Sunteți pe pagina 1din 31

Biologie celulara si moleculara

CAPITOLUL 9
NUCLEUL ORGANIZAREA I ROLUL NUCLEULUI
Componentele invelisului nuclear si rolul acestuia n transportul

moleculelor intre nucleu i citoplasm

Organizarea intern a nucleului

Structura i funciile nucleolului

Rolul nucleului i organizarea informaiei n celulele eucariote

Nucleul este structura caracteristic celulelor eucariote i are n structur urmtoarele


componente:
1. nvelisul nuclear (membrane, lamina nuclear, complexul porilor)
2. Nucleol
3. Carioplasma (matricea nuclear)
4. Cromatina

Nucleul are forme diferite n raport cu forma celulei astfel la celulele sferoidale este
sferic, la cele alungite elipsoidal, la celulele turtite discoidal etc.
n celulele cu activitate crescut de sintez a proteinelor nucleul are forme foarte
diferite fiind chiar ramificat (glandele sericigene ale fluturilor). n marea majoritate a
cazurilor, celulele au un singur nucleu, dar se pot gsi i celule binucleate (condrocitele
cartilajului costal de cobai, hepatocitele, neuronii simpatici; megacariocitele i osteoclastele
au i ele mai muli nuclei.
Hematiile mamiferelor sunt n schimb anucleate.
Volumul nucleului este proporional cu al celulei, iar nucleii aceluiai esut de la
indivizii aceleiai specii au mrimi constante. n multe cazuri au loc i endomitoze
(multiplicarea numrului de cromozomi, fr s se dezorganizeze membrana nucleului) n
urma crora nucleii nedivizai au un volum mai mare, corespunztor gradului de ploidie (n
ficat, neuronii Purkinje, esutul excitoconductor al inimii).
1. Inveliul nuclear este o structur complex fiind alctuit din dou membrane
nucleare, o lamin nuclear i complexul porilor nucleari (NPC).
Nucleul este nconjurat de 2 membrane concentrice: membrana intern i membrana
extern. Membrana extern se continu cu reticulul endoplasmatic, astfel nct spaiul spatiul
dintre membranele nucleare (extern i intern) comunic direct cu lumenul reticulului
endoplasmatic.
Membranele nucleare sunt asociate cu enzime ale reticulului endoplasmatic i sunt
similare functional cu membranele RE. De asemenea, pe membrana nuclear extern sunt
ataai ribozomii, spre faa citoplasmatic.

Note de
curs1
Biologie celulara si moleculara

Aceste membrane sunt bistraturi fosfolipidice nucleare ce se unesc la nivelul porilor


nucleari i formeaz canale prin care circul moleculele mici polare ct i unele
macromolecule.
Lamina nuclear aflat sub membrana nuclear intern, este o reea fibroas care
formeaz suportul structural al nucleului. La majoritatea organismelor, n special mamifere,
lamina nuclear este alctuit din patru proteine fibroase, lamina A, B1, B2, C (60-80kd).
Laminele se leag la proteinele membranare integrale, care contribuie la organizarea in
reea a filamentelor de lamin i mediaz legarea lor la membrana nuclear intern (Figura
9.1).

Figura 9.1 Organizarea nveliului nuclear


Se presupune c lamina nuclear pe lng faptul c are rol de suport, prezint i situsuri
de legare a cromatinei. n interiorul nucleului cromatina este organizat n bucle mari de
ADN dintre care unele par legate la nveliul nuclear.

Complexul porului nuclear (porii nucleari, porosomi)


Este alctuit dintr-un ansamblu de 8 coloane (subuniti anulare) dispuse n jurul
canalului central. Acestea prezint prelungiri sub form de fibrile nspre citoplasm, dar i
spre nucleu unde formeaz coul nuclear, la captul cruia se afl un disc (Figura 9.2).
Pe lng canalul central exist alte 8 canale mai mici ntre spie. Aceste canale deschise
au un diametru de maxim 10nm i servesc pentru difuzia moleculelor mici.
Porul este un complex structural cu un diametru de 80-120 nm i o mas molecular de
circa 125 milioane daltoni, de 30 de ori mai mare dect un ribozom.
Controlnd circulaia moleculelor dintre nucleu i citoplasm, complexul porului
nuclear are un rol fundamental n funciile celulelor eucariote.

Note de
curs2
Biologie celulara si moleculara

Pe de o parte, ARN sintetizat n nucleu trebuie s fie exportat n citoplasm, unde are
loc sinteza proteic. Pe de alt parte, factorii de transcripie trebuie transportai de la locurile
de sintez, din citoplasm, n nucleu.

Figura 9.2 Structura porului nuclear (1-membrana nuclear, 2-inel extern, 3-spi, 4-
co, 5-fibrile)
n acest fel, reglarea traficului de proteine i ARN, prin complexele porilor nucleari
determin compoziia nucleului i joac un rol important n expresia genelor.
n funcie de talia lor, moleculele pot traversa complexul porului nuclear prin dou
mecanisme.

Moleculele mai mici de 20 kd trec rapid prin nveliul nuclear din citoplasm n
nucleu i invers. Aceste molecule difuzeaz pasiv prin canalele deschise (pline cu ap), din
complexul porului nuclear. Majoritatea proteinelor i ARN sunt molecule prea mari pentru a
trece prin aceste canale i de aceea nu pot circula liber ntre nucleu i citoplasm. Aceste
macromolecule trec prin complexul porului nuclear datorit unui proces activ, prin care
aceste molecule sunt recunoscute i transportate selectiv ntr-o singur direcie.
Moleculele mari sunt transportate prin canale specializate din complexul
porului membranar, care n prezena unui stimul adecvat se deschid, atingnd 25nm n
diametru, i permit astfel trecerea subunitilor ribozomale.
Se consider c n alctuirea complexului porului nuclear intr peste 100 de proteine
distincte, din care numai o mic parte a fost identificat.
Proteinele transportate n nucleu, dintre care menionm:
ADN polimerazele
Factorii de transcripie
Factorii de clivare
controleaz structura i funciile genomului. Aceste proteine sunt dirijate spre nucleu
prin secvene de aminoacizi specifice numite semnale de localizare nuclear (NLS), care le
orienteaz pasajul prin complexul porului nuclear.
Importul proteic prin complexul porului nuclear se desfoar n dou etape :

