CURS 6: CRESTELE

NEURALE
Conf Dr. B. Voiculescu
CRESTE NEURALE

Insule de celule neuroectodermale, asezate de o

parte si de alta a tubului neural primitiv, sub
forma unor benzi longitudinale

Sunt esentiale in dezvoltare, ele dau nastere unor

structuri importante, motiv pentru care sunt
considerate a patra foita embrionara
CRESTE NEURALE
Se formeaza din regiunea dorsala a plicilor
neurale, din zona de jonctiune
neuroectodermala in ziua 22, fiind de origine
epiblastica.

In a 28-a zi de la fecundatie, marginile santului

neural se apropie si fuzioneaza intre ele pentru a
delimita tubul neural primitiv

Apoi, celulele zonei jonctionale migreaza formand

crestele neurale.
INDUCTIA CRESTELOR NEURALE
Semnale ce provin de la:
Epidermul din jur
Mezodermul subiacent
Placa neurala
GRADIENTUL BMP
Initial pentru inductie este un gradient medio-
lateral BMP care localizeaza celulele
progenitoare ale CN:
BMP este inhibat la nivelul placii neurale
BMP in conc mare la nivelul ectodermului
La nivelul joncitunii neuroectodermale- nivel
intermediar

Acesta exista prin 2 mecanisme:

1. Secretia de catre mezodermul dorsal de molecule anti
BMP- noggin, follistatin si chordin
2. Inhibitia semnalului BMP in ecodermul dorsal printr-
un mecanism dependent de Wnt
BMP

BMP activeaza proteinele efectorii Smad 1,5 si 8,

care interactioneaza cu Co- Smad, formand
complexe transcriptionale

Se activeaza transcriptia unor gene:

Cu rol in specificarea marginii placii neurale
Cu rol in specificarea CCN
INDUCTIA CRESTELOR NEURALE

Urmatorul semnal este reprezentat de stabilirea

unui gradient antero-posterior a Wnt, FGF si
acid retinoic, necesar pentru dorsalizarea
CCN

Aceste semnale determina activarea unei cascade

genice, initiata in intreaga masa a plicilor
neurale, pentru ca mai apoi sa fie restrictionata
la CCN
Dublu gradient necesar inductiei
(a) gradient medio- lateral BMP (rosu) este
stabilit la nivelul ectodermului si are rolul de
a specifica pozitia in care se vor forma
crestele neurale (regiunea jonctionala), la o
anumita concentratie a BMP (roz)
(b) Semnale de dorsalizare (curba mov), ce
corespund activitatii Wnt, FGF si RA, ce
transforma cea mai posterioara parte a
marginii placii neurale in celule ale crestelor
neurale (mov).
Aceste semnale sunt generate de asemenea
gradual, cu o concentratie mare in partea
posterioara a ectodermului si mica in
regiunea anterioara,
Nivelul scazut este pastrat prin exprimarea
unor semnale antidorsalizare in regiunile
anterioare- Dikkop si Cerberus (curba verde)
(c) Odata cu inchiderea tubului neural, unele
dintre semnalele initiale sunt pastrate pentru
a mentine si specifica CCN.
FGF

Semnalizarea prin aceasta molecula se face pe

trei cai: Akt, PLCgamma si Ras/ Erk

Efecte:
Activeaza expresia Wnt
Inhiba expresia BMP
NOTCH
Sursa- placa neurala

Interactiunea Notch/ Delta activeaza domeniul

intracelular al Notch, care se leaga apoi de
factorii de transcriptie CSL

Efectul este activarea genei Hairy2 (specifica

teritoriul de granita) sau activarea expresiei
BMP inducand indirect CCN
Calea Notch/ Delta
Delta si Notch sunt proteine
transmembranare ce contin
domenii extracelulare repetitive
EGF (dreptunghiuri verzi si bleu).
Activarea Notch de ligandul Delta
declanseaza 2 clivari proteolitice a
lui Notch (S2 si S3).
Proteoliza S3 elibereaza domeniul
IC Notch (Notch intra), care este
translocat in nucleu si activeaza
CSL.
CSL este reprimat in absenta
Notch de catre un complex
represor (Co-R). Complexul Co-R
este inlocuit de un complex
activator ce contine Notch
transcriptie de gene specifice.
WNT
Sursa Wnt- epidermul ce exprima Wnt6 la
embrionul avian si Wnt8 la Xenopus si zebrafish

Se leaga de receptorii frizzled si LPR5/6,

permitand acumularea intracelulara de beta
catenina aceasta se leaga de efectorul Wnt
TCF/LEF

Se activeaza factorul de transcriptie Pax 3/7, care

activeaza genele ce specifica crestele neurale
CASCADA GENICA
Primele activate sunt genele care specifica
marginea placii neurale.
Acestea nu sunt restrictionate la CCN, dar
controleaza activarea unei a doua serii de gene-
genele de supravietuire celulara sau de
specificare a CCN
Acestea sunt restrictionate la linia precursoare
CCN si initiaza tranzitia epitelio-
mezenchimala pe care o sufera
Un al treilea val de activare, are ca tinta genele
CCN efectorii, responsabile pentru migrare si
diferentiere
GENELE SPECIFICATOARE ALE
MARGINII PN

In afara de CCN, jonctiunea neuroectodermala

mai da nastere si altor tipuri de celule:
Celulele placii alare
Interneuroni dorsali
Neuroni senzitivi
Celule precursoare ale placodelor
Cele mai importante gene care specifica teritoriul
de granita sunt: ap2, zic1, hairy2, msx1/2,
dlx3, dlx5, pax3/7, cMyc
GENE IMPLICATE IN
SUPRAVIETUIREA CRESTELOR
NEURALE
Se mai numesc si gene specificatoare ale CN

Cele mai importante sunt Snail2, Slug, Sox9, Sox

10, AP2, Twist, Id3, Fox D3

Acestea sunt necesare pentru supravietuirea

CCN, pentru generarea fenotipului migrator si
pentru inhibitia markerului placii neurale- Sox2
Reteua genica a crestelor neurale

Verde deschis- gene specificatoare

ale marginii placii neurale

Albastru- gene de supravietuire

Genele scrise cu albastru- efect

antiapoptotic
MIGRARE
a. primul pas spre migrare il reprezinta tranzitia
epitelio- mezenchimala- prin care celulele
epiteliale sunt transforamate in celule
mezenchimale

b. dupa TEM, celulele se delamineaza si incep sa

migreze pe rute bine definite, ghidate de:
restrictielaterala prezenta in tesuturile din
marginea rutelor de migrare
Elemente permisive de la nivelul MEC
Factori solubili chemoatractanti si chemokinetici
TRANZITIE EPITELIO-
MEZENCHIMALA
Celulele ce exprima genele specifice CCN vor
trece printr-un proces de TEM

TEM este declansat de cai moleculare similare cu

cele ce au loc in timpul gastrulatiei

Cai implicate in inductia TEM: Wnt, FGF, BMP,

c-Myb si Msh-1
TEM
Are trei evenimente cheie:

1. Pierderea polaritatii apico- bazale a celulelor

premigratorii

2. Modificari in profilul moleculelor de adeziune

exprimate

3. Activitate proteazica necesara lizei matrixului

extracelular
MODIFICARI DE POLARITATE
CCN premigratorii formeaza un epiteliu cu o
polaritate specifica apico-bazala, care se pierde
pentru ca celulele sa-si initieze migarea (a nu se
confunda cu polaritatea migratorie)

Zonele apicale sunt unite prin jonctiuni

intercelulare in momentul formarii tubului
neural

Cu 5 ore ininte de initierea migrarii- dispar

DE LA JONCTIUNI ADHERENS LA
GAP
Are loc procesul de de-epitelizare- scade expresia
occludinei de la nivelul tubului neural

Se produce progresiv inlocuirea jonctiunilor

adherens cu jonctiuni gap

Connexina 43 este exprimata intens de CCN de

soarece, iar modificari la nivelul genei ce o
codifica defecte ale derivatelor CN (cardiace)
Zonula adherens areloc scaderea expresiei claudinelor,
occludinelor si a ZO1 disparitia ZA
Pierderea polaritatii apico- bazale: moleculele cu rosu
sunt exprimate iar cele cu albastru reprimate
MODIFICARI IN ADEZIUNE
La inceputul migrarii se pierd caderinele de tip I
si sunt inlocuite cu caderine de tip II

Caderinele de tip I sunt exprimate de obicei in

tesuturile stabile (caderina E, caderina N,
caderina 6B), iar cele de tip II in celulele
mezenchimale (caderina 7, caderina 11), mai
putin coezive

De exemplu, la embrionul avian, are loc scaderea

N caderinei si a caderinei 6B, dar cresterea
caderinei 7
MODIFICARI IN ADEZIUNE
Caderina 11 este exprimata in celulele migratorii la
Xenopus

Foarte importanti sunt factorii care determina

scaderea expresiei caderinelor de tip I
Factorii din familia Snail se leaga direct de regiunea
promotoare a genei E- caderinei si produc represia
transcriptiei
Twist reprima expresia E- caderinei

Foarte important este faptul ca odata ajunse la

destinatie, moleculele pierdute vor fi reexprimate,
pentru a se produce stabilizarea in tesutul tinta
N-CAM
Glicoproteina, ce contine 30% resturi de acid
sialic

Membra a superfamiliei imunoglobulinelor

Mediaza adeziunea celulara calciu-

independenta

Si aceasta molecula este reprimata in CCN

migratoare, dar reapare odata ajunse la
destinatie
Clasele de molecule de adeziune si moleculele interactiunii
citoscheletale
ACTIVITATE PROTEAZICA
Digestia matrixului extracelular de catre
metaloproteinaza MMP= matrix
metaloproteinases

MMP sunt exprimate ca zimogeni (pro- MMP), ce

sunt activate prin clivare protelitica, de catre alte
MMP

Migrarea MMP- dependenta este reglata de catre

molecule numite TIMP (tissue inhibitors of
matrix MMP)
MMP-2 este sintetizata si secretata ca
enzima inactiva, Dupa secretie, proMMP2
este legata de inhibitorul lui specifici
TIMP2.

Activarea MMP2 se face cu ajutorul

moleculei MT1- MMP (membrane type
MMP)= MMP de la nivelul membranei
celulare

MT1-MMP este capabila sa se lege de

TIMP 2, dar actioneaza asupra proMMP
(activarea de catre o enzima legata de
membrana celulara- determina o liza
controlata a MEC)

Legarea duce la clivarea a 2 polipeptide

specifice din proMMP2 si generarea unei
enzime active MMP2, care este inca
legata de TIMP2

Inactivarea MMP2 se face prin legarea

unei a 2-a molecule TIMP de situsul activ
ACTIVITATE PROTEAZICA
De exemplu- MMP2/ TIMP2 sunt necesari pentru
dezvoltarea CCN cardiace

CCN de Xenopus exprima numeroase MMP,

inclusiv ADAM, iar inhibitia acestuia determina
lipsa migrarii la nivelul CCN cegalice
Proteoliza MEC prin exprimarea diferitelor tipuri de MMP- MMP2 si ADAM,
dar si a MT-MMP la nivelul membranei celulare, ce permite activarea
proMMP
RUTELE DE MIGRARE
TEM determina delaminarea celulelor

In timpul migrarii, celulele sunt expuse unor

numerosi stimuli moleculari, secretati de zonele
pe care le traverseaza

Acesti stimuli le determina directia de migrare

prin polarizare si le impiedica sa paraseasca ruta
(prin prezenta de semnale inhibitoare la
marginile rutelor de migare)
CCN- cai de migrare
1.Laterala- pe sub ectoderm- formeaza celulele melanocite
2.Mediala, impartita la randul ei in 2 subcai:
a. profunda- via somite- da nastere neuronilor si celulelor
gliale ale ggl spinal si ggl simpatici, precum si parti din
MSR
b. de-a lungul axului corpului (dorsala), ce da nastere
neuronilor si celulelor gliale ale gl enterici
RUTELE DE MIGRARE- RESTRICTIE
LATERALA
Semnalele inhibitorii prezente la periferia rutelor
de migrare sunt oferite de 3 tipuri de molecule:

Efrine

Semaforine/ liganzii lor (neuropilina)

Slit/Robo
RUTA DE MIGRARE- RESTRICTIE
LATERALA

Aceste semnale genereaza un coridor prin care

migreaza CCN

Semnalele repulsive sunt exprimate diferentiat

de-a lungul axei corpului, iar receptorii de pe
suprafata CCN migratoare se modifica in functie
de zonele strabatute
EFRINE SI EPH R
Un rol important in migrare controlata in
embriogeneza il au efrinele si receptorii lor Eph-
R
Ambele se gasesc in membrana plasmatica a
celulelor
Eph R sunt tyrozin- kinaze, senzori la modificari
ale mediului EC, care sunt capabile sa transmita
info IC
Eph R- familie formata din 13 membri la
mamifere, impartiti in doua clase in functie de
caracteristicile legarii efrinelor:
A- EphA1- EphA8
B- EphB1- Eph B4, Eph B6
EFRINE SI EPH R
Liganzii Eph R se numesc Efrine
Exista de asemenea 2 clase
A- EA1- EA5- care sunt expuse pe versantul
extracitoplasmatic al membranei celulare
B- EB1- EB3- contin regiuni transmembranare si
citpolasmatice
Tipic- EphR A se leaga de EA so EphR B se leaga
de EB
EphA4 R are un spectru mai larg de legare- leaga
majoritatea EA, cat si EB2 si EB3
EFRINELE SI CRESTELE NEURALE
Celulele crestelor neurale care migreaza
exprima Eph R, in timp ce efrinele sunt
exprimate in teritoriile pe care CCN le evita in
mod normal

Crestele neurale cefalice- Efrina B2

Crestele neurale ale trunchiului- Efrine B in

jumatatea caudala a sclerotomului directioneaza
migrarea CCN prin jumatatea rostrala
SEMAFORINE
Proteine transmembranare, secretate, GPI
linkate
La om- 20 de semaforine grupate in 8 clase

Receptorii lor- neuropilin si plexin

SemaF3 si Sema3G sunt exprimate in zonele

extra- migratorii in zona craniala, in timp ce la

nivelul CCN se gasesc neuropilina 2a si 2b
Au rol in restrictionarea migrarii (impiedica

parasirea rutei)
SLIT/ROBO
Silt este o proteina secretata ce se leaga de
receptorul ei, Robo
Slit este exprimata la nivelul
dermatomiotomului, iar celulele migratoare
exprima Robo1 si 2
Slit2 respinge CCN migratoare, impiedica
celulele sa patrunda in calea dorsala
RUTA DE MIGRARE- SEMNALE
POZITIVE DE LA MEC

Proteinele MEC implicate- fibronectina, colagen,

laminina si vitronectina

Migrarea pe aceste substraturi depinde de

expresia moleculelor de adeziune la nivelul CCN
Proteinele matrixului extracelular, cum ar fi laminina, fibronectina si
tenascina, dar si colagenul si cateva molecule de proteoglicani sunt
implicate in migrarea directionata a CCN; nivelul de fibronectina si
laminina din MEC este foarte mare in tesuturile prin care migreaza
CCN si mici in cele in care se opresc.
GHIDAREA
Se face in primul rand prin marcajul rutei

Recent au fost identificati chemoatractanti

pentru CCN- un exemplu ar fi VEGF- ghideaza
CCN craniale la pui

Interactiunea repulsiva intre celule, intr-un

proces numit CIL (contact inhibiton of
locomotion) este una dintre cele mai importante
forte ce determina migrarea directionala
DIRECTIA DE MIGRARE
Pana in acest moment- celulele migreaza in ariile
permisive, fiind ghidate de molecule ce marginesc
aceste zone (cu rol repelent)

Cum se stabileste directia de migrare la nivelul

unei celule?

Cum se stabileste directia de miscare a masei de

celule?
STABILIREA DIRECTIEI DE
MISCARE A UNEI CELULE
Calea non- canonica Wnt/ PCP

Exista mai multe cai de semnalizare Wnt:

canonica si non- canonice

Dintre cele non- canonice- cele mai studiate sunt

PCP si Wnt- Ca2+

In migrarea celulara este implicata calea PCP =

cell polarity pathway
a. Calea canonica- semnalizare prin frizzled si LPR 5/6, ce induce
stabilizarea beta cateninei, via domeniile DAX si PDZ ale Dsh si o
multitudine de alti factori cum ar fi Axin, GSK3 si CK1; beta catenina
este translocata in nucleu, unde activeaza factorul LEF/TCF
b. Calea noncanonica PCP, se induce un semnal Wnt prin frizzled,
independent de LPR5/6. Se utilizeaza domeniile PDZ si DEP ale Dsh si
mediaza modificari citoscheletale prin activarea GTP-azelor Rho si Rac,
avand rol in miscare
PCP/ CALEA WNT NON- CANONICA
Multipli factori ai caii PCP- Fz, Dsh, Stbm sunt
localizati intr-o maniera polarizata, ducand la
polarizarea citoscheletului

Celulele polarizate migreaza pe fibronectina si

prezinta la polul migrator protruzii celulare
(lamelipodii si filopodii), iar la polul non-migrator
zone de adeziune focala si fibre de stress
S

Migrarea celulara directionata este dependenta de o secventa

dinamica de atasare/ detasare celulara de substrat (fibrele MEC)-
atasare la nivelul capatului ce directioneaza miscarea si detasare
la nivelul capatului opus.
Legatura celula- MEC- prin contactele focale (la polul nemigrator)
si adeziunile focale (la polul migrator)
Modificarile ce au loc la nivelul unei celule migratorii sunt
dependente de Rac1 si RhoA
Celulele migratorii adera la MEC prin contacte mediate de
integrine numite adeziuni focale si contacte focale; acestea sunt
puncte de ancorare ale fibrelor de stres, care reprezinta
manunchiuri de fibre de actina unite prin alfa actinina si miozina.
Miozina este asamblata in mini- filamente de miozina.
Efectul antagonic al Rho/ Rac1 determina asamblarea/
dezasamblarea punctelor de adeziune focala
Polarization of migrating NC in vitro. Scanning
electron micrograph of a Xenopus NC cultured in fibronectin.
The polarity of the cells can be easily distinguished, with large
lamellipodia and several fillopodia at the front of the cells and a
retracting protrusion at the back. Arrow indicates the direction
of migration.
Polarizarea CCN migratoare in vivo- cadre preluate la intervale de 3
minute
STABILIREA DIRECTIEI DE
MISCARE A MASEI DE CELULE
CCN migreaza in grup

Migrarea colectiva se realizeaza printr-o

colaborare intre celulele din masa migratorie

2 fenomene:
Inhibitia de contact a miscarii= procesul prin care
celulele isi schimba directia de miscare prin contactul
cu o alta celula
Atractia reciproca
CIL, chemotaxia si atractia reciproca,
colaboreaza pentru a promova migrarea
colectiva.

CIL este procesul prin care celulele care

se ating de alte celule din jur isi schimba
directia de miscare.
Acest lucru se intampla prin pierderea
filopodiilor si lamelipodiilor la locul de
contact (RhoA pozitiv) si exprimarea lor
la polul opus (Rac 1).

Intr-o masa celulara, in care celulele

centrale sunt inconjurate din toate
partile de alte celule, inhibitia de contact
determina pierderea completa a
prelungirilor in celulele centrale.

Celulele marginii anterioare sunt

singurele care determina directia de
miscare!
(A) CIL- celulele care se lovesc una de celalta isi schimba directia
de miscare. (B) Calea de semnalizare este PCP prin RhoA
inhibitia Rac1 (C) in miscarea grupat, CIL ajuta la directionarea
migrarii; initial CCN sunt grupate compact la nivelul crestei
neurale si inconjurate de semnale negative (albastru deschis) CIL
(galben) determina polarizarea celulara, determinand formarea
unei margini de celule conducatoare, dupa care se vor ghida resutl
celulelor din masa.
Migrarea este modulata de co-atractie, necesara pentru a
impiedica imprastierea celulelor determinata de cea din urma
Coatractia este mediata de molecule C3a si de receptorul sau
C3aR
SOARTA CCN
O intrebare fundamentala in medicina
dezvoltarii umane:

Sunt CCN o populatie omogena de celule stem

multipotente, a caror soarta este determinata
postmigrator prin exprimarea de molecule
semnal diferite la nivelul tesuturilor din jur?

Sau sunt o mixtura de precursori ale caror sorti

individuale sunt specificate prin mecanisme
intrinseci inaintea migrarii?
CCN- SOARTA
Majoritatea cercetarilor sustin prima teorie, insa
exista dovezi ca ar fi 2 populatii de CCN:

Subpopulatii restrictionate de celule precursoare

Celule stem multipotente

Soarta celor 2 tipuri este influentata de semnalele

din jur
ORARUL MIGRARII
Determinarea sortii CCN depinde si de
momentul in care se initiaza migrarea

La embrionul avian
Ultimul val migrator de CCN de la nivelul
trunchiului migreaza dorso- lateral si dau nastere
melanocitelor
CCN ce pleaca mai devreme migreaza ventral si dau
nastere neuronilor/ cel gliale
In populatia ce migreaza ventral- secventa conteaza
primul val migreaza profund si devin neuroni simpatici,
enterici si celule adrenale cromafine
Celulele tardive- neuroni si nevroglii din ggl spinal
ORARUL MIGRARII
Secventa migrarii este importanta si pentru
subpopulatiile functionale de neuroni senzitivi
din ggl spinal exista 2 valuri temporale de
neurogeneza
Neuronii proprioceptori si mecanoreceptori- in primul
val
Neuronii nociceptivi- al doilea val
Cauza ar fi expresia controlata a unor factori de
transcriptie
Ngn1 in timpul primului val
Ngn2 in timpul celui de-al doilea
SEMNALELE CE DETERMINA
SOARTA
Suntmolecule extracelulare
secretate initial in apropierea
celulelor premigratorii- prima
selectie- initiaza migrarea pe o
anumita ruta

Peparcursul rutei de migrare, noi

molecule sunt secretate, influentand
soarta CCN in etape succesive
WNT
Secretat timpuriu de catre ectodermul non-
neural pariticipa la inductia CN, dupa stabilirea
gradientului BMP

Secretat mai tarziu de catre tubul neural dorsal-

au rol in specificarea CCN de a deveni neuroni
senzitivi si celule pigmentare
BMP SI TGF BETA
Expresia BMP2, 4 si 7 regleaza diferentierea
neuronilor simpatici
lanivelul tubului neural dorsal si al ectodermului
non- neural adiacent- controleaza migrarea
La nivelul aortei dorsale sau a intestinului-
controleaza diferentierea

Expresia TGF regleaza diferentierea neuronilor

simpatici
In concentratie mare in ectodermul non- neural-
migrare
In concentratie mica in tubul neural si somite
Controleaza procesul de complex de diferentiere in timpul:
-Migrarii- secretat de tubul neural dorsal si de ectoderm (BMP4)
-Opririi la nivelul tesutului tinta- secretat de la nivelul aortei dorsale
(BMP2, 4, 7)