LUCRARE PRACTICA NR.

TEHNICA EXAMINARII MICROSCOPICE A PRODUSELOR PATOLOGIE

SI A CULTURILOR BACTERIENE
A. DIAGNOSTIC MICROBIOLOGIC DIRECT:
* EXAMINAREA MICROSCOPICA:
- rol orientativ sau decisiv pentru diagnosticul microbiologic
a) Preparat microscopic proaspat (preparat umed, intre lama si lamela):
- lame sticla, capat rodat (se scrie numarul probei, nume pacient),
- lame noi, curate, degresate (pentru lichide de punctie se imerseaza in alcool 96%),
- se usuca, se flambeaza (trecere prin flacara becului Bunsen de 2- 3 ori),
- se depune pe suprafata lamei, la mijlocul ei, o picatura din prelevatul patologic si se
acopera cu o lamela:
* produs patologic ca atare, de consistenta redusa: secretie vaginala, materii fecale,
- vizualizarea mobilitatii caracteristice a microorganismelor (Campylobacter, Vibrio) si
parazitilor (Trichomonas vaginalis, Giardia intestinalis),
* sediment obtinut in urma centrifugarii (in scopul concentrarii) prelevatelor patologice
lichide: lichide de punctie (LCR, lichid pleural, peritoneal, articular), urina,
- ca atare sau cu colorant (tus China, tus India),
- diagnosticul meningitei levurice cu Cryptococcus neoformans, la pacientii HIV+,
bolnavi de SIDA (coloratie negativa cu tus China),
* raclaj unghial in solutie KOH 20%, pentru vizualizarea levurilor (Candida albicans):
celule, filamente,
* identificare fungi filamentosi (cultura pe mediu Sabouraud),
- preparatele sunt examinate cu obiective 10X, 40X.
b) Preparate uscate, fixate si colorate (Frotiuri):
- frotiurile se prepara din produs patologic (lichid sau solid) sau din cultura bacteriana
(in mediu lichid sau solid),
- se folosesc lame de sticla cu capat rodat, noi, dezinfectate, degresate cu alcool 96%,
uscate si flambate (flacara becului Bunsen),
- efectuarea frotiurilor (etalarea produsului sau a culturii pe lama) se face cu ansa
bacteriologica (produs patologic solid sau cultura bacteriana pe mediu solid) sau pipeta
Pasteur (prelevat lichid sau cultura bacteriana in mediu lichid),
- se urmareste obtinerea unui frotiu subtire, unistrat,
- tehnica efectuarii frotiului in spirala (melc), centrifug,

* Tehnica efectuarii frotiurilor cuprinde mai multe etape:

1. Etalarea frotiului:
- lama de sticla, noua, dezinfectata, degresata,
- ansa bacteriologica se arde la rosu (incandescenta),
- se raceste in interiorul eprubetei sau a flaconului, pe peretele intern, la contactul cu
suspensia lichida sau in mediul de cultura, solid, in marginea placii Petri,
- se incarca bucla ansei cu produs sau cultura bacteriana si se descarca pe suprafata lamei
de sticla, in centrul ei,
- daca produsul patologic este de consistenta solida sau frotiul se efectueaza din cultura
bacteriana pe mediu solid, se omogenizeaza produsul intr-o picatura de ser fiziologic
steril,
- din produs patologic: puroi, sputa, materii fecale, se preleveaza cu ansa din portiunile
cele mai caracteristice: striuri sanguine, mucus, zone purulente,
- suspensia rezultata sa fie omogena si putin densa, astfel incat bacteriile sa apara la
examinarea microscopica izolate si in strat unic (unistrat),
- produsul patologic prelevat cu tamponul steril (secretie nazala, exudat faringian,
secretie vaginala sau uretrala, conjunctivala, otica): se descarca prin rotatie pe suprafata
lamei de sticla, in centrul ei, si, tot prin miscari de rotatie, se etaleaza frotiul in spirala,
centrifug (se pote umecta usor tamponul in ser fiziologic steril),
- se etaleaza produsul/ cultura bacteriana sub forma de spirala, in sens centrifug,
- nu se ating marginile lamei,
- se arde din nou ansa la incandescenta si se lasa la racit, intr-un stativ,
2. Uscare:
- lama cu fata in sus, langa becul de gaz,
- la temperatura camerei,
- nu se forteaza uscarea (uscarea brusca la temperatura ridicata altereaza structurile
celulare bacteriene),
3. Fixare:
- dupa ce preparatele sunt uscate,
- se face in doua scopuri:
* mareste aderenta preparatului pe suprafata lamei,
* pastreaza structura celulara a microorganismului,
- prin fixare, are loc coagularea proteinelor;
- se realizeaza fie prin caldura, fie cu fixatori chimici: alcool metilic, etilic, amestec
alcool- eter, alcool- fenol etc.,
- fixarea prin caldura nu conserva intrutotul structura celulara, dar pastreaza forma (cea
mai utilizata in obtinerea frotiurilor ce urmeaza a fi colorate),
- prin caldura: se trece frotiul prin flacara, cu prelevatul depus pe fata superioara,
incalzirea efectuandu- se pe fata inferioara,
- fixarea se realizeaza progresiv, pentru a nu se produce evaporarea brusca a apei din
celula (se sparge celula si pierdem morfologia si tinctorialitatea ei la colorare),
- dupa 2-3 treceri prin flacara, se verifica gradul de incalzire, prin atingerea lamei de
dosul palmei (temperatura de fixare nu trebuie sa fie mai mare decat cea suportata de
tegument),

- celulele bacteriene omorate prin fixare, prezinta o activitate tinctoriala (fixeaza

coloranti diferiti in structuri celulare cu compozitie diferita) mai mare decat la celulele
vii, impenetrabile la colorantii uzuali.
4. Colorarea frotiurilor:
- prin colorarea frotiurilor au loc interactiuni fizico- chimice intre coloranti si
componentele celulare,
- rezultatul colorarii depinde de structura chimica a colorantului, dar si de compozitia
chimica a componentelor structurale celulare,
- depinde de natura solventilor, de temperatura la care se face colorarea, si de valoarea
pH- ului,
S- a constatat ca odata cu incetarea activitatii metabolice a celulelor, care este
insotita de un anumit grad de denaturare a componentelor celulare, creste activitatea
tinctoriala (cauzele pentru care se realizeaza fixarea),
Dupa fixare sunt folositi mordanti (fixatori/ sol Lugol), in scopul de a pregati
suprafata bacteriana pentru o mai buna absorbtie si retinere a colorantilor.
Colorantii vizuali:
- cristal violet,
- violet de gentiana,
- fuxina bazica,
- albastru de metilen,
- verde malachit,
- albastru de toluidina,
Metode de colorare :
- metode de colorare simpla,
- metode de colorare dubla,
- metode de coloratii speciale (spori, capsula, cili, flageli etc).
a) COLORATIA SIMPLA: COLORATIA CU ALBASTRU DE METILEN:
permite orientarea rapida, informativa, asupra morfologiei bacteriene (prezenta
bacteriilor, forma, asezarea, prezenta PMN, relatia bacteriei cu acestea: intraextraleucocitar, prezenta levurilor, fungilor filamentosi etc),
- albastru de metilen este un colorant vital: datorita metacromaziei caracteristice,
permite nuantarea componentelor celulelor eucariote: celule epiteliale, leucocite,
limfocite, hematii etc),
- reactiv colorant: albastru de metilen 1%,
- Tehnica de lucru:
- frotiul uscat si fixat se acopera cu solutie de albastru de metilen 1%,
- se mentine cu colorantul 2- 3 minute, in functie de grosimea preparatului (frotiului),
- se spala cu apa de robinet,
- se usuca la temperatura camerei,
- se examineaza la microscop: bacteriile apar colorate in albastru inchis.

b) METODA COLORATIEI DUBLE, COLORATIE DIFERENTIALA

b. 1. COLORATIA GRAM
Reactivi necesari:
1. solutie de violet de gentiana 1%,
2. solutie Lugol (fixator/ mordant),
3. solutie alcool acetona (sol. decoloranta),
4. solutie fucsina bazica 1%, in dilutie 1/ 10 (dilutia se face pe lama, in momentul
utilizarii)
Tehnica de lucru:
- pe frotiul uscat si fixat se depune solutie violet de gentiana (sa acopere frotiul),
proaspat filtrata, fara precipitate, timp de 1- 2 min,
- dupa 2 min se varsa colorantul si se acopera frotiul cu solutie Lugol, 2- 3min,
- se indeparteaza sol Lugol si se decoloreaza cu sol alcool- acetona, pana cand
decolorantul se indeparteaza incolor de pe frotiu,
- operatia de decolorare se poate repeta de mai multe ori, fiind timpul cel mai important
al coloratiei Gram: permite diferentierea germenilor Gram + de cei Gram -,
- se spala cu apa de robinet (opreste decolorarea),
- recolorare cu solutie fucsina bazica 1%, dilutie 1/ 10, timp de 1-2 min,
- frotiul se spala apoi cu apa de robinet si se usuca la temperatura camerei,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
* Mecanismul coloratiei Gram are la baza compozitia biochimica diferita a peretelui
celular la bacteriile Gram + fata de cele Gram-:
- in structura peretelui celular la bacteriile Gram -, continutul crescut de lipide (care,
solubilizandu- se in alcool acetona, creste permeabilitatea peretelui celular) permite
pierderea violetului de gentiana si recolorarea ulterior cu fuxina.
- la Gram +, peretele celular are alta compozitie: predomina acidul muramic. In
timpul tratarii cu alcool acetona se deshidrateaza, permeabilitatea se reduce si violetul
de gentiana nu mai poate fi extras din celule.
* Tipuri de bacterii Gram (+)/ coci:
- genul Staphylococcus spp.,
- genul Streptococcus spp.,
- Enterococcus spp.,
* Tipuri de bacterii Gram (+)/ bacili:
- Listeria spp.,
- Bacillus spp., (B. anthracis)
- Clostridium spp., (Cl. tetani)
* Tipuri de bacterii Gram (-): coci:
- Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoese,
- Acinetobacter baumannii,
- Moraxella, Branhamella etc
* Tipuri de bacterii gram (-)/ bacili:
- E. coli, Salmonella, Shigella, Proteus, (Enterobacteriaceae),
- Haemophilus spp,

- Pseudomonas spp
* Bacterii Gram (+) la limita:
- Corynebacterium diphteriae (prin decolorare prelungita pierde violetul de gentiana
apare colorat in rosu, iar la o colorare obisnuita apare violet).
METODA COLORATIEI DUBLE, COLORATIE DIFERENTIALA
b. 2. COLORATIA ZIEHL NEELSEN
- evidentierea germenilor acido- alcoolo-rezistenti care apartin genului
Mycobacterium: tuberculosis, avium, bovis, leprae,
Reactivi:
- fucsina fenicata Ziehl 1%,
- decolorant combinat alcool acid (alcool etilic 96%/ 97 mL + acid clorhidric/ 3 mL),
- albastru metilen 1%.
Tehnica de lucru:
- frotiul uscat si fixat la caldura se acopera cu fucsina fenicata Ziehl 1%,
- se incalzeste dosul lamei cu flacara becului Bunsen sau cu un tampon inmuiat in
alcool si aprins, pana la emisia de vapori (nu se fierbe!!!),
- se raceste la temperatura camerei,
- se repeta de inca 2 ori incalzirea, completand cu fucsina daca este cazul, daca aceasta
scade prin evaporare, in total 10 min,
- dupa racire se spala cu apa de robinet,
- decolorare cu amestec alcool acid, 2-3 min,
- recolorare prin acoperirea frotiului cu albastru de metilen 1%, timp de 1 min,
- se spala cu apa de robinet,
- se usuca,
- se examineaza la microscopul optic, obiectiv cu imersie.
* Bacilii acido- alcoolo- rezistenti (BAAR) apar rosii pe fondul albastru.
* Ceilalti germeni si elementele tisulere (celule epiteliale, PMN, limfocite, fibrina) apar
colorate in albastru.
* Principiul coloratiei: se bazeaza pe rezistenta Mycobacteriilor la decolorarea cu acizi
minerali diluati si alcool, dupa colorare cu fucsina fenicata Ziehl;.
- Colorabilitatea depinde de varsta culturii, mediul de izolare, prezenta in produsul
patologic a medicamentelor tuberculostatice.
- Si alte bacterii sunt acido- alcoolo rezistente : Nocardia, Actinomices
* Mecanismul colorabilitatii: patrunderea fucsinei fenicate Ziehl in interiorul bacteriei si
legarea colorantului de ACIDUL MICOLIC (din invelisul peptidoglicolic) al peretelui
celular, prin legaturi stabile, legaturi care confera suprafetei celulei caractere
hidrofobe.
Se pare ca Mycobacteriile patogene sunt mai bogate in acid micolic (mai rezistente la
decolorare, mentin culoarea rosie pe frotiu) decat cele nepatogene- saprofite (contin putin
acid micolic in perete, nu rezista la decolorare, apar albastri pe frotiu/ Mycobacterium
smegmatis).