Note de
curs3
Biologie celulara si moleculara

1- n prima etap, n lipsa ATP, proteinele care conin semnale de localizare nuclear
se leag la complexul porului nuclear, dar nu trec prin por. Apoi, semnalele de localizare
nuclear sunt recunoscute de un receptor proteic intracitoplasmatic numit importin.
Subunitatea a importinei se leag la NLS, iar subunitatea mediaz asocierea cu
complexul porului nuclear.
2- A doua etap necesit ATP (adenozin trifosfat) i GTP (guanozintrifosfat). Pentru
translocare este necesar o mic protein care leag GTP numit Ran (Tabel 9.1).
Unele proteine rmn n nucleu dup importul din citoplasm. Altele, numite proteine
navetiste se plimb constant ntre nucleu si citoplasm. Aceste proteine sunt cele care
funcioneaz ca transportori pentru alte molecule (de exemplu ARN), proteine care
coordoneaz funciile nucleare i citoplasmatice (exemplu, preoteinele care regleaz
activitatea factorilor de transcripie).
Activitile unor proteine nucleare sunt controlate prin diferite mecanisme. ntr-un
astfel de mecanism de reglare, factorii de transcripie se asociaz cu proteine citoplasmatice
care mascheaz semnalele de localizare nuclear i pentru c semnalele nu mai sunt
recunoscute, aceste proteine rmn n citoplasm.

Tabel 9.1 Etape de transport al proteinelor din citoplasm n nucleu

Proteina -NLS Citoplasma

Proteina NLS + Importina a i Importina b Citoplasma


Por nuclear

Proteina
Importina a Nucleu
Importina b + Ran +GTP

Importina b + Ran +GTP


Importina a Citoplasm
GDP
Ran+ GAP +Pi

Transportul ARN n citoplasm


Exportul ARNm, ARNt i ARNr din nucleu n citoplasm este o etap fundamental n
expresia genelor la celulele eucariote. Ca i importul proteinelor, exportul ARNm prin
complexele porilor nucleari este un proces energo-dependent care necesit Ran.

Note de
curs4
Biologie celulara si moleculara

Acizii ribonucleici sunt transportai prin nveliul nuclear sub forma complexelor
ARN-protein. ntruct transportul se face prin complexe ribonucleoproteice, semnalele care
dirijeaz exportul nuclear pot fi localizate pe proteina legat la ARN sau pe ARN.
Pre-ARN (precursorul ARN m) i ARNm se asociaz, n timpul prelucrrii n nucleu i
n eventualitatea transportului n citoplasm, cu un set de cel puin 20 de proteine formnd
ribonucleoproteine nucleare heterogene (hnRNP). Cel puin una din aceste proteine hnRNP
este o protein navetist care conine un semnal de export nuclear ce-i permite s funcioneze
ca transportor pentru ARNm n timpul exportului acestuia n citoplasm.
ARN r este asamblat cu proteinele ribozomale n nucleu, iar subunitile ribozomale
rezultate sunt transportate n citoplasm cu ajutorul unor semnale prezente pe proteinele
ribozomale.
ARN nuclear de talie mic sau sn ARN (small nuclear ARNs) funcioneaz n interiorul
nucleului i nu n citoplasm ca ARNm, ARNt i ARNr, participnd la prelucrarea ARN.
Acesti ARN sunt transportai iniial n citoplasm, unde se asociaz cu proteinele formnd
molecule de snRNP funcionale care apoi se rentorc n nucleu. Proteinele care se leag la
captul 5 al unor snARN par a fi implicate n exportul snARN n citoplasm, pe cnd
secvenele prezente pe proteinele snRNP determin pasajul snRNP din citoplasm n nucleu.
(Cruce, 1999)
2. Nucleolul apare ca un corpuscul globulos la microscopul optic, cu diametrul de
0,5m. Este o poriune din nucleu unde sunt transcrise genele ARNr i sunt asamblate
subunitile ribozomale. Numrul nucleolilor variaz n funcie de intensitatea produciei de
ribozomi, nucleolul fiind sediul biogenezei ribozomale, mrimea lor reflect intensitatea
produciei de ribozomi.
Lipsesc n celulele care nu au sintez proprie de proteine (exp. celulele embrionare).
Nucleolii sunt bine vizibili n celulele care cresc rapid (celulele canceroase), dar i n
celulele care sintetizeaz o mare cantitate de proteine.
n celulele tinere i celulele secretorii, nucleolii sunt mari i multipli, iar n celulele
canceroase ajung pn la 10-12 cu forme monstruoase. n celulele btrne, cu activitate
metabolic redus, nucleolul este mic i unic.
Nucleolul apare nconjurat de un nveli de heterocromatin care variaz ca i grosime
de la un tip celular la altul i reprezint ADN-ul nucleolo-asociat numit i pars chromosoma.
Unii nucleoli conin i o parte amorf- pars amorpha.
Ca structur nucleolul prezint dou pri cu morfologie diferit:

- una este fin fibrilar pars fibrosa


- una granular pars granulosa
la acestea se adaug centrul fibrilar.
Se presupune c la acest nivel se desfoar transcripia ARN, prelucrarea ARN i
asamblarea ribozomilor. Genele ARNr sunt localizate i transcrise n centrul fibrilar i n
zona fibrilar. Prelucrarea i asamblarea pre ARN cu proteinele ribozomale este iniiat n
zona fibrilar i se continu n zona granular, care conine uniti pre-ribozomale aproape
complete, gata pentru exportul n citoplasm.

