazis. Sunt implicate urmatoarele antigene:
U1-snRNP sau Sm (proteine ribonucleare mici).
ASPECT DE TIP CENTROMER: fluorescenta nucleara
patata cu aspect fin in interfaza celulara; in cursul mitozei
fluorescenta este prezenta la nivelul cromozomilor. Apare in
principal in sindromul CREST.
ASPECT NUCLEOLAR OMOGEN: fluorescenta omogena a
nucleolilor. Apare in sclerodermie, miozita, sindrom overlap
miozita-sclerodermie. Antigenul este constituit din complexul
PM-Scl cu rol in biosinteza ribozomilor.
ASPECT NUCLEOLAR PATAT: fluorescenta patata a
nuclelolilor; in cursul mitozei fluorescenta este prezenta la
nivelul cromozomilor, cu doua aspecte posibile: omogen
(antigenul este reprezentat de Scl-70 ADN topoizomeraza I)
si punctat (antigenele implicate sunt ARN polimeraza I si
NOR-90); este asociat cu sclerodermia.
ASPECT NUCLEOLAR IN GRAMEZI (CLUMPY):
fluorescenta nucleolara in blocuri. Este intalnit in
sclerodermie; antigenul implicat este fibrilarina o proteina
alcalina asociata cu ribonucleoproteina nucleolara U3snRNPs.
ASPECT DE PUNCTE NUCLEARE: fluorescenta
punctiforma (aproximativ 10 puncte/nucleu) care apare in
nucleoplasma separat de nucleoli. Se asociaza clinic cu:
ciroza biliara primitiva, sindromul Sjgren, ocazional LES.
Antigenele implicate includ complexe de multiproteine (Sp100), cu rol insuficient cunoscut.
ASPECT CENTRIOL/CENTROZOM: fluorescenta sub forma
de spoturi fine la cei 2 poli ce corespund fusului mitotic.
Apare in sindromul Raynaud, mai rar in sclerodermie,
sindromul Sjgren sau sindromul CREST. Antigenul este
reprezentat de centrozom = sistem de microtubuli ce are rol
in formarea fusului mitotic.

ASPECT MEMBRANA NUCLEARA: fluorescenta fina

inelara a membranei nucleare cu scaderea intensitatii
fluorescentei in nucleoplasma. Apare in hepatita cronica
asociata sau nu cu vasculita, trombocitopenie si LES.
Antigenele implicate sunt polipeptide care furnizeaza situsuri
de ancorare pentru cromozomi in interfaza celulara:
laminine A, B1, B2, C.
ASPECT PCNA (PROLIFERATING CELL NUCLEAR
ANTIGEN): fluorescenta patata variabila (prezenta doar in
unele celule) in interfaza celulara. Apare la 3-6% dintre
pacientii cu LES. Ca antigen este implicata ciclina, cu rol in
replicarea si repararea ADN-ului.
In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile
nucleare descrise:

In concluzie, pattern-ul fluorescentei nucleare reflecta

specificitatea pentru diferite afectiuni. Astfel,
imunofluorescenta indirecta permite diagnosticul primar in
cazuri clinice incerte, monitorizarea tratamentului (prin titrul
ANA) si poate furniza informatii decisive pentru investigatiile
ulterioare1;2;5.
Pregatire pacient - jeun (pe nemancate) sau
postprandial (dupa mese)3.
Specimen recoltat - sange venos3.
Recipient de recoltare - vacutainer fara anticoagulant
cu/fara gel separator3.
Prelucrare necesara dupa recoltare - se separa serul
prin centrifugare3.
Volum proba minim 0.5 mL ser3.
Cauze de respingere a probei - ser intens hemolizat,
lipemic sau puternic contaminat bacterian 3.
Stabilitate proba - serul separat este stabil 7 zile la
4C; timp mai indelungat la -20 C3.
Metoda imunofluorescenta indirecta3.
Valori de referinta si interpretarea rezultatelor
<1/100: Negativ3.
Rezultatele se exprima sub forma unui titru (dilutia pana la
care poate fi detectata fluorescenta).
In cazul unui rezultat pozitiv alaturi de titru este mentionat si
aspectul obtinut in imunofluorescenta.
Aproximativ 98% dintre pacientii cu LES activ vor prezenta
un rezultat pozitiv la screening-ul ANA prin
imunofluorescenta. Cu toate acestea a fost identificat un
grup de pacienti cu boala lupica ANA negativi. Aspectele
nuclear omogen si/sau nuclear omogen inelar se coreleaza
cu LES, activitatea bolii si cu nefrita lupica.
Aspectul de tip centromer se coreleaza in mod tipic cu
sindromul CREST (confirmare prin determinare cantitativa
imunoenzimatica).

