Curs 5 Formarea notocordului;

determinarea axelor corpului;

neurulatia

CONF. DR. B. VOICULESCU

 Notocord

formatiune mezodermala asezata pe linia mediana,

intre ectodermul si endodermul discului tridermic

apare in sapt. a 3-a (ziua 17- 20) in procesul de

gastrulatie, din celulele epiblastice selectate specific,
migrate la nivelul nodului primitiv (se numeste
cordomezoderm)

prezinta mai multe etape de dezvoltare

 Procesul notocordal

se formeaza din nodul primitiv si se extinde rostral

pana la placa precordala
la nivelul nodului primitiv apare o depresiune, ce se
extinde in interiorul procesului notocordal (inainte
un cordon plin) canal
canalul este inglobat in endoderm si podeaua lui
incepe sa se dezintegreze pe toata lungimea,
permitand prezenta unei comunicari temporare intre
cavitatea amniotica si vezicula ombilicala (canal
neurenteric).
 Placa notocordala

este un cordon axial care proeminã în tavanul

cavitãtii viteline secundare
se formeazã din tavanul procesului notocordal si
endodermul adiacent
prin detasarea de endoderm si formarea unei teci
proprii, placa notocordalã devine notocord definitiv,
iar endodermul tavanului cavitãtii viteline secundare
îsi va reface continuitatea.
 Notocord roluri

- rol inductor asupra placii neurale, prin secretia de

folistatin, chordin, noggin. Aceste molecule inhiba
exprimarea de BMP4, responsabila de inhibitia
transformarii celulelor ectodermale in celule neurale.
- rol inductor in somitogeneza- este acum general acceptat
ca atat notocordul cat si tubul neural ventral exprima
semnale pentru diferentierea si morfogeneza sclerotomului,
in timp ce tubul neural dorsal si ectodermul de suprafata
emit semnale pentru diferentierea dermatomiotomului.
Semnale aditionale necesare pentru anumite etape ale
miogenezei pot fi emise si de notocord (SHH).
 Notocord roluri

- geneza coloanei vertebrale. In timpul

embriogenezei, majoritatea celulelor notocordale
mor si sunt inlocuite de os in corpul vertebral si de
nucleul pulpos in discul intervertebral. Nu se stie
insa exact daca nucleul pulpos este format direct de
celulele notocordale.
Cateva cuiburi de celule notocordale persista in viata
adulta si pot fi gasite la baza craniului in 0,6- 2 % din
autopsii.
DETERMINAREA AXELOR
CORPULUI
 Determinarea axelor corpului

Asimetria expresiei moleculare duce la

asimetria organismului!

Intai se stabilesc axele dorso- ventrala si cranio-

caudala

Ultima este stabilita axa dreapta- stanga

 Axa dorso- ventrala

Determinarea polaritatii anteroposterioare are in

centru linia primitiva
Cei mai importanti factori responsabili de
dorsalizare sunt: chordin, follistatin si nodal, in
timp ce BMP- 2 si BMP- 4 au rol in ventralizare.
Alti factori cu rol in dorsalizare sunt: Lim-1,
goosecoid, noggin, Otx-1, Otx-2, activina, iar alti
factori cu rol in ventralizare sunt: GSK-3 ( glycogen
syntase kinase- 3), FGF-2, Wnt-3a.
 Polaritatea cranio- caudala

s-a demonstrat ca rol in determinarea acestei axe o

au aceiasi factori implicati in ventralizare si
dorsalizare

aranjarea centrilor organizatori de-a lungul axei

craniocaudale a liniei primitive depinde de expresia
genei Cripto, ce aprtine familiei EGF-CFC.
 Polaritatea cranio- caudala

Dezvoltarea si mentinerea centrului organizator al

capului necesita expresia genei Hox Lim- 1,
interactiunea ei cu HNF-3 (hepatic nuclear factor-3)
si inductia genelor Otx-1 si Otx- 2. Expresia genei
nodal este importanta in determinarea capului.
Centrul organizator al regiunii caudale este
determinat prin expresia genelor Wnt- 5a si Wnt- 5b.
 Axa si asimetria dr/ stg

Exista factori care determina specific dezvoltarea

unor structuri numai pe partea stanga.
Mutatiile acestor gene determina “situs inversus”
Esentiali pentru determinarea axei sunt
Nodal si antagonistul sau Lefty 1
La soarecii transgenici carora li se inhiba exprimarea
genei Nodal, se produce lipsa de formare a liniei
primitive, lipsa formarii mezodermului si moartea
embrionilor.
 Elementul declansator al asimetriei?

 Declansarea se face prin activarea caii canonice Shh,

care determina cresterea expresiei Nodal si Lefty 2
pe partea stanga

Cresterea concentratiei intracelulare a Ca2+

si activarea caii Shh sunt elementele
declansatoare ale asimetriei
Calea canonica Shh implica 2 proteine
importante:
1. Patched (Ptc) este o proteina
transmembranara ce reprezinta
receptorul pentru ligandul Shh
2. Smoothened (Smo), este proteina
ce transduce semnalul

- Daca Shh nu este legat de

receptor, Ptc leaga si inhiba Smo,
ceea ce duce la inactivarea unui
factor de transcriptie numit Ci la
Drosophila si Gli la vertebrate
- Daca Shh este legat de Ptc, se
activeaza Smo si determina la
randul sau activarea Ci/Gli, care
patrunde in nucleu si intiaza
transcriptia unor gene specifice
Calciul se elibereaza in partea stanga, unde se observa net
cresterea concentratiei lui
NP= placa notocordala
PS= linie primitiva
VN= nodul ventral
 Elementul declansator al asimetriei

Initial, Nodal este exprimat in partea stanga a

nodului primitiv si apoi in mezodermul lateral stang

Cresterea Nodal expresie genica in partea stanga

asimetrie
 Inhibitie Nodal in dreapta

Nodal determina cresterea propriei expresii printr-o

bucla de feed- back pozitiv
De asmenea determina expresia antagonistului sau
Lefty1 pe linie mediana
Acesta impiedica trecerea Nodal in dreapta
Se pare ca reglarea expresiei Lefty 1 se face prin
BMP, insa nu se stie cum
 Cum creste Ca2+- fluxul nodal

la soarece si probabil la om, la nivelul unei structuri

asezate dorsal (la soarece care s.n. nod ventral,
diferit de nodul primitiv, situat imediat ant de
acesta)- doua populatii de cili: unii motili si unii non-
motili
Cei motili se misca a.i. determina un flux al
lichidului extraembrionar dinspre dreapta stanga
Inversarea artificiala a fluxului determina inversarea
axei dr-stg!
Structura cililor nodali: au la baza complexul motor KIF3 si
dineina citoplasmatica 2, ce transporta bidirectional
particule pentru formarea lor
Cilii nodali NU AU microtubulii centrali, ceea ce le permite
sa efectueze o miscare rotationala, nu de pendul, ca in cilii
obisnuiti!!!!
 (A) Ultrastructures of normal cilia and primary cilia.

Hirokawa N et al. Cold Spring Harb Perspect Biol

2009;1:a000802

©2009 by Cold Spring Harbor Laboratory Press

 Miscarea cililor

Monocilul motil este asezat inclinat spre posterior la

45 grade fata de suprafata nodala
Suprafata nodului, fixa, genereaza rezistenta la flux
Miscarea este rotationala, initial spre dreapta, apoi
spre stanga
Din cauza rezistentei, miscarea spre dreapta
genereaza un flux ineficient
Fluxul nodal spre stanga este generat de inclinarea posterioara a
cililor nodali
A. Traiectoria varfului cililor (cercuri rosii pe elipsa alba) este
inclinata spre posterior, in comparatie cu radacina cilului
(cerc galben)
B. Microscopie electronica a nodului
C. Miscarea ciililor este rotationala. Suprafata nodala opune
rezistenta fluxului catre dreapta, care nu este eficient, deci
fluidul extraembrionar este impins catre stanga.
 Ipotezele functionarii fluxului nodal

Ipoteza 1- determina un gradient chimic intre partea

dreapta si cea stanga, iar celulele din partea stanga
“isi dau seama” in ce parte se afla
Ipoteza 2- fluxul reprezinta un stimul mecanic
asupra cililor imobili, pe care ii indoaie, rezultand
declansarea semnalului
Ipoteza 3- fluxul misca spre stanga particule
lipoproteice numite NVP, reponsabile de semnal
 NVP

De curand s-au identificat structuri veziculare

numite NVP, care au continut lipoproteic (nu se
cunoaste exact continutul)
NVP sunt sintetizate la nivelul celulelor nodale, iar
eliberarea lor de la nivelul epiblastului se face prin
Shh si FGF8
Cilii non- motili prezinta o miscare de “bici”, care
impinge NVP spre suprafata nodala stanga,
impreuna cu fluxul nodal
 NVP

La contactul cu celulele- NVP se sparg si elibereaza

molecule ce determina deschidere de can de Ca2+
creste Ca2+

Apoi, semnalul se extinde de la o celula la alta prin

miscarea IP6 prin jonctiuni GAP

Se detemina expresie de gene specifice partii stangi a

corpului
 Fenomene ce au loc pe partea stanga

Activarea caii Shh determina expresia Nodal si Lefty

2 pe partea stanga

Ele nu traverseaza bariera mediana datorita

factorului Lefty 1

Au loc 2 procese in partea stanga:

 Activarea factorului de transcriptie Pitx2
 Inhibitia genei Snail
NEURULATIA
 Neurulatia

Formarea tubului neural

tubul neural la vertebrate se dezvolta prin doua mecanisme

distincte: neurulatie primara si secundara.

Neurulatia primara, porneste de la un strat de celule epiteliale

care devin neuroepiteliale si formeaza placa neurala, care se cudeaza
sub forma plicilor neurale. Acestea se unesc ulterior si formeaza
tubul neural.
Neurulatia secundara porneste de la o populatie de celule
mezenchimale apartinand eminentei caudale, ce condenseaza si
formeaza cordonul medular (plin), care ulterior va evolua intr-un
tub
 Neuroepiteliu

celulele in care se transforma epiteliul ectodermal in

timpul neurulatiei, poarta numele de neuroepiteliu

celule stem neurale, pseudostratificate, din care vor

rezulta toate viitoarele celule ale sistemului nervos central

peretele tubului neural este format din celule

neuroepiteliale pseudostratificate, fusiforme, orientate
astfel: un capat este spre partea dorsala (viitoarea
suprafata ventriculara) si un capat spre cea ventrala
(viitoarea suprafata piala).
 Miscare interkinetica nucleara

Celulele incep sa prolifereze inainte de formarea tubului

neural, continua in timpul si dupa formarea acestuia

In timpul ciclului celular, nucleul fiecarei celule se

misca dinspre suprafata ventriculara spre cea piala si
invers, prin propriile extensii citoplasmatice, realizand
procesul de miscare interkinetica nucleara

Faza M are loc atunci cand nucleii se gasesc aproape de

suprafata ventriculara, iar faza S la polul opus.
In timpul fazei G2, nucleul este miscat
catre partea bazala, sub actiunea
constrictiei realizate de actomiozina si
motilitatea mediata de dineina.
Tpx2 organizeaza microtubulii apicali,
crescandu-le gradul de impachetarea,
pentru a promova migrarea apicala
In timpul fazei G1, nucleul se misca in
directie bazala prin 3 mecanisme:
-Nucleii sunt impinsi din zona apicala
de catre nucleii alaturati aflati in faza
G2
-Motilitate a microtubulilor mediata de
Kinezina 3
-Constrictie actomiozinica
 Inductia neurala

Procesul prin care tesuturile din jurul ectodermului

axial secreta factori ce ii determina diferentierea in
neuroectoderm la sfarsitul gastrulatiei; sursa de
factori inductori este mezodermul axial
(notocord si placa precordala)

Pionierii cercetarilor privind inductia neurala-

Spemann si Mangold- cercetatori germani
 Experimentul Spemann- Mangold

Experimentele se desfasurau pe specii de amfibieni

Se cunostea faptul ca celulele din regiunea dorsala a
embrionului (corespunzatoare nodului primitiv)
migreaza in timpul gastrulatiei si formeaza
notocordul
S si M realizeaza un transplant al unui fragment
dorsal din gastrula in partea ventrala a altei gastrule
Pentru a diferentia celulele, folosesc specii diferite
 Rezultat Organizatorul

Celulele transplantate formeaza un al doilea

notocord
Se dezvolta plici neurale supraiacent acestuia
Se obtine al doilea sistem nervos central
Amfibian cu 2 capete
Plicile neurale suplimentare nu se formeaza
din celulele donate, din cele ale primitorului
Tesutul transplantat a influentat soarta
celulelor ectodermale, transformandu-le in
tesut nervos
 Importanta experimentului

Cei doi definesc conceptul de “inductie” in

embriologie

Ei numesc acea portiune din partea dorsala a

embrionului – “organizatorul”

Din acest moment istoric al Embriologiei pornesc

cercetarile legate de formarea sistemului nervos
 Teoria clasica

 in care se considera ca tot ectodermul este sortit sa se transforme

in neuroectoderm, atunci cand asupra lui nu actioneaza nici un
factor inductor

 Inhibitia BMP in anumite arii determina transformarea tesutului

ectodermal in neuroectoderm

 Adeptii acestei teorii considera ca BMP este semnalul care

impiedica formarea neuroectodermului
Modelul clasic la Xenopus
Organizatorul este desenat cu rosu, mezodermul ventral cu roz, tesutul
neural cu albastru, epiderm cu galben si endodermul sacului yolk cu verde.
Organizatorul are rol inhibitor BMP4 prin secretia de antagonisti Chordin,
Noggin si Follistatin
Ectodermul prezinta o tendinta innascuta de a se diferentia in tesut neural
in lipsa BMP.
 Teoria complexa

Mai multi factori contribuie la inductia neurala

Se considera ca nu este suficienta inhibitia BMP,

insa aceasta ar fi esentiala

Un rol important este atribuit semnalizarii FGF, care

impreuna cu inhibitia BMP ar constitui semnalul
inductor
 Cãi de semnalizare 1
BMP

cea mai importantã teorie este inhibitia cãii BMP

stimularea cãii BMP produce diferentierea cãtre

tesut epitelial a ectodermului, iar inhibarea acesteia
determinã formarea neuroectodermului.

Exista o cascada de semnale care suprima activitatea

factorilor BMP4 si BMP 7 (bone morphogenic
protein), implicati in inductia neurala
 BMP

Chordin , noggin si follistatin sunt inhibitorii caii

BMP, actionand prin impiedicarea legarii acestor
proteine de receptorii specifici

BMP7 este distribuit initial în mezodermul paraxial

si ventral, adicent viitorului rombencefal.

Expresia BMP7 în mezoderm, determinã cresterea

ectodermului neural la Xenopus si pui.
 Cai de semnalizare 4
FGF

 Se pare ca inhibitia BMP + activarea FGF= inductie

neurala!!
 Supresia semnalelor BMP determina expresia FGF4,
care determina activarea unor gene reglatoare
numite Zic3
 Insasi supresia BMP activeaza direct gena Zic1
 Zic1 si 3 cresc la randul lor expresia factorului Sox2,
considerat un marker neural
 Cai de semnalizare 2
Wnt

Wnt- supraexpresia acestui factor determinã la pui

diferentierea ectoblastului în epiderm prin
fenomenul de stimulare a expresiei BMP; deci calea
Wnt necesita inhibitie pentru a participa la inductia
neurala
Inhibitorii caii Wnt sunt SFRP 2 si Dkk
 Cai de semnalizare 5
IGF

Insulin- like growth factor- produce de asemenea

inhibitia cãii BMP, cel putin experimental la
Xenopus.
 Neurulatia primara

Proces complex prin care o masa de celule

ectodermale dorsale, incepe sã se diferentieze pentru
a forma sistemul nervos.

Are mai multe stadii:

 Formarea placii neurale
 Modelarea placii neurale- are loc prin ingustarea si alungirea
acesteia in ax antero-posterior
 Formarea plicilor neurale
 Formarea tubului neural
 Placa neurala

 Ingrosare a ectoblastului, rostral de linia primitivã

Celulele ectoblastice sufera un proces de elongatie,
devenind columnare, pseudostratificate
Vizibilã pentru oarã în ziua a 19- a
La capãtul cranial, este mai latã, aici fiind locul de
aparitie a viitorului encefal, iar la capãtul caudal este
mai îngustã si dã nastere mãduvei spinãrii
Aproximativ 50 % din ectoblast devine placã neuralã,
iar restul va forma epidermul.
 Plicile neurale

indoirea placii neurale implica formarea unor

regiuni balama, la nivelul carora tubul neural se
leaga de tesuturile din jur

exista trei astfel de puncte balama: unul medial si

doua dorsolaterale

celulele punctelor balama adera de marginile libere

ale tubului neural si le trag catre linia mediana
 Celulele regiunii balama mediane

celulele punctului medial sunt derivate din placa neurala anterior de

nodul primitiv

aceste celule se ancoreaza la notocordul subiacent si formeaza o

regiune balama, care determina indoirea placii neurale pe linie
mediana, cu formarea unui sant longitudinal.

santul se formeaza datorita unor factori secretati de notocordul de

care adera celulele punctului medial, care determina modificarea
formei acestora, cu aplatizarea lor.

Celulele ce se gasesc lateral de regiunea mediana balama nu sufera

asemenea transformari.
 Regiunile balama dorsolaterale

La scurt timp apar alte doua regiuni, ce formeaza santuri

longitudinale, alcatuite din celule ce ancoreaza placa
neurala la ectodermul din jur.

Celulele punctelor balama dorsolaterale cresc in

inaltime si determina plierea crestelor neurale spre linia
mediana.

Modificarea formei celulare a regiunilor balama se

produce prin constrictie apicala si largirea regiunii bazale.

BMP inhiba formarea zonei balama
dorsolaterale

Noggin are rol stimulator, inhiband

BMP. Sursa Noggin- plicile neurale

Factorul M- stimuleaza formarea

zonei balama dorsolaterale.

De asemenea, Shh de la nivelul

notocordului si a placii alare are rol
inhibitor.
 Modificare formei celulelor
neuroepiteliale de la nivelul zonelor
balama dorsolaterale implica 2
mecanisme:
1. Constrictie apicala mediata de
microtubuli
2. Expansiune bazala reglata prin
ciclul celular, prin migatia
interkinetica nucleara
Celulele din zonele dorsolaterale sunt
elongate apical.

Celulele din zona balama mediana

sufera de asemenea acest proces,
insa in acelsi timp, se si scurteaza
apicobazal.
Celulele din zonele laterale (din
afara zonelor balama ) sunt
fusiforme.
 Plici neurale

Placa neurala se pliaza in jurul acestor regiuni

balama, fiecare din aceste regiuni se comporta ca un
pivot ce directioneaza rotatia celulara.

In afara de aceste forte intrinseci, actioneaza si forte

din exteriorul placii neurale, cum ar fi ectodermul de
suprafata care impinge placa neurala spre linia
mediana.
 Modificarile celulelor ectodermale

Celulele ectodermale devin din foarte aplatizate

Are loc o diviziune controlata orientata mediolateral

Ectodermul nonneural se alungeste rostrocaudal si se

expansioneaza medial

Aceste modificari imping neuroectodermul catre

medial, ajutand la plierea plicilor neurale si implicit
la inchiderea tubului
 Tubul neural

plicile neurale adera una de cealalta si celulele lor se

intrepatrund

Inchiderea santului neural nu are loc simultan de-a

lungul ectodermului.

Inchiderea se initiaza la om in mai multe puncte

situate pe axul antero-posterior si avanseaza cranial
si caudal
 Tubul neural

In regiune craniala, in care se va forma encefalul,

tubul neural se inchide mai precoce si prezinta
denivelari si constrictii ce vor forma
compartimentele creierului

In regiune caudala ramane un simplu tub, ce se

inchide progresiv

La capete se gasesc deschideri numite neuropori:

anterior si posterior, ce se vor inchide ulterior.
 Tub neural

Inchiderea tubului neural la om necesita o complexa

colaborare intre factorii genetici (gene PAX, sonic
hedgehog si openbrain) si factorii alimentari
(colesterol si acid folic).

Se estimeaza ca aproximativ 50 % din defectele de

inchidere a tubului neural pot fi prevenite prin
suplimetarea alimentatiei femeii gravide cu acid
folic.
 Tub neural

In final, tubul neural formeaza un cilindru inchis la

capete si se separa de ectodermul de suprafata.

Locul de fuziune a celulelor plicilor neurale este

caracterizat de prezenta unor structuri numite
lamelipodii

Aceste expansiuni celulare se interdigiteaza cu ale

celulelor vecine, ceea ce determina adeziunea si
fuziunea plicilor
 Separarea tubului de epiteliu

Ulterior are loc remodelarea epiteliului, acompaniata de

apoptoza, ceea ce duce la separarea celor 2 tipuri
celulare

Initial, celulele placii neurale exprima E- caderina si pe

masura ce procesul avanseaza se stopeaza expresia
acesteia, fiind inlocuita treptat cu N- caderina si N-CAM.

In final, tubul neural exprima numai N caderina, ceea ce

reprezinta semnalul de initiere a separarii
Expresia moleculelor de E caderina si N caderina in timpul
neurulatiei.
A. Dezvoltare normala- in stadiul de placa neurala, N caderina este
exprimata la nivelul neuroectodermului, iar E caderina la nivelul
epidermului nonneural.
In final, celulele ce contin N- caderina se separa de cele ce contin
E caderina
Crestele neurale nu contin nici E caderina, nici N caderina, ceea
ce le confera un fenotip migrator
B. Exprimarea E caderinei si N caderinei simultan la nivelul
neuroectodermului, determina lipsa separarii
 Neurulatie secundara

Neurulatia secundara porneste de la o populatie de

celule mezenchimale apartinand eminentei caudale, ce
condenseaza si formeaza cordonul medular (plin), care
ulterior va evolua intr-un tub

Cele doua modele de neurulatie sunt intalnite la diferite

specii de vertebrate, independent sau impreuna.
La pesti este exclusiv secundara, la pasari, partea
anterioara a tubului neural se formeaza prin neurulatie
primara, iar partea posterioara prin cea secundara.
 Neurulatie secundara

La embrionul uman, modelul este asemanator: partea initiala a

maduvei si encefalul urmeaza modelul neurulatiei primare, iar
partea terminala se formeaza prin neurulatie secundara din
eminenta caudala.

Neurulatia secundara debuteaza in stadiul 12 Carneigie (ziua 26) si

se termina in saptamana a 4-a, odata cu inchiderea completa a
tubului neural.

Prin acest proces se formeaza conul medular, filum terminale

si o dilatatie focala a canalului central, cunoscuta sub
numele de ventricul terminal (ventriculul V).
 Introducere in viitor

In momentul inchiderii tubului neural, semnalizarea din

tesuturile adiacente continua, determinand diferentierea
tubului neural

BMP4 de la nivelul ectodermului determina formarea placii

alare

Semnalizarea Shh de la nivelul notocordului determina

formarea placii bazale

Pattern-ul tubului neural pe linie antero- posterioara se face

prin existena gradientului acestor doi factori!!!
Gradient dublu:
-BMP 4 difuzeaza catre
ventral de la nivelul
regiunii dorsale mediane
-Shh difuzeaza catre dorsal
de la nivelul regiunii
ventrale mediane
-Identitatea neuronilor ce
se vor diferentia este
determinata de
concentratia celor doi
factori
-Celulele precursoare sunt
sensibile nu numai la
factori, ci si la
concentratiile lor