Note de
curs5
Biologie celulara si moleculara

Pentru a satisface necesitatea de transcriere a unui numr mare de molecule de ARNr,


toate celulele conin copii multiple ale genelor ARNr. Ribozomii eucariotelor conin patru
tipuri de ARN numite ARNr 5S, 5,8 S, 18 S i 28 S. Genomul uman conine aproximativ 800
de copii ale genei care codific ARNr 5,8S, 18 S i 28 S i aproape 2000 de copii ale genei
care codific ARN 5S.
Genele pentru ARN 5,8 S i 28 S sunt grupate n tandem pe cinci cromozomi umani
(13, 14,15, 21, 22), iar genele ARN r 5S sunt prezente pe cromozomul 1.
3-Matricea nuclear este reprezentat de o reea de fibre granulare, cu rol structural
asemntor citoscheletului. Se apreciaz c aceast matrice servete la organizarea i
consolidarea unor domenii funcionale, cum ar fi buclele de cromatin, fabricile de replicare
ale ADN, domeniile de mbinare ale exonilor i structurile implicate n transportul ARNm.
4-Cromatina reprezint forma relaxat a cromozomilor n interfaz (perioada de repaus
dintre 2 diviziuni). n timpul mitozei, cromatina se condenseaz pentru a forma cromozomii
metafazici compaci.
n interfaz o parte din cromatin (heterocromatina) rmne condensat i este inactiv
(nu se transcrie) restul cromatinei (eucromatina) este decondensat i se distribuie n tot
nucleul.
La microscopul optic, cromatina se prezint sub forma unei reele structurat din
granule i filamente interconectate. Prin coloraii o parte a cromatinei este intens bazofil
(componenta granular) i se numete hererocromatin, iar o alt parte se coloreaz slab
bazofil (componenta filamentoas- eucromatina).
Aceste aspecte reprezint dou grade diferite de mpachetare sau condensare a
cromatinei. n heterocromatin, cromatina prezint un grad nalt de impachetare, iar
eucromatina este mai relaxat.
Eucromatina este forma activ metabolic deoarece ea permite legarea transcriptazei,
care asigur transcrierea genelor n ARNm n vederea exprimrii acestora.
Heterocromatina formeaz un nveli discontinuu situat sub nveliul nuclear.
Discontinuitile reprezint canale care duc la porii nucleari.
Celulele conin 2 tipuri de heterocromatin: heterocromatina constitutiv ce conine
secvene de ADN care nu sunt transcrise niciodat, cum ar fi secvenele satelit de la nivelul
centromerilor. A doua categorie heterocromatina facultativ conine secvene care nu sunt
transcrise n anumite celule, dar sunt transcrise n alte tipuri de celule. Prin urmare, cantitatea
de heterocromatin facultativ difer funcie de activitatea transcripional a celulei.
Procesul inactivrii cromozomului X este un exemplu de evideniere a rolului
heterocromatinei n expresia genelor ( Cruce, 1999). Cromozomul X conine mii de gene care
lipsesc cromozomului Y. Astfel, sexul feminin are de dou ori mai multe gene ale
cromozomului X da de sexul masculin. n pofida acestei diferene celulele au aceeai
cantitate de proteine codificate de genele de pe cromozomul X. Aceasta datorit interveniei
unui mecanism compensator prin care unul din cei 2 cromozomi X din celulele feminine este
inactivat fiind convertit n heterocromatin, din stadiile iniiale ale dezvoltrii. Deci, numai o
copie a cromozomului X este disponibil pentru transcripie, att n celulele masculine ct i
n cele feminine (Cruce, 1999).

Note de
curs6
Biologie celulara si moleculara

Fenomenul inactivrii poart denumirea de compensarea genetic a dozei genelor X-


linkate (Raicu, 1969).

Inactivarea este determinat de prezenta genelor XIST( X-


inactiv specific transcript), care codific apariia molecule de ARN,
diferit de ARNm ce codific sinteza proteinelor. Acest ARN
inactiveaz genele cromozomului X, pe care se afl XIST, dar nu
afecteaz alti cromozomi nucleari. Acest ARN XIST este foarte
interesant prin modul in care induce aceasta inactivare reversibil
prin heterocromatinizare facultativ. (Jennifer C. Chow, 2007).
La alte organisme, de exemplu psrile, cromozomii sexuali se
replic simultan cu autozomii si, n consecint, ei nu formeaz
cromatin sexual. Absena mecanismelor de compensare de doz a
genelor la psri demonstreaz c acesta nu este absolut necesar
pentru supravieuirea speciilor, ns poate fi socotit ca o cauz a
dificilei evoluii ulterioare. La mamifere, la care fenomenul de
compensare de doz a genelor exist, posibilitile de speciaie sunt
incomparabil mai mari. Din acesat cauz ele au evoluat mai repede
(Raicu, 1969).

Rolul nucleului i organizarea informaiei n celulele eucariote


Rolul esenial al nucleului rezult din dogma central a geneticii moleculare:
informaia genetic este transferat astfel ADN- ARN- proteine, prin procesele de
transcripie i translaie.
Transcripia reprezint transcrierea informaiei, reprezentat de o anumit succesiune
de baze azotate din structura ADN, ntr-o secven de baze complementare de ARN.
Produsul transcris se numete ARN mesager (ARNm) i conine pe lng informaia necesar
sintezei unui lan polipeptidic i secvene noninformaionale. Aceste zone noninformaionale
sunt ndepartate prin excizie, tot n nucleu, prin procesul numit ARN- procesare.
Translaia este procesul prin care mesajul genetic, reprezentat de secvene de baze
azotate a ARNmesager, este tradus ntr-o secven de aminoacizi corespunztoare. Procesul
are loc n citoplasm, la nivelul ribozomilor i reprezint sinteza propriu-zis a proteinelor.
Replicaia este un alt proces biochimic esenial cruia i este supus ADN nuclear. Acesta
const dintr-o serie de procese moleculare care se desfoar foarte exact n nucleu i care
asigur autoreproducerea informaiei genetice n scopul asigurrii transmiterii nealterate de-a
lungul generaiilor celulare.

Organizarea ADN n nucleu


Structura primar
Modelul WATSON-CRICK al structurii ADN reprezint, probabil, cea mai mare
descoperire a biologiei moderne (Premiul NOBEL, 1962). Acest model, universal valabil n

Note de
curs7
Biologie celulara si moleculara

lumea vie, corespunde funciilor materialului genetic, deoarece explic modul n care se
stocheaz, se transmite i se exprim informaia ereditar. Gena nceteaz s mai fie o
entitate "misterioas", are o structur chimic complex i bine definit, iar ADN devine nu
numai esena geneticii ci i un veritabil simbol al vieii. Consecinele pentru practica medical
ale revoluiei determinate de ctre descoperirea structurii i funciei ADN sunt i vor fi att de
spectaculoase nct nu vor avea egal n istoria medicinii.

ADN este un macropolimer de "deoxiribonucleotide". Lungimea i greutatea sa


molecular sunt foarte mari, permind stocarea unei cantiti uriae de informaie. Cantitatea
de ADN variaz de la specie la specie (la om g.m.=3,5 x1012 daltoni) dar este constant la
indivizii aceleiai specii, precum i n toate celulele somatice (diploide) de la acelai individ.

Acizii nucleici sunt substane chimice macromoleculare alctuite din uniti mai simple
numite nucleotide. O nucleotid este alctuit dintr-o baz azotat, o pentoz (zaharid) i un
radical fosforic.

Pentoza este reprezentat de D-2-deoxiriboza, n forma sa furanozic. Baza azotat


poate fi purinic - adenina (A), guanina (G) - sau pirimidinic - timina (T), citozina (C); se
leag la C1 al deoxiribozei, alctuind mpreun un nucleozid. Grupul fosfat (provenit din
acidul ortofosforic) se leag la C5 al deoxiribozei, formnd cu aceasta i baza azotat un
nucleotid, unitatea fundamental a structurii catenei de ADN.

Grupul fosfat confer moleculei de ADN caracterul de "acid" i numeroase sarcini


negative, neutralizate in vivo prin fixarea histonelor, proteine bazice. n ADN, exist patru
tipuri de deoxiribonucleotide - acid deoxiadenilic, deoxiguanilic, deoxicitidilic, deoxitimidilic
- care se vor deosebi numai prin baza azotat; gruparea fosfat i deoxiriboza sunt elemente
constante.

Citozina Timina Uracil


NH2 O
O
4
pirimidinele 5 3 H3C
N NH
NH
2
6
NH O NH O
1 NH O

purinele
Adenina Guanina
NH2 O
6
4 7 N
1
N N HN

2 8
N 5 H2N N NH
NH
3 9

Note de
curs8
Biologie celulara si moleculara

Riboza Dezoxiriboza
pentoze
HO CH2 OH HO CH2 OH
O O

OH OH OH

Bazele azotate purinice i pirimidinice se pot afla sub dou forme, rezultate prin
schimbarea poziiei unui atom de hidrogen, fenomen denumit tautomerie. Existena
tautomeriei are nu numai importan chimic, ci i genetic, deoarece d o explicaie unor
modificri spontane sau experimentale, intervenite n macromeolecula acizilor nucleici.
Datorit tautomeriei au loc schimbri ale moleculei respective n privina capacitii
sale de a intra n reacii chimice. Astfel atomii de oxigen ataai la molecula timidinei i
guaninei n poziia C6 au de obicei forma cetonic (C=O) i numai n cazuri foarte rare se
prezint sub forma enolic (C-OH).
n mod similar atomii de azot ataai inelului purinic i celui pirimidinic se afl sub
forma amino (NH2) i numai n cazuri foarte rare sub forma imino (NH).
Din punct de vedere biologic, faptul c atomii de hidrogen i pstreaz n general
poziia n molecul are importan pentru stabilirea macromoleculei de ADN. Din cauza
fenomenului de tautomerie se produc erorile de imperechere, prin care adenina se
imperecheaz cu citozina, iar guanina cu timina. Aceasta este una din cauzele mutaiilor la
nivel molecular.
Polimerizarea nucleotidelor, n molecula de ADN, se realizeaz prin legturi
covalente 3'- 5' fosfodiester, formate ntre gruparea OH a C3 al deoxiribozei unui nucleotid
i restul fosfat fixat la C5 al nucleotidului urmtor. Se formeaz astfel o caten (lan)
continu, linear (neramificat), care reprezint structura primar a ADN

n catena de ADN poziia unui nucleotid nu impune cu necesitate n vecintatea sa


prezena unui anumit alt nucleotid: poziiile adiacente pot fi ocupate de oricare din cele patru
tipuri de nucleotide. Deci, nu exist nici o restricie n dispunerea / succesiunea nucleotidelor
n lungul catenei de ADN sau, altfel spus, exist o libertate total de aezare a nucleotidelor.

Acest lucru este esenial deoarece secvena (ordinea) nucleotidelor n lungul catenei
de ADN reprezint informaia genetic codificat, pe baza creia se stabilete ordinea
aminoacizilor n proteine. Sensul de "citire" al informaiei genetice este determinat de
polaritatea 5' - 3' a catenei de ADN . Ea este dat de faptul c poziiile 5'-fosfat a primului
nucleotid i 3'-hidroxil a ultimului nucleotid al catenei sunt libere, neangajate ntr-o legtur
chimic. Orice secven de nucleotide se "citete" n direcia 5' - 3' i se scrie cu captul 5' la
stnga, de ex. 5'-ATGCCTAGATCA-3'. Fiecare caten a ADN este deci o secven orientat,
definit prin nlnuirea nucleotidelor.

Informaia genetica

Note de
curs9
Biologie celulara si moleculara

Informaia genetic necesar acestor procese este reprezentat de secvena linear


(succesiunea sau ordinea de nlnuire) nucleotidelor n molecula de ADN; ea determin
structura proteinelor care alctuiesc celulele i esuturile i particip la funcionarea lor
complex. Proteinele sunt formate din lanuri de aminoacizi; secvena aminoacizilor n
protein determin proprietile caracteristice ale fiecrei proteine; aceast ordine specific a
aminoacizilor este determinat de secvena nuclotidelor n ADN.

Informaia ereditar este codificat, fiind scris ntr-un limbaj foarte simplu, cu
ajutorul unui "alfabet nucleic" ce are numai patru "litere": A, T, G i C (corespunztoare
celor patru tipuri de nucleotide). Folosind aceste elemente de cod se pot scrie "cuvinte" de trei
litere, asamblate ntr-o "fraz" ce alctuiete o gen. La fiecare triplet de nucleotide, numit
codon corespunde pe baza codului genetic, un anumit aminoacid din structura proteinei sau
un "semnal" necesar pentru a ncepe sau termina lectura mesajului.

Aceast modalitate de codificare a informaiei rezolv problema stocrii informaiei


genetice ntr-un spaiu foarte mic. Astfel, n ADN, un million de nucleotide ocup un spaiu
liniar de 0,034 cm. ntr-o celul uman cu diametrul de 20m, exist o secven de 3x109
nucleotide care pot fi mpachetate ntr-un cub cu latura de 1,5m. Daca am compara cu
literele dintr-o carte , acestea ar ocupa 1 milion de pagini (3,500 de cri de 300 pagini).

Gena este unitatea de informaie ereditar; ea este alctuit dintr-o succesiune


specific de codoni, ce determin ordinea aminoacizilor ntr-un polipeptid i, prin aceasta,
funcia lui. Modificarea secvenei nucleotidelor prin mutaia genei va duce la modificarea
unui / unor codon(i) i, de cele mai multe ori, la modificarea structurii i funciei proteinei
sintetizate .

Structura secundar
Watson i Crick au propus un model al moleculei de ADN alctuit din dou catene
polinucleotidice, legate ntre ele prin bazele azotate, n mod complementar i nfurate
plectonemic pentru a forma o dubl spiral elicoidal (o elice dubl) orientat spre dreapta,
cu diametrul de 20 i pasul elicei de 34 . Pornind de la faptul c raportul A/T = G/C = 1,
Watson i Crick consider c n molecula de ADN se produce o mperechere "preferenial" a
bazelor care unesc cele dou catene; bazele azotate (situate spre interiorul moleculei) se leag
complementar: o baz purinic se unete cu o baz pirimidinic sau, mai exact A T i G
C (formnd un cuplu sau o pereche de baze, prescurtat pb).

Legturile se realizeaz prin puni de hidrogen, legturi electrostatice slabe. n felul


acesta secvena nucleotidelor unei catene determin cu necesitate secvena nucleotidelor
celeilalte catene. Deci, cele dou catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare i strict
codeterminate. Cunoaterea secvenei nucleotidice a unei catene va permite automat
determinarea secvenei nucleotidice a celeilalte catene. De exemplu:

5'-ATGCCAG-3'

3'-TACGGTC-5'.

n acest context vom sublinia: legea complementaritii bazelor care st la baza


mecanismelor prin care se realizeaz funciile genetice ale ADN: transcripia, replicarea,
repararea leziunilor, recombinarea.

Note de
curs10
Biologie celulara si moleculara

n timp ce n macromolecula de ADN raporturile A/T i G/C sunt constant i


egale cu 1:1, raportul A+T/G+C este foarte variabil n funcie de specie. n general se
constant c plantele superioare i animalele au un exces de A+T fa de G+C din ADN, n
timp ce la organismele mai puine evaluate (plante inferioare, bacteria, virusuri) se observ o
variaie mult mai mare a acestui raport. Acestea nu sunt ntmpltoare , se consider c
variaia n secvena bazelor azotate este necesar pentru a asigura deosebirile genetice dintre
diferitele specii vegetale i animale (Raicu & Ionescu -Varo, 1972).

Libertatea total de aezare a nucleotidelor n lungul catenelor de ADN ( pe vertical)


se asociaz cu necesitatea dispoziiei lor complementare (n planul orizontal al moleculei).
"Libertatea i necesitatea" dau substratul ereditii nalta sa difereniere i capacitate de a
stoca, exprima i transmite perfect mesajul pe care l deine" (Parot, 1985). n molecula
simbol a vieii este astfel "nscris" unul din principiile filosofice fundamentale ale existenei
omului: libertate i necesitate.

Legturile stereochimice / spaiale necesare pentru mperecherea corect dintre AT i GC


fac ca orientarea (polaritatea) celor dou catene s se dirijeze n sensuri opuse, deci, s fie
antiparalele. Acest lucru are consecine importante n "citirea" informaiei n procesul sintezei
proteice, precum i n mecanismul replicrii (biosintezei unor noi molecule de ADN).

Cele dou catene ale ADN se nfoar (se mpletesc) plectonemic (una n jurul alteia,
ca "o frnghie", i amndou n jurul unui ax central (imaginar) al moleculei, formnd o
dubl spiral elicoidal coaxial (o elice dubl), orientat spre dreapta (dextrogir). Ea poate
fi comparat cu o "scar n spiral" n care axele fosfoglucidice formeaz marginile scrii iar
perechile de baze, treptele ei. Aceast structur, asociat funciilor majore pe care le
ndeplinete ADN, a fost plastic numit "elicea vieii", fiind un veritabil simbol al lumii vii.

Note de
curs11
Biologie celulara si moleculara

Figura 9.3 Structura secundar a ADN-ului

Structura ADN este, n ansamblul ei, perfect regulat, ordonat: diametrul moleculei 2
nm; o tur complet are 3600; pasul elicei 3,4 nm permite dispunerea a 10 perechi de baze
(Figura 9.3).

n configuraia ei spaial, molecula de ADN prezint dou anuri laterale: unul mai
mic i altul mai mare. Ele sunt importante n recunoaterea stereochimic i fixarea pe ADN
a histonelor (la nivelul anului mici) sau a unor molecule proteice reglatoare (la nivelul
anului mare), singurul loc n care bazele sunt accesibile acestor proteine care vor influena
(regla) realizarea funciilor ADN.

Polimorfismul structural i flexibilitatea moleculei de ADN


Forma clasic a structurii ADN, descris de Watson i Crick, corespunde conformaiei
de tip B, care se realizeaz frecvent "in vivo" (n condiii de umiditate crescut i concentraie
ionic joas). S-au descris ns i alte conformaii sau isoforme: A i C, mai frecvente, D i E,
mai rare. Ele au acelai plan general de structur: elice dubl orientat spre dreapta dar se
deosebesc de tipul B printr-o serie de particulariti fizice (nclinarea bazelor fa de ax,
modificarea pasului elicei i numrul de baze per tur elice): forma A este mai scurt i mai
groas, iar celelalte mai lungi i mai subiri.

n organism, n anumite regiuni ale moleculei de ADN (cu o anumit secven


nucleotidic) se produc frecvent modificri (tranziii) conformaionale A - B -C. Aceste
modificri permit recunoaterea segmentelor respective de ctre anumite molecule exogene,
care regleaz expresia genelor.

n 1979, Rich i Dickerson descoper un tip particular de ADN-Z sau ADN-senestra.


El are o molecul dublu elical, orientat spre stnga, care i pierde simetria caracteristic
formei B, deoarece axul fosfo-glucidic ia o form neregulat n zig-zag, producnd
deformarea i alungirea moleculei de ADN. Conformaia ADN-Z este o conformaie
normal, exist "in vivo" i apare, n anumite condiii fizico-chimice, n regiunile bogate n
perechi de baze G-C, prin tranziia / conversia formei B (sub aciunea unei topoisomeraze,
prin rotarea bazelor cu 180 ); tranziia B - Z este reversibil.

ADN-Z intervine foarte probabil n inactivarea unor gene i, deci, n controlul expresiei
informaiei genetice. Conversia local B - Z (mai ales n situsurile de reglare a transcripiei)
poate fi realizat prin fixarea mai intens a histonelor sau a altor molecule ce produc represia
genelor sau prin metilarea citozinei din situsurile GC. Astfel, un "viraj la stnga" la nceputul
unei gene determin stoparea activitii ei.

Tranziia B - Z ar determina ns i evidenierea unor situsuri din ADN n care se


fixeaz mai facil ageni mutageni sau cancerigeni. Pentru aceasta pledeaz faptul c mutaiile
apar mai frecvent la nivelul secvenelor G-C care iau conformaia Z.

n finalul acestei prezentri este important de subliniat faptul c tranziia ADN B-Z ca i
modificrile conformaionale A - B - C care apar n anumite regiuni ale ADN (cu o secven
special a nucleotidelor), demonstreaz elocvent faptul c molecula de ADN nu are o
structur fix, rigid, ncremenit. n funcie de condiiile de mediu, moleculele ADN snt
flexibile, ntr-o permanent stare dinamic, deformndu-se nencetat; pe drept cuvnt se poate
spune c molecula de ADN (simbolul vieii) "pulseaz sau respir".
Note de
curs12
Biologie celulara si moleculara

Organizarea ADN i formarea cromozomilor


Diferite procese nucleare sunt plasate in domenii distincte ale nucleului. De plid,
replicarea ADN, prelucrarea pre-ARNm i transportul ARNm se desfoar n zone sau
structuri subnucleare bine delimitate, a cror natur i funcie este nc incomplet explorat.

Analiza cromatinei la microscopul electronic evideniaz un sistem ierarhizat de fibre


de cromatin, de dimensiuni diferite. alctuite din ADN, histone i proteine nehistonice.

Primul nivel de organizare supramolecular a ADN este filamentul cu nucleosomi, cu


diametrul de 10 nm. Nucleosomul este alctuit dintr-un complex de ADN i histone o
secven de ADN (de 146 p.b.) se nfoar (1 tur i 3/4) n jurul unui "miez" histonic,
cilindric, format din 8 molecule de histone (cte 2 molecule din H2A, H2B, H3 i H4).

Figura 9. 4 Filamentul cu nucleosomi (H2A, H2B, H3 i H4)

Nucleosomii sunt legai ntre ei printr-un segment de ADN liber (60 p.b.), formnd
filamentul cu nucleosomi (Figura 9.4), asemntor unui "irag de mrgele". Aceast structur
(meninut strns prin histona H1, ce leag doi nucleosomi vecini) realizeaz o rat de
"mpachetare" a ADN nativ (dublu helix de 2nm) de circa 10:1.

Mecanismul prin care se formeaz nucleosomii este nc puin cunoscut. Cert este
faptul c nucleosomii nu sunt structuri statice, rigide, deoarece funciile ADN (transcripia,
replicarea, recombinarea) necesit separarea celor dou catene ale ADN i implicit
modificarea structurii nucleosomului. Ei sunt fixai la o singur caten a ADN ("n faz")
aceiai de la o celul la alta.

Al doilea nivel de organizare supramolecular a cromatinei este fibra de cromatin de


30 nm. Ea rezult din spiralizarea n solenoid a filamentului cu nucleosomi . Aceast
structur (cu pasul de 6 nucleosomi) este stabilizat de histona H1 i realizeaz o compactare
de 5:1. Fibra de cromatin de 30 nm este unitatea fundamental de organizarea cromatinei n
nucleul interfazic.

Fibra de cromatin are ns i un rol important pentru funcionarea genomului, deoarece


prin spiralizare apropie mult diferite regiuni ale ADN care, liniar, se afl la distane mari
unele de altele. n felul acesta, favorizeaz interaciunile genice necesare pentru expresia
adecvat a informaiei ereditare. Mai mult, solenoidul nu are o structur omogen: zonele
spiralizate alterneaz neregulat cu zone nespiralizate, unde se pot fixa o serie de proteine
specifice, care produc o configuraie cromatinian ce permite accesul ARN polimerazei i
deci transcripia.

Note de
curs13
Biologie celulara si moleculara

Al treilea nivel de organizare rezult prin plierea fibrei de cromatin de 30 nm n bucle


laterale, numite i domenii, de lungimi diferite (20-100 kb); se formeaz fibra pliat n
bucle laterale cu un diametru de 300 nm (grad de compactare 10:1). Buclele sunt ataate,
prin anumite situsuri de ancorare din structura fibrei de ADN, la un "schelet" sau matrice
proteic (nonhistonic), care are o form identic cu cea a cromosomului metafazic.

Se consider c fiecare bucl sau domeniu (ce conine cteva gene) ar putea fi o unitate
funcional de transcripie i replicaie; buclele au deci att o semnificaie structural ct i
un rol funcional important.

Fibra pliat n bucle lateral formeaz la nceputul profazei, printr-o puternic


spiralizare i condensare (grad compactare 20), cromatida unui cromosom. Ea atinge n
metafaz o grosime de 700 nm, fiind cel mai nalt grad de compactare a fibrei de baz a
cromatinei (30 nm). Fiecare cromatid a unui cromosom conine deci o singur molecul de
ADN, organizat n mai multe structuri succesive i ierarhizate de "mpachetare". La sfritul
diviziunii, n telofaz, se produce despiralizarea/decondensarea cromosomilor.

Molecula de ADN sufer astfel o compactare de 10.000 de ori i poate ncape facil n
spaiul mic, de civa microni, al nucleului. Acest fenomen favorizeaz distribuia corect a
materialului genetic n diviziune i asigur funcionarea ADN.

Buclele fibrei de 300 nm se fixeaz neregulat de scheletul proteic. Din loc n loc (n
regiuni de ADN n care predomin secvene cu p.b. A-T) ele formeaz mici aglomerri de
bucle, numite cromomere, separate prin zone mai laxe. Pe msur ce cromosomul profazic se
condeseaz cromomerele mici, vecine, se unesc ntr-o structur mai mare. Aceste cromomere
mari se adun n grmezi i formeaz benzi intens condensate i colorate (benzi G); ele vor fi
separate prin benzi mai puin condensate i mai clare (benzi R).

ADN care formeaz benzile G (sau Q) conine mai multe puncte de ataare, strns
apropiate, iar buclele sunt mai dense, mai compactate; coloranii (Giemsa, Quinacrin) care
au afinitate pentru regiunile SAR bogate n A-T vor da benzi G. In benzile R densitatea
punctelor de ataare este mai mic, buclele sunt mai laxe.

Benzile cromosomice reflect structura intern heterogen a cromosomului i definesc


regiuni din genom care au proprieti i funcii diferite.

Note de
curs14
Biologie celulara si moleculara

CAPITOLUL 10
TRADUCEREA INFORMAIEI GENETICE
Transferul informaiei din ADN n ARN
Activarea aminoacizilor pentru formarea proteinelor
Iniierea si realizarea sintezei proteinelor
Mecanismele moleculare de aciune a medicamentelor asupra funcionrii
acizilor nucleici si asupra sintezei de proteine

Una dintre cele mai importante funcii ale ADN este aceea de a construi matri pentru
sinteza moleculelor de ARN deoarece numai n acest fel informaia genetic stocat n ADN
poate fi utilizat de ctre celul. Sinteza moleculelor de ARN n nucleu se numete ADN
transcripie.
La majoritatea celulelor de mamifere, doar 1% din secvenele de dezoxiribonucleotide sunt
copiate n secvene de ribonucleotide (ARN) funcionale, moleculele de ARN, produse n acest
fel, sunt folosite de ctre celul n mai multe direcii, fiind de mai multe tipuri:

- ARN mesager (ARNm)

- ARN ribozomal (ARNr) intr n structura ribozomilor

- ARN de transfer (ARNt) folosit ca molecul adaptor pentru sinteza proteinelor.


La eucariote ARN sintetizat n nucleu este transportat n citoplasm ctre ribozomi pentru
a iniia procesul de biosintez a proteinelor. ARN este nvelit, la eucariote, cu proteine de legare
a ARN, imediat dup sinteza lui, care l protejeaz de aciunea degradativ a ribonucleazelor.
Atat la eucariote ct i la procariote ARN poate fi monogenic ( conine regiunea de
codificare de la o singur gen) sau poligenic (conine regiuni de codificare de la mai multe
gene).

ARN mesager
La eucariote, majoritatea ARN premesager (produsul primar al transcrierii) care conine
informaia genetic pentru diferite proteine sufer 3 modificri:
1- adiia la captul 5 al ARN premesager a unei secvene 7-metil guanozintrifosfat
numit cap, necesar pentru iniierea traducerii i aezarea ARNm pe ribozomi.
2- clivarea i poliadenilarea ARN premesager (adiia la captul 3 -OH al ARN
premesager a unei secvene poli (A) lung de aproximativ 200 nucleotide, implicat
n stabilitatea intracelular a ARNm).

Note de
curs15
Biologie celulara si moleculara

Mai nti captul 3 este pregtit de o enzim, care taie o anumit secven de
nucleotide din lanul ARN i apoi adaug o serie de adenine (A) care se repet (poli
A).

3-atunci cand n ARN premesager sunt prezente secvene fr rol de codificare numite
introni (neinformaional), care separ secvenele codificatoare (informaionale)
numite exoni, secvenele de transcriere ale intronilor sunt excizate, iar cele ale
intronilor sunt reunite (eng. splicing). n acest proces sunt implicate complexele
moleculare numite spliceosomi reprezentate de snARN i aproximativ 145 de
proteine diferite.

Procesul transcripiei este realizat de enzime speciale numite ARN- polimeraze. La


