Organizarea structural i funcional a celulei animale

Nucleul Membrana plasmatic Mitocondria Organite implicate n sinteza i transportul macromoleculelor:

Reticulul endoplasmic Aparatul Golgi

Organite implicate n degradarea intracelular a macromoleculelor:

Lizosomii

Citoscheletul

NUCLEUL

NUCLEUL Caracterizare general

Nucleul este cel mai voluminos organit al celulei EK (6-10% din volumul celulei) Nucleul ndeplinete funcii fundamentale pentru existena celulei: Stocarea i transmiterea informaiei genetice de la o celul ctre celulele descendente, pe parcursul diviziunilor celulare succesive Controlul activitii celulare (nucleul controleaz funciile metabolice ale celulei prin reglarea transcrierii genelor)

Nucleul
Nucleus, nuculeus smbure, lb.latin Robert Brown 1831 - Robert Brown (botanist scoian) (17731858) a efectuat studii de microscopie optic pe esuturi vegetale i a descris n detaliu aceast formaiune intracelular; a enunat conceptul de celule nucleate. Din punct de vedere morfologic nucleii din diferite tipuri de celule prezint variaii privind mrimea i forma. Forma cea mai comun este cea sferic-elipsoidal. De regul nucleul ocup n celul o poziie central. n cadrul organismului uman exist i celule anucleate (eritrocitele mature, trombocitele). n nucleu exist 3 categorii majore de molecule: ADN, ARN i proteine.

Forma cea mai comun este cea sferic-elipsoidal.

Celule anucleate

Excepii: Nuclei cu aspect lobat

 De regul nucleul ocup n celul o poziie central.

Nuclei

Celule din esutul hepatic (hepatocite)

Nucleu

Excepie:
Nucleu poziionat periferic

Celul din esutul adipos (adipocit)

Nucleul este un organit dinamic din punct de vedere al organizrii structurale

Nucleul prezint dou tipuri de organizri structurale distincte, corespunztoare celor dou faze majore ale ciclului celular: n interfaz nucleul este bine individualizat, delimitat de nveliul nuclear, nucleolii sunt vizibili, cromatina este dispersat. n mitoz nucleul sufer modificri complexe: condensarea cromatinei sub form de cromozomi, dezorganizarea nveliului nuclear i dispariia nucleolilor.

Ciclul celular

I interfaz M - mitoz

Cromozomi i nuclei

Organizarea structural a nucleului prezint dou aspecte fundamentale, ce sunt eseniale pentru nelegerea funciei acestui organit: Nucleul prezint subcompartimente distincte Nucleul este un organit dinamic

Structura nucleului n interfaz

EC eucromatina Hc heterocromatina

nucleol

G pars granulosa F pars fibrosa

nveliul nuclear
Este format din dou membrane concentrice: membrana nuclear extern membrana nucler intern ntre cele dou membrane este delimitat spaiul perinuclear. Spaiul perinuclear comunic cu lumenul reticulului endoplasmic (RE). Membrana nuclear extern are ataai ribosomi pe faa sa citoplasmatic (la fel ca i membrana RE).

Porul nuclear:

structura i rolul n transportul

moleculelor ntre nucleu i citoplasm

- Porii nucleari au fost identificai n nveliul nuclear la toate celulele

eucariote. Numrul de pori nucleari din nveliul nuclear al celulelor de mamifere variaz ntre 3.000 i 4.000.

- Porul nuclear este un edificiu multimolecular cu structur

complex, cu masa molecular de 125x106 daltoni, alctuit din 50 de tipuri diferite de proteine numite nucleoporine.

1 nveli nuclear

2 componenta inelar extern 3 componenta central 4 fibrile convergente 5 fibrile paralele

Complexul porului nuclear prezint la microscopul electronic aspectul unui poligon cu opt laturi organizat n jurul unui canal central (simetrie octogonal).

9-26 nm

Imagini de microscopie electronic i modele computerizate ale structurii complexelor porilor nuclear.

Structura porului nuclear

(a) subuniti dispuse sub form de coloane ce formeaz peretele porului (b) subuniti centrale, fixate de peretele porului, ce delimiteaz deschiderea porului (c) subuniti transmembranare ce ancoreaz complexul n membrana nuclear (d) subuniti dispuse circular pe cele dou fee ale complexului, faa nuclear, respectiv faa citosolic, i care sunt plasate la capetele coloanelor.

Structura porului nuclear

Citosol

De pe cele dou fee ale complexului porului nuclear se extind o serie de fibrile, cele dinspre citosol cu dispoziie paralel, iar cele de pe faa nuclear cu dispoziie convergent. n regiunea central a porului exist o reea fibrilar ce blocheaz difuzia pasiv a macromoleculelor de dimensiuni mari.
Lumenul nucleului

Transportul prin porii nucleari

Fiecare por nuclear poate transporta 500-1000 de molecule per secund, n ambele sensuri. Modul n care se realizeaz coordonarea acestui trafic bidirecional al moleculelor, astfel nct s se evite coliziunile i colmatarea porilor este nc neelucidat. ntruct controleaz traficul moleculelor ntre nucleu i citoplasm, porii nucleari joac un rol fundamental n controlul funciilor celulare.

Fenomenele de transport ce se desfoar la nivelul porilor nucleari sunt de dou tipuri: difuzia pasiv pentru moleculele mici, transportul activ (proces care necesit consum de energie) pentru moleculele de dimensiuni mari.

 Transportul macromoleculelor este selectiv i se desfoar bidirecional, dinspre citoplasm spre nucleu (import) sau dinspre nucleu spre citoplasm (export). Importul este mediat de semnale de localizare nuclear (NLS, nuclear localization signal or sequence) Exportul este mediat de semnale nucleare de export (NES, nuclear export signal).

Semnalele de localizare nuclear (NLS)

Secvenele de aminoacizi ce funcioneaz ca semnale de localizare nuclear sunt nscrise n structura proteinei ce urmeaz s fie transportat n nucleul i formeaz bucle sau aglomerri pe suprafaa proteinei (pentru a fi accesibile interaciunii cu receptorii nucleari specifici). Secvena de aminoacizi ce determin localizarea nuclear nu este identic pentru toate proteinele nucleare (nu exist o secven unic). Primul semnal de localizare nuclear descifrat a fost cel al antigenului T al virusului SV40 (protein viral necesar pentru replicarea ADN-ului viral n nucleul celulei infectate) i const ntr-o secven de aminoacizi bogat n Lys, n urmtoarea succesiune: Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val

Detectarea localizrii antigenului T al SV40 (prin tehnica de

imunofluorescen). Proteina (antigenul T) ajunge n nucleu doar n condiiile n care semnalul de localizare nucler este corect (A). Modificarea semnalului de localizare nuclear nu permite transportul n nucleu, astfel nct antigenul T rmne n citoplasm (B).

Figure was taken from Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Pub., N.Y. 1994, Fig 12-13.

Vizualizarea importului proteinelor nucleare sintetizate n citoplasm, la nivelul porilor nucleari Imagine de microscopie electronic prezentnd ptrunderea n nucleu a unor particule sferice de aur coloidal nvelite cu proteina nuclear numit nucleoplasmin (porii nucleari sunt marcai cu rou).

Lamina nuclear
Lamina nuclear este o reea de natur proteic cu aspect fibros situat sub membrana nuclear intern, ce formeaz suportul structural al nucleului (menine forma i d stabilitate nveliului nuclear).

 Ataarea laminei de nveliul nuclear se realizeaz prin intermediul unor proteine din membrana nuclear intern i prin ataare de complexele porilor nucleari. Lamina nuclear interacioneaz direct i cu cromatina, funcionnd astfel ca punte de legtur ntre ADN i nveliul nuclear. Reeaua de filamente este alctuit din proteine numite lamine nucleare, ce reprezint o clas special de proteine. Lamina nuclear este o structur dinamic ce se dezorganizeaz la intrarea n mitoz i se reorganizeaz la sfritul mitozei, odat cu refacerea nveliului nuclear.

Lamina nuclear este o structur dinamic ce se dezorganizeaz la intrarea n mitoz.

Progeria
Maladie genetic extrem de rar (1 din 8 milioane de indivizi), caracterizat prin apariia semnelor de mbtrnire la vrste timpurii (mbtrnire accelerat); Determinat de mutaii ale genei ce codific un anumit tip de lamin nuclear denumit lamina A.
Hayley Okines

Matricea nuclear
Studiile privind organizarea intern a nucleului au condus la identificarea unei reele de natur proteic numit matrice nuclear, alctuit din proteine denumite proteine scaffold. Filamentele matricei nucleare sunt dispuse ntr-o reea tridimensional ce formeaz n interiorul nucleului o structur cu rol analog citoscheletului. Matricea nuclear reprezint sediul unor procese importante ca replicarea ADN i procesarea precursorilor mARN (ARN nuclear heterogen - hnARN). Macromoleculele de ADN se fixeaz de proteinele scaffold prin intermediul unor secvene polinucleotidice numite regiuni de ataare la scaffold (SAR, scaffold associated regions) sau MAR (matrix-attachment regions). Dei rolul secvenelor SAR nu este foarte bine precizat se consider c particip la organizarea cromozomilor i la reglarea transcrierii i replicrii ADN.

Macromoleculele de ADN se fixeaz de proteinele scaffold (care formeaz un ax de susinere), prin intermediul unor secvene polinucleotidice numite regiuni de ataare la scaffold (SAR, MAR).

Proteinele scaffold joaca un rol important in condensarea cromozomilor.

Nucleul n interfaz

Cromatina

Cromatina
Cromatina reprezint complexul format de ADN-ul nuclear cu histone i proteine cromozomale nehistonice. Etimologie: chroma culoare, lb. greac. Examinarea nucleilor n interfaz prin tehnici de microscopie, relev aspectul neomogen al cromatinei, fiind evideniate dou tipuri distincte: eucromatina (cromatina adevrat, de la eu n limba greac) i heterocromatina (cromatina diferit, de la heteros n limba greac). Heterocromatina este o form de cromatin nalt condensat i inactiv din punct de vedere transcripional (netranscriptibil), avnd o pondere de circa 10% din genom, n timp ce eucromatina este o form de cromatin mai puin condensat i activ din punct de vedere transcripional (conine secvene de ADN ce sunt transcrise).

Eucromatina
corespunde zonelor clare

1928 Emil Heitz (botanist german)

Heterocromatina
corespunde zonelor ntunecate

 Heterocromatina poate fi clasificat la rndul ei n dou tipuri: heterocromatin constitutiv, form n care cromatina rmne permanent condensat i care conine secvene de ADN ce nu sunt transcrise, i heterocromatin facultativ, form de cromatin condensat care nu este transcris, cu meniunea c fie s-a fcut transcrierea ntr-o perioad anterioar, fie se va face ulterior dac heterocromatina se va transforma n eucromatin sub aciunea unor factori specifici. Heterocromatina constitutiv apare n nucleul interfazic sub forma unor aglomerate localizate la periferia nucleului i n jurul nucleolilor. Heterocromatina facultativ apare numai n anumite tipuri de celule.
Heterocromatina facultativ a fost descris n cazul inactivrii unuia dintre cei doi cromozomi X n nucleii celulelor somatice de mamifere, la organismele femele, n cursul dezvoltrii embrionare timpurii.

Heterocromatina facultativ
Inactivarea cromozomilor X. n faze embrionare timpurii unul din cei 2 cromozomi X (la organismele femele) devine inactiv prin condensare (corpuscul Barr). n celulele descendente rmne condensat acelai cromozom X.

Organizarea structural a cromatinei i nivelurile de compactare

Macromoleculele de ADN se asambleaz cu histonele i proteinele cromozomale nehistonice ntr-o manier nalt ordonat ce permite un grad mare de compactare a ADN-ului. Raportul de condensare specific interfazei este de 500X. n condiiile de maxim condensare din cursul diviziunii nucleare (metafazei) raportul de condensare este de 10.000X. Lungimea ADN n celulele organismului uman este de aprox. 2 metri, iar nucleul Interfazic are un diametru de 20-60 m.

Histonele
Histonele sunt un grup de proteine de mici dimensiuni, cu caracter bazic (datorat prezenei n structura lor a unui numr mare a resturi de Lys i Arg). Aceast proprietate favorizeaz asocierea lor de ADN prin atracie electrostatic, de gruprile fosfat din coloanele glucido-fosforice ale catenelor polinucleotidice. Interaciunea histonelor cu ADN-ul nu este influenat de secvena de nucleotide a ADN. n celulele eucariote au fost identificate cinci tipuri principale de histone: H1, H2A, H2B, H3 i H4.

Interaciunea histonelor cu ADN-ul este de natur electrostatic

Lys

Arg

ADN

Structura nucleosomal (fibra de cromatin de 11 nm)

Structura nucleosomal reprezint primul nivel de compactare al cromatinei. Organizarea sub form de nucleosomi este rezultatul asocierii ADN cu histonele nucleosomale: H2A, H2B, H3 i H4. n imaginile de microscopie electronic nucleosomii apar sub forma unor particule discoidale de 11 nm, ce dau cromatinei aspectul unui irag de mrgele.

Nucleosomul
Nucleosomul conine un miez proteic format din 8 molecule de histone (octamer de histone) de forma unui cilindru turtit cu diametrul de 11 nm i nlimea de 5,5 nm, nconjurat de 1,65 ori de ADN-ul dublu catenar (rsucirii de 1,65 ori n jurul miezului de histone i corespunde o secven polinucleotidic de 147 perechi de nucleotide). Miezul de proteine al nucleosomului (octamerul de histone) are cte dou copii ale histonelor H2A, H2B, H3 i H4, numite histone nucleosomale. Nucleosomul nu conine proteine nehistonice. Histona H1 nu face parte din structura nucleosomului.

Structura nucleosomului

 Particulele nucleosomale succesive sunt separate prin secvene de ADN spaiator scurt ce poart numele de ADN de legtur sau ADN linker, a cror lungime poate s varieze ntre 18 i 80 de perechi de nucleotide (valoarea medie este de circa 50 perechi de nucleotide).

Formarea structurilor nucleosomale scurteaz lungimea macromoleculelor de ADN dublu catenar de 3 ori:

Structura solenoid (fibra de cromatin de 30 nm)

Acest mod de mpachetare se realizeaz prin rsucirea a ase nucleosomi ntr-o structur spiralat numit solenoid. mpachetare strns este posibil att datorit implicrii histonei H1 (histon linker), ct i interaciunilor dintre nucleosomii adiaceni.

Pentru fiecare spir a solenoidului 6 histone H1 se asociaz cu 6 particule nucleosomale.

Nivelurile superioare de compactare ale cromatinei

Nivelul urmtor de mpachetare corespunde organizrii fibrei de cromatin de 30 nm sub form de bucle de 300nm fixate de un miez proteic de natur non-histonic, de tip scaffold.

 Nivelul maxim de condensare a cromatinei corespunde unor bucle super-rsucite cu dimensiunea de 700nm (dimensiunea cromatidei cromozomului mitotic).

n concluzie, formarea cromatinei prin asocierea i mpachetarea nalt ordonat a ADN-ului cu histonele i cu alte proteine cromozomale este important att pentru compactarea ADN-ului pn la nivelul maxim reprezentat de comozomul metafazic, ct i pentru reglarea accesului la secvene specifice de ADN n cursul transcrierii i replicrii.

Nivelurile de mpachetare (condensare) ale cromatinei

n nucleul interfazic eucromatina este prezent sub forma fibrei de 11 nm i parial sub forma fibrei de 30 nm.

I interfaz M - mitoz

CROMOZOMII
n momentul intrrii celulei n mitoz cromatina se condenseaz sub form de cromozomi, structuri vizibile la microscopul optic. Aceast condensare puternic este necesar pentru a permite micarea cromozomilor de-a lungul fusului mitotic, fr ca macromoleculele de ADN s se ncolceasc sau s se rup n timpul distribuiei n celulele fiice.

 Cromozomii sunt formai din ADN i proteine, n proporii aproximativ egale. Componenta proteic este un amestec heterogen de proteine, dintre care pot fi menionate histonele, proteinele scaffold, i o serie de enzime implicate n replicarea ADN i n transcriere (ADN- i ARN-polimerazele). Dup ieirea din mitoz, cromozomii individuali se decondenseaz ocupnd anumite zone bine delimitate n interiorul nucleului interfazic numite teritorii cromozomiale. Fiecare cromozom este format dintr-o molecul liniar de ADN. Un cromozom opereaz ca o unitate structural distinct, astfel nct o copie a fiecrui cromozom s fie transmis fiecreia dintre celulele fiice.

Teritorii cromozomiale
Dup ieirea din mitoz, cromozomii individuali se decondenseaz ocupnd anumite zone bine delimitate n interiorul nucleului interfazic numite teritorii cromozomiale.

Cromozomii
n momentul n care ncepe diviziunea celular fiecare cromozom este alctuit din dou uniti longitudinale numite cromatide.

Cromatidele sunt libere pe toat lungimea lor, cu excepia unui singur punct de contact numit centromer sau constricie primar.

p - braul scurt

Centromer

q - braul lung

Cromatide surori

Structura cromozomilor
Un cromozom funcional prezint 3 tipuri de secvene specializate de ADN: origine a replicrii reprezint secvenele nucleotidice de unde ncepe replicarea ADN. centromer (constricie primar) reprezint regiunea specializat a cromozomului ce asigur adeziunea celor dou cromatide, ancorarea i deplasarea cromozomilor de-a lungul fibrelor fusului de diviziune i segregarea corect a cromatidelor n timpul diviziunii celulare. n timpul diviziunii mitotice la nivelul centromerului se formeaz tranzitoriu o structur proteic complex numit kinetocor. telomere secvene de la capetele cromozomului ce confer stabilitate cromozomilor i mpiedic asocierea lor.

Kinetocorul

Kinetocorul are aspectul unui disc multilamelar i reprezint locul de ataare al cromozomilor de microtubulii fusului de diviziune. Pentru fiecare dintre cele 2 cromatide se formeaz un kinetocor.

Celul uman n diviziune: microtubulii fusului de diviziune (verde), cromozomii (albastru), kinetocorii (roz).

Cromozomul are 2 tipuri de brae: p - braul scurt (petit) i q - braul lung

(1) cromatid; (2) centromer; (3) braul p; (4) braul q

Telomere

Telomerele protejeaz informaia genetic n timpul diviziunii celulare. Telomerele se scurteaz pe parcursul diviziunilor celulare succesive.

Genomul reprezint cantitatea de material genetic ce definete zestrea ereditar a unui organism. Cariotipul reprezint totalitatea cromozomilor unui celule, dispui ntr-un set complet (caracteristic unui individ sau unei specii) i ntr-un anumit aranjament. Realizarea cariotipului const n aezarea cromozomilor microfotografiai dintr-o celul (n metafaz) n ordinea descresctoare a dimensiunii lor n perechi omoloage.

Cariotipul uman
Conform Standardului Internaional de Nomenclatur Citogenetic, cariotipul uman este redat prin numrul total de cromozomi (46) urmat de formula comozomilor de sex (XX pentru femeie i XY pentru brbat), de exemplu 46, XX i respectiv 46, XY. Cariotipul uman are 23 de perechi de dintre care 22 perechi de autozomi i o pereche de heterozomi (cromozomii ce determin sexul unui organism, denumii i gonozomi). Cariotipurile sunt studiate pentru a determina aberaiile cromozomiale.