Aspectele de tip nuclear patat se asociaza cu prezenta

anticorpilor fata de antigenele nucleare extractibile (ENA):
U1-RNP, Sm, SS-A, SS-B, Scl-70 si Jo-14.
In unele cazuri, pe substratul Hep-2 se pot obtine diverse
pattern-uri de fluorescenta citoplasmatica:
-patat fin, cu pete fluorescente dispersate, de dimensiuni
mici, in majoritatea cazurilor pe un fond omogen sau patat
fin dens; antigenele sunt reprezentate de aminoacil-t-ARNsintetaze, in special Jo-1; se asociaza cu
polimiozita/dermatomiozita;
-patat fin dens, cu fluorescenta granulara difuza, aproape
omogena, in intreaga citoplasma; antigenele includ rRNP
fosfoproteine ribozomale; este intalnit la pacientii cu LES
care prezinta manifestari SNC;
-polar, cu fluorescenta perinucleara grosiera, cu granule
dispuse in gramezi la un pol al celulei ce corespund
lamelelor aparatului Golgi; se intalneste rareori in LES, in
sindromul Sjgren, boala mixta de tesut conjunctiv,
granulomatoza Wegener, infectii virale (EBV, HIV);
-reticular grosier, cu fluorescenta difuza reticulara si
granulara grosiera ce cuprinde aproape intreaga citoplasma;
antigenele sunt proteine din membrana interna a
mitocondriilor (in special M2); se asociaza cu ciroza biliara
primitiva;
-reticular fin, cu fluorescenta difuza reticulara si granulara
fina corespunzatoare reticulului endoplasmatic; se asociaza
cu afectiuni hepatice cronice;
-fibrilar, cu o fluorescenta lineara a fibrelor de stres din
citoschelet; antigenele implicate sunt reprezentate de actina
si miozina; se intalneste in hepatita autoimuna, ciroza biliara
primitiva, boala mixta de tesut conjunctiv;
-segmentar, cu fluorescenta unor segmente mici de fibre;
antigenele sunt -actinina, vinculina, tropomiozina; se
asociaza cu miastenia gravis, boala Crohn, colita ulceroasa.
In toate aceste cazuri este necesara confirmarea rezultatului
pe substraturi specifice sau determinarea prin metode
imunoenzimatice2.

Limite si interferente
Persoanele peste 80 ani prezinta o incidenta crescuta (50%)
de ANA in titruri joase4.
Bibliografie
1. A.R. Bradwell, R.G. Hushes ,E.L. Harden. Atlas of Hep-2 patterns,
Second Edition, 2003.
2. Carlos Alberto von Mhlen, Robert M. Nakamura. Clinical and
laboratory Evaluation of Systemic Rheumatic Diseases. In Henrys
.Clinical Diagnosis and Management By Laboratory Methods,
Ed.Saunders, 2007, 924-928.
3. Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate
2010. Ref Type: Catalog
4. Laboratory Corporation of America. Directory of Services and
Interpretive Guide. Antinuclear Antibodies. www.labcorp.com 2010. Ref
Type: Internet Communication
5. Rudolf Mierau, Ekkehard Genth. Autoantibodies in Systemic
Rheumatic Diseases. In Clinical Laboratory Diagnostics-Use and
Assessment of Clinical Laboratory Results. Lothar Thomas. TH-Books
Verlagsgesellschaft mbH, Frankfurt /Main, Germany,1 ed. 1998, 807833.

In figurile de mai jos sunt ilustrate cateva din pattern-urile

citoplasmatice descrise: