 1842 – Carl Vogt a descris principiul apoptozei

 1885 – Walther Flemming a oferit o descriere mai precisa a MCP

 1965 – John F. Kerr a descris necroza celulara programata
 Lb. gr. "apoptosis“ = "caderea frunzelor"
 Celula se descompune treptat in componentele sale moleculare, care
ulterior vor fi utilizate de alte celule ale organismului.
 Apoptoza participa in anumite etape ale dezvoltarii organismului individual,
dar si elimina celulele infectate de virusi, bacterii, etc.
 Modelul mortii celulelor - pe calea apoptozica sau a necrotica - e
dependenta si de concentratiile intracelulare de NAD+ si ATP. Micsorarea
nivelului de NAD+ si ATP induce necroza celulara.
 Intr-un organism sanatos moartea programata celulara (MPC) este un
mec. de mentinerea homeostaziei. Atat hipofunctia, at si hiperfunctia
apoptozei → dereglari de homeostazie.
 Dereglari ale apoptozei contribuie la aparitia neoplaziilor (prevenirea sau
intarzierea turnover-ului celular normal) si faciliteaza progresia tumorala.
 Cunoasterea mec. de reglare a apoptozei poate imbunatati pe viitor
tratamentul anticanceros.
 Apoptoza este un proces multifazic.
 Prima faza: primirea semnalului → aparitia unei informatii, transmisa in
celula din exteriorul ei sau generata in compartimentele ei → Semnalul
este fixat de receptor si supus analizei → semnalul este transmis de
mesagerii, de diferit rang, pana la nucleu → unde are loc includerea
programei sinuciderii celulare prin activarea genelor letale sau represia
celor antiletale.
 Embriogeneza – involutia canalelor Wolff si Muller, formarea degetelor la fat
 In dezvoltarea fetala tesutul nervos este produs in exces, iar pentru formarea
conexiunilor dintre neuroni este necesara eliminarea surplusului de celule

 Organogeneza, turnover tisular normal, absenta unor factori trofici

 Eliminarea LB si LT la sfarsitul raspunsului imunologic
 Eliminarea postinflamator a PMN extravazate in tesuturile inflamate
 Eliminarea celulelor epiteliale si a formarii keratinocitelor
 Cele doua procese sunt strans legate pentru a preveni o crestere incontrolabila
a numarului de celule
 Alterari ale expresiei sau functiei genelor ce controleaza MCP pot deregla acest
echilibru contribuind la expansiunea celulelor neoplazice
  Condensarea cromatinei (picnoza)
 Condensarea citoplasmei
 Fragmentarea nucleului (kariorexis)
 Distrugerea mitocondriilor cu eliberarea cyt-c
 Vezicularea membranei plasmatice
 Contractia si fragmentarea celulara
 Formarea corpilor apoptotici

Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological phenomenon with
wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26:239-57
Fagocit

PS Celula
apoptotica
Receptorii
PS
 Superagregarea cromatinei.
Leziuni mitocondriale si lipsa invelisului
nuclear

Alterari citoplasmatice si
mitocondrii dilatate
 Ce anume declanseaza modificarile Stimuli pro-apoptotici
morfologice din apoptoza?

 La celulele animale si ale omului,

apoptoza este dependenta de
activarea proteolitica a cascadei Caspaze initiator
de caspaze - o familie de proteaze Cascada
cisteinice care scindeaza specific caspazelor
proteinele dupa resturile de acid
aspartic.
 “caspaze” (Cistein Aspartaze) Caspaze efector
 Caspazele sunt prezente in toate
celulele animale ca si enzime inactive
 Enzimele active sunt heterotetrameri
compusi din 2 subunitati mari si 2
subunitati mici cu 2 situsuri active /
molecula Apoptoza

Thornberry NA, Lazebnik Y. Caspases: enemies within. Science 1998;281:1312-6

Cryns V, Yuan Y. Proteases to die for. Genes Dev 1999;12:1551-70
Alnemri ES, Livingston DJ, Nicholson DW, et al. Human ICE/CED-3 Protease Nomenclature. Cell 1996;87:171
1. Activarea procaspazelor prin scindare proteolitica in subunitati cu
asocierea lor ulterioara.

2. Interactiunea functionala intre caspazele initiale si efectoare (finale)

subfamiliei caspazei 3.
 Exista 3 subfamilii de caspaze: Clasificarea
caspazelor
a) caspazele 1 (1,4,5) Mediatori ai
b) caspazele 2 (2) inflamatiei
c) caspazele 3 (3, 6-10)
Casp-1
 Caspazele cliveaza substraturile la nivelul Asp si
Casp-4
sunt activate prin proteoliza la nivelul Asp → Casp-5
colaboreaza in cascade proteolitice
Activatori ai
 Functional, caspazele se grupeaza in caspaze
apoptozei
“initiator” si “efector”
 Caspazele efectoare sunt dependente de Casp-2
caspazele initiatoare Casp-8
 Substraturi: protein-kinazele si alte proteine de
transductie a semnalului, proteine ale Casp-9
citoscheletului si ale matricei nucleare, proteine Casp-10
de reparare a ADN-ului si subunitati inhibitorii ale
endonucleazelor Efectori ai apoptozei
Casp-3
Casp-6
 Deletii ale genei caspazei-3 in celule MCF7
 Mutatii ale genei caspazei-8 in neuroblastoame si alte
tumori solide
 Mutatii ale genei caspazei-5 in cancerele de colon
 Mutatiile asociate cu starile neoplazice la nivelul
genelor ce codifica caspazele probabil contribuie la
rezistenta la apoptoza
 Datorita redundantei membrilor familei caspazelor
aceste mutatii nu previn apoptoza, lasand cai
alternative ale apoptozei intacte
 Extrinseca
 Celulele CTL si NK introduc
proteaze pro-apoptotice –
granzima B
 Receptorii familiei TNF
(factorul necrotic
cancerigen)
 Mitocondria poate participa
la calea TNFR prin cross-talk

 Intrinseca
 Eliberarea cyt c din
mitocondrie
 Factori de stress asupra
RE/Golgi
 Calea nucleara de reglare a
apoptozei
Cai de realizare a MPC
1. Calea determinata de inductorii fiziologici, actiunea carora se realizeaza
prin receptorii celulari, ce au functia de a include mecanismele programei
apoptozei.
Schematic: inductor > receptor > adaptori > caspazele initiale >
reglatori > caspazele finale.
Receptorul (Fas) interactioneaza cu ligandul (FasL) (proteina transmembranara
a T-Kiler), se activeaza si include PMC infectata de virus (desen 1).
 2. In celulele supuse actiunii inductorului apoptozei, brusc se
micsoreaza potentialul membranar, ce duce la cresterea
permeabilitatii membranei interne mitocondriale, consecinta la
formarea porilor.
 Recent se confirma ca un rol-cheie in apoptoza il poseda
mitocondriile.
 Unul din simptomele cele mai timpurii ale apoptozei e depolarizarea
membranei interne mitoconcondriale. Atit apoptoza, cit si depolarizarea
membranei mitocondriale se protejeaza prin utilizarea inhibitorilor, ce
blocheaza formarea de pori in membrana interna.
 In celulele fara DNA mitocondrial (p°) apoptoza poate fi provocata de
factorul necrotic cancerigen (TNF)
 In celulele martor (p+), ce poseda mitocondrii cu DNA, ambele
substante (TNF, Antimicina A) induc apoptoza. Se confirma ca natura
semnalelor primare ce provoaca apoptoza e diferita.
 TNF e un semnal exterior de autodistrugere, caruia celula se supune.
 Antimicina A este un inhibitor specific absolut, care blocheaza
transportul e- intre hemul bh si citocroma b .
 Dintre proteinele mitocondriale, ca factori apoptogeni sunt si: citocrom
c, procaspazele 2, 3, 9; proteina AIF (apoptosis inducing factor ).
 3. In unele cazuri MPC se realizeaza ca rezultat al efectului combinat
a 2 cai – cu participarea receptorilor membranei plasmatice si a
citocromului C mitocondrial.
 Lezarea DNA duce la acumularea in celule a proteinelor genei p53,
care stopeaza inmultirea celulelor si (sau) induce apoptoza.
 In mai mult de 50% cazuri in celulele cancerigene gena p53 este
inactiva - este dereglata reglarea homeostazei celulare de p53.
 proteina p53 - este un factor de transcriptie, ce regleaza
activitatea genelor. Se presupune ca, raspunsul la formarea p53 e
dependent de gradul de alterare a genomului celular.
 4. Exista si calea de transmitere a semnalului MPC cu participarea
RE, unde este localizata procaspaza 12.
 Dereglarile homeostaziei Ca2+ intracelular la adaosul tapcigarginei
sau a preparatului Ca2+ ionoforic - A23187 duc la apoptoza,
determinata de activarea procaspazei 12.
 Apoptoza, dependenta de RE este in maladia Alzheimer: (neuronii
corticali la soricei cu deficit de caspaza 12 sunt rezistenti la apoptoza
indusa de o proteina amiloidica, dar nu la apoptoza indusa de
cit.c sau cu participarea receptorilor membranari).
 tumour-suppressing gene p53
 SMACs (second mitochondria-derived activator of caspases)
 IAP - inhibitor of apoptosis proteins
 TNF-induced (tumour necrosis factor)
 Fas receptor (also known as Apo-1 or CD95) binds the Fas ligand (FasL)
 death-inducing signaling complex (DISC)
 CTL – limfocite L citotoxice
 NK – natural killer cell
 Fas receptor (FasR) is the most intensely studied death receptor. Its
aliases include CD95, Apo-1, and tumor necrosis factor receptor
superfamily, member 6 (TNFRSf6).
 DISC – death-inducing signalling complex
 FADD, Fas-associated death domain
 GF - growth factor
 Apaf-1: Apoptotic peptidase activating factor 1
 BID = BH3-interacting domain death agonist
 HtrA2 = high temperature requirement protein A2
 BAK – Bcl-2 homolog antagonist/killer
 BAX – proteina asociata Bcl-2
 Bcl-2 – leucemie limfocitara cronica cu celule B
 BCLXL – Bcl-2-like 1
 IAP – inhibitor al proteinei apoptozei
 PUMA - p53-upregulated modulator of apoptosis
 SMAC/DIABLO - second mitochondria-derived activator of
caspase/direct IAP binding protein
 CARD - CAspase Recruitment Domains
 Celulele CTL si NK introduc
proteaze pro-apoptotice –
granzima B (Motyka et al.
2000)
 Granzima B (serin proteaza) –
cliveaza Asp
 Granzima B este capabila sa
cliveze si sa activeze
numeroase caspaze si
substraturile lor (Martin et al.
1996)
 DR4 DR5

FADD FADD
DISC
Procaspaze 8, 10 Procaspaze 8, 10

Caspase 8,10 Caspase 8,10

 Celule de soarece knock-out la care gena FADD lipseste sunt rezistente la

inducerea apoptozei prin citokinele familiei TNF (Zhang et al. 1998)
 Celule de soarece cu caspaza-8 knock-out nu pot intra in apoptoza ca raspuns
la liganzi sau anticorpi ce activeaza D-receptorii familiei TNF → rol esential al
caspazei 8 in aceasta cale (Varfolomeev et al. 1998)
DR – death receptor
DISC – death-inducing signalling complex
FADD, Fas-associated death domain
Calea extrinseca Calea mitocondriala
FasL
Fas/Apo1 oxidanti deprivare GF alti factori
/CD95
Lezare
ADN
D D
D D D Bcl-2
FADD

DISC
Procaspaza 8 dATP
Apaf -1
BID Procaspaza 9
Citocrom
Caspaza 8 c
Procaspaza 3
dATP
Apaf -1
Caspaza 9
Tinte celulare Caspaza 3 Apoptozom

Adaptat dupa Hengartner, M.O. 2000. Nature. 407:770.

Green, D. and Kroemer, G. 1998. Trends Cell Biol. 8:267.
 BAD – Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoter
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, Molecular Biology of the Cell, New York and London: Garland Science,
2002
 Lezare ADN
 Mitocondria mai elibereaza si alte proteine
pro-apoptotice: endonucleaze G, AIF, p53
Smac (Diablo) si Omi (HtrA2) si
PUMA, NOXA
antagonisti IAP (proteine inhibitorii a BCL2, BCLXL
caspazelor) BAX, BAK
  Celule fara genele pentru Apaf1 sau
Mitocondria
pro-casp-9 sunt incapabile de apoptoza ca
raspuns la agenti ce determina eliberarea Citocrom c
SMAC/DIABLO
cyt c din mitocondrie (Hakem et al. 1998). APAF1
Totusi, aceste celule pot muri pe cai non- Caspaza 9
apoptotice, demonstrand ca mitocondria IAP
Caspaza 3, 6, 7
controleaza cai caspazo-dependente cat
si caspazo-independente (Haraguchi et al. Apoptoza
2000)

Adaptat dupa Ashkenazi A. Nat Rev Cancer 2002;2:420–430.

APAF1 – factorul de activare al proteazei apoptotice-1; BAK – Bcl-2 homolog antagonist/killer; BAX –
proteina asociata Bcl-2; Bcl-2 – leucemie limfocitara cronica cu celule B; BCLXL – Bcl-2-like 1; IAP –
inhibitor al proteinei apoptozei; PUMA - p53-upregulated modulator of apoptosis; SMAC/DIABLO - second
mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI
  Studii de ablatie genica sugereaza
posibilitatea existentei unei cai RE/Golgi
→ apoptoza care sa implice casp-12
(Nakagawa et al. 2000).
 Caspaza 12 la celulele umane este
nefunctionala datorita prezentei precoce
a unui codon stop (Fischer et al. 2002)
  S-a mai sugerat o relatie intre casp-2
si Golgi dar detaliile sunt inca neclare
(Mancini et al. 2000)
 Casp-2 si casp-12 sunt proteine ce contin
domenii CARD, dar nu se cunoaste care
sunt proteinele adaptor care se leaga de
CARD si care controleaza activarea
acestor proteaze
 CARD - CAspase Recruitment Domains
 Calea nucleara de reglare a
apoptozei este centrata asupra unor
mici unitati nucleare – POD (Pml
oncogenic domains) sau corpi
nucleari (NB)
  Ablatia genei pml duce la o
rezistenta generala la apoptoza
printr-un mecanism inca necunoscut
(Wang et al. 1998)
 Au fost localizate cateva proteine
pro-apoptotice in NB: Daax, DAPK3
si Par4 (1997-2000)

 Pml a fost prima data identificata datorita fuziunii sale cu gena RAR in t(15;17)
cromozomiala din leucemia promielomonocitica, unde disloca NB si se creaza un status
apoptozo-rezistent (Salomoni et al. 2002)

PAR4 - Prader-Willi/Angelman region gene 4

DAPK3 – death associated kinase 3
Wang Z-G, Ruggero D, Ronchetti S, et al. Pml is essential for multiple apoptotic pathways. Nat Genet
1998;20:266-72
Salomoni P, Pandolfi PP. The role of PML in tumor suppression. Cell 2002;108:165-70
 Desi exista diverse mecanisme de activare a casp-initiator, in cele mai multe
cazuri mecanismele biologice sunt foarte similare

 Activarea caspazelor poate fi explicata prin “modelul proximitatii induse”

(Salvesen, Dixit 1999)
 Acest model se bazeaza pe observatia empirica a faptului ca formele
neprelucrate a caspazelor nu sunt in totalitate inactive ci poseda o activitate
proteazica redusa (~1%)
 Aduse in stransa apozitie prin interactiuni proteice, zimogenele se pot trans-
procesa reciproc → proteaze active total
 Acest mecanism este clar in caile de activare a caspazelor prin receptorii fam.
TNF (extrinseca) si cyt c mitocondrial (intrinseca)

Salvesen GS, Dixit VM. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:10964-7
  NF-kB induce exprimarea unor
gene antiapoptotice: familia BCL-2
(BCL-XL, BFL-1), familia IAP (C-
IAP2) si familia genei DED (C-
FLIP) (Karin M, Lin A. 2002)

 Cresteri ale activitatii NF-kB cresc rezistenta celulara la apoptoza afectand:

 Calea intrinseca (mitocondriala): ↑ Bcl-2 antiapoptotice
 Calea extrinseca (receptorii fam. TNF): reglarea FLIP
 Cai comune ce implica caspazele efector ca si rezultat al supra-expresiei C-IAP2
 Date recente arata o hiperactivitate a NF-kB in numeroase neoplazii solide si hematopoietice
(Karin M et al., 2002)

Karin M, Lin A. NFkappaB at the crossroads of life and death. Nat Immunol 2002;3:221-7
Karin M, Cao Y, Greten FR, Li Z-W. NFκB in cancer: from innocent bystander to major culprit. Nat Rev Genet 2002;2:301-10
  Medicamentele anticanceroase ┴ activitatea
proteozomilor → supresia degradarii IkB ┴ NF-
kB (Hayashi et al. 2000)
 IkB kinazele (IKK) → fosforilarea IkB (pentru
degradarea IkB), sunt de asemenea evaluate
ca tinte pentru noi medicamente
 Virusul HIV, prezinta locusuri pentru NF-kB ce
controleaza expresia genelor virale si
contribuie la replicarea virala si
patogenicitatea virala.
 In cazul virusului HIV-1, NF-kB este implicata
in parte in activarea virusului.
 YopJ, secretata de Yersinia pestis (ciuma
bubonica), previne degradarea IkB. Aceasta
determina ca acest patogen sa inhibe efectiv
calea NF-kB si astfel sa blocheze raspunsul
imun al unei persoane infectate cu Yersinia.

Karnolsky IN. Cytogenetic abnormalities in chronic lymphocytic leukemia. Folia Med (Plovdiv) 2000;42:5-10
Hayashi T, Faustman D. Essential role of human leukocyte antigen-encoded proteasome subunits in NF κB activation and prevention
of tumor necrosis factor-a-induced apoptosis. J Biol Chem 2000;275:5238-47
 Protein kinaza Akt (PKB) joaca un rol
important in legarea factorilor de crestere si
oncoproteinelor la calea apoptotica.
 Celulele umane prezinta 3 tipuri de gene Akt.
Akt pot fosforila diverse proteine apoptotice:
BAD (fosforilarea BAD inhiba capacitatea sa
de a heterodimeriza cu Bcl-X (Datta et al.
1999)

 Akt poate fosforila si casp-9, blocand apoptoza pe calea mitocondriala (Cardone et al. 1998)
 Akt are un rol important si in activarea NF-kB (Ozes et al. 1999)
 Akt se opune apoptozei indusa de kinaza Ask1 (Kim et al. 2001) si promoveaza degradarea
p53 prin actiunea sa asupra Mdm2 (Testa JR, Bellacosa A, 2001).

Kim AH, Khursigara G, Sun X, et al. Akt1 phosphorylates and negatively regulates ASK1. Mol Cell Biol 2001;21:893-901
Testa JR, Bellacosa A. AKT plays a central role in tumorigenesis. Proc Natl Acad Sci USA 2001;98:10983-5.
 PI-3K - Phosphatidylinositol-3-kinase
BAD – Bcl-XL/Bcl-2-associated death promoter
Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P, Molecular Biology of the Cell, New York and London: Garland Science,
  Expresia Bcl-2 in epiteliul mamar
este estrogen-dependenta. Prin
inhibarea activitatii transcriptionale a
ER, antiestrogenii (Tamoxifen) reduc
expresia Bcl-2 si promoveaza
apoptoza in celulele tumorale
mamare, explicand efectele benefice
ale agentilor antihormonali in
tratamentul cancerelor mamare
(Teixeira et al. 1995)

 Similar, vitamina D si unii analogi sintetici activeaza receptorul vitaminei D (VDR) si inhiba
expresia unor gene Bcl-2 antiapoptotice (Bcl-2, Bcl-XL) restabilind sensibilitatea la apoptoza.
Doze mari de vitamina D se folosesc in prezent in trialuri clinice pentru cancer prostatic (Guzey
et al. 2002).
 Diosgenina (Trigonella sp.), activeaza apoptoza in celule canceroase mamare probabil prin
scaderea expresiei Bcl-2 antiapoptotic si prin activarea casp-9

Guzey M, Kitada S, Reed JC,Apoptosis induction by 1alpha,25-dihydroxyvitamin D3 prostate cancer.

Mol Cancerl Ther 2002;1:667-77.
 Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., Molecular Biology
of the Cell, 4th ed., New York, Garland Publishing, 2002
 Ardelean A, Biologie celulara si moleculara, Ed. Vasile Goldis Univ. Press, 2007
 Benga Gh., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1985
 Cooper G.M., The Cell - A Molecular Approach, 2nd ed., Sunderland (MA),
Sinauer Associates, Inc.; 2000
 Craciun C, Florea A, Dragos N, Ardelean A, Introduction to Cell and Molecular
Biology, Cluj Univ. Press, 1999
 Cruce M., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Aius Craiova, 2002
 Diculescu I., Onicescu D., Benga Gh., Popescu L.M., Biologie Celulară, Ed. D.P.
Buc., 1983
 Frăsinel N., Verdeş D., Biologie Celulară şi Moleculară, Ed. Mirton, Timişoara,
1994
 Lodish H., Berk A., Zipursky S., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., Molecular
Cell Biology, 4th ed., New York, W. H. Freeman & Co., 1999.
 Kufe, DW; Pollock, RE; Weichselbaum, RR.; Bast, RC., Jr.; Gansler, TS.; Holland,
JF.; Frei III, E., Cancer Medicine, BC Decker Inc. ; 2003
 Mixich F., Ardelean A., Principii fundamentale de biologie moleculară, Ed.
Med. Univ. Craiova, 2002
 Moldoveanu E, Popescu LM, Apoptoza - Mecanisme moleculare, ed. a II-a, Ed.
Univ. Carol Davila Bucuresti, 1999
 Strachan T., Read A.P., Human Molecular Genetics, 2nd ed. Oxford, UK, BIOS
Scientific Publishers Ltd; 1999