Cariotip normal de brbat 46, XY

Cariotip de femeie (46, XX)

Cromozomii au fost marcai fluorescent cu fluorocromi de diferite culori. Datorit marcrii fluorescente difereniate toate perechile de cromozomi pot fi vizualizate i identificate simultan.

Aberaii cromozomiale
Exist 2 categorii principale de aberaii cromozomiale:
Numerice Structurale

Anomaliile numerice presupun pierderea i/sau ctigul unui cromozom ntreg sau a mai multor cromozomi. Cea mai comun anomalie numeric autozomal este trisomia 21 (Sindromul Down). Cea mai frecvent anomalie numeric heterozomal (a cromozomilor de sex) este sindromul Klinefelter (47, XXY).

Anomalii numerice autozomale Sindromul Down (Trisomia 21 - prezena unei extra copii a cromozomului 21, o celul are 3 n loc de 2 copii ale cromozomului 21 n nucleu)
Incidena (1: 1000 nou-nscui) Trsturi fizice caracteristice: corp scurt i ndesat, faa turtit, urechi cu aspect modificat, dini atipici, aspect facial mongoloid, tonus muscular sczut Retard mintal moderat Factori de risc: vrsta naintat a prinilor, istoricul familial de sindrom Down

Anomalii ale cromozomilor de sex (heterozomi, gonozomi)

Sindromul Klinefelter (47,XXY) - anomalie cromozomial numeric, cu o inciden de aproximativ 1:600 / 1:800 nou-nscui de sex masculin ce rezult din prezena unui cromozom X suplimentar la sexul masculin.

Nucleul n interfaz

Nucleol

NUCLEOLUL
Nucleolul este o formaiune intranuclear decelabil n interfaz (vizibil la microscopul optic). Nucleolul este sediul producerii subunitilor ribosomale. Nucleul celulelor somatice umane conine n mod obinuit cte un nucleol pentru fiecare set de cromozomi, astfel c majoritatea celulelor umane somatice (diploide) prezint doi nucleoli. Nucleolul nu este delimitat de membrane, ci este organizat n aria regiunilor cromozomale ce conin gene codificatoare pentru ARN-urile ribosomale.

Morfologia nucleolului
Din punct de vedere morfologic n nucleol au fost evideniate trei regiuni distincte: centrul fibrilar zona fibrilar dens zona granular Genele pentru rARN sunt localizate i transcrise n centrul fibrilar i n zona fibrilar dens. Prelucrarea rARN i asamblarea cu proteinele ribosomale este iniiat n zona fibrilar dens i continu n zona granular unde se formeaz subunitile ribozomale, gata de a fi exportate n citoplasm. Mrimea nucleolului depinde de activitatea metabolic a celulei.

Imagini de microscopie electronic (fibroblast uman): (A) nucleul (B) nucleolul

Tehnici de vizualizare a nucleului:

1. Microscopia optic
- microscopia optic convenional - microscopia de fluorescen - microscopia cu contrast de faz 2. Microscopia electronic - Transmisie (TEM) - Scanning (SEM)

Imagine de microscopia electronic (TEM)

Imagine de microscopia electronic (SEM)

Vizualizarea cromozomilor mitotici prin microscopie optic convenional

Imagini de microscopie de fluorescen

Imagini de microscopie de fluorescen

Coloraie Hoechst

Coloraie DAPI

CONCLUZII
Morfologia nucleului prezint dou aspecte fundamentale: 1. Nucleul prezint compartimente distincte la nivelul crora se desfoar procese specifice, 2. Nucleul este un organit dinamic, cu dou tipuri de organizri structurale i funcionale, corespunztoare celor dou faze majore ale ciclului celular.