eucariote exist ARN- polimeraze (I, II, III) diferite pentru cele trei tipuri de ARN-transcrise, n
timp ce la procariote, toate cele 3 tipuri sunt transcrise de o singur ARN polimeraz.
Aceste trei ARN polimeraze, corespunztoare celor 3 tipuri de ARN (ARNm, ARN, r,
ARNt) sunt diferite ca form, mrime, structur i funcie:
-ARN polimeraza I- este prezent n nucleol i este implicat n biosinteza ARN r (cu
excepia ARNr 5S)
- ARN polimeraza II- este prezen prin nucleu fiind implicat n biosinteza ARN
premesager nuclear.
- ARN polimeraza III este prezent n nucleu fiind implicat n biosinteza ARNt, ARNr
5S, alte molecule de greutate mic.
Toate cele trei ARN polimeraze necesit prezena unor factori de transcriere (proteine
ataate de secvene ale ADN cu rol n transcripie) pentru a iniia sinteza lanului de ARN.
Aceti factori de transcriere sunt legai la o secven specific a ADN, numit promotor, care
conine o secven de 3 nucleotide numit situs start.
Durata de via a unei molecule de ARN m este de 8-12 ore (Ross, 1996). Cantitatea de
ARNm este de asemenea sczut deoarece n celulele eucariote sunt funcionale un numr limitat
de gene structurale, dar ARNm este mult mai stabil (celulele triesc ntr-un mediu intern mai
constant, iar nevoile de adaptare prompt sunt mici ) (Moldoveanu & Lepdatu, 2004).
Procesele de transcriere a genelor la ARNm i traducerea genetic a acestuia la proteine
sunt cuplate n timp i spaiu, n mod coordonat. Legarea permanent a poliribozomilor de ADN,
n strns asociere cu molecula de ARN polimeraza, pledeaz pentru cuplarea acestor procese.
Ribozomii de pe moleculele de ARNm leagate la ADN apar ca ribozomi liberi sau
poliribozomi. Fiecare ribozom este asociat cu un segment de ARN m lung de 100-150 nm (150-
200 nucleotide). S-a demonstrat c limitele unui operon structural care este transcris sunt
cuprinse ntre poliribozomul cel mai scurt (corespunde situsului promotor) i poliribozomului cel
mai lung (corespunde punctului terminus al operonului). Fiecare poliribozom este legat de
cromozom printr-o molecul de ARN polimeraza.

Note de
curs16
Biologie celulara si moleculara

n ARNm exist numai 4 nucleotide diferite, iar proteine includ combinaii a 20 de


aminoacizi, ca urmare translaia nu poate fi efectuat printr-o coresponden direct 1 la 1 ntre
un nucleotid din ARNm i un aminoacid din protein. Limbajul prin care secvena a unei gene
este tradus prin intermediul ARNm, n secvena de aminoacizi a unei proteine reprezint codul
genetic.
Secvena de nucleotide din molecula de ARNm este citit succesiv, n grupuri de trei
nucleotide (codoni). Deoarece ARN este un polimer liniar cu patru nucleotide diferite sunt
posibile 4x4x4 =64 de combinaii a cte trei nucleotide: AAA, AUA, AUG, etc.

ARN transfer
Codonii din lanul de ARNm nu recunosc direct aminoacizii pe care-i specific, deci
grupul de trei nucleotide nu se leag direct de aminoacizi. Acest rol de recunoatere i de adaptor
este asigurat de ARN transfer (ARNt) ce cuprinde 80 de nucleotide care recunosc codonul, dar
prezint i un situs de legare pentru un aminoacid.
ARTt este o molecul cu structur secundar i teriar. Este solubil n citoplasm i
reprezint aproximativ 10-20% din ARN total. Sinteza ARNt are loc sub forma unor precursori
mai mari din care bazele excedentare sunt ndeprtate, iar bazele originare sunt supuse unor
modificri enzimatice ca metilarea, acetilarea, dezaminarea. Unele molecule precursor conin
mai multe tipuri de ARNt din care, printr-un proces de clivare, sunt separate moleculele de ARN
funcionale identice sau diferite.
ARNt are particularitatea de a fi parial bicatenar prin ndoirea n ac de pr i legarea
bazelor complementare ale unei molecule monofilare.
Ca urmare, ARN t prezint o structur secundar, de forma unei frunze de trifoi care
rezult din legarea covalent a unui numr mare de baze , ce formeaz brae (eng. stem) dublu
catenare ntrerupte de zone monocatenare sub form de bucle (eng. loop).
Numrul nucleotidelor este constant n diferite brae i bucle ale moleculei, cu excepia
buclei variabile (funcie necunoscut) i segmentelor i din bucla D.
ARN t conine 6 situsuri funcionale (Figura 10.1) :
1- situsul acceptor de aminoacizi (captul 3 terminal este monocatenar i comun tuturor
tipurilor de ARNt, se termin cu secventa CCA i formeaz situsul de legare aminoacil= situsul
acceptor de aminoacid); gruparea 3OH a ribozei din nucleotidul adenin terminal, servete ca
acceptor , de care se leag covalent un aminoacid. Reacia specific de legare este catalizat de
aminoacil ARNt sintetaza
2- situsul de interaciune (recunoatere) ribozomal-bucla T (bucla TC -=pseudouridina)
formeaz perechi de baze cu secven complementar a ARNr 5S
3-situsul de recunoatere a aminoacil ARNt sintetazei (bucla D alctuit din 6-12 baze
nepereche diferite dela un tip de ARN t la altul)
4- situsul de recunoatere a factorilor care particip la transferul ARNt pe ribozom
Note de
curs17
Biologie celulara si moleculara

Figura 10.1 Structura ARNt


5- Situsul de recunoatere a factorului FE-G n cursul translocaiei pe ribozom
6- anticodonul (bucla anticodonului alctuit din 7 baze nepereche, in care se gsete tripleta
anticodon, aceste nucleotide sunt complementare cu un codon de pe molecula de ARNm)
(Figura 10.1).

Activarea aminoacizilor pentru formarea proteinelor


Legarea aminoacizilor de ARNt sub aciunea ARNt aminoacil sintetazelor specifice este
denumit prima traducere, deoarece aminoacidul legat de ARNt i pierde identitatea fiind
recunoscut doar prin intermediul ARNt purttor.
A doua traducere se desfoar pe ribozom i are la baz recunoaterea codon- anticodon.
Codonul (secvena trinucleotidic de pe ARNm) nu recunoate aminoacidul, ci numai
secvena de nucleotide a anticodonului.
Activarea aminoacizilor i formarea complexului aminoacil ARNt sunt catalizate de 20 de
enzime specifice (pentru una din fiecare categorie de aminoacil). Sunt n numr de 2.000-3.000
de molecule /celul.
Enzima care particip la activare, catalizeaz dou reacii succesive:

Note de
curs18
Biologie celulara si moleculara

Aminoacid (AA) + enzima (E) + ATP E-AA-AMP + PPi

E- AA- AMP + ARNt AA-ARNt +E+AMP

Prima reacie este de activare, legarea aminoacidului de ARNt specific se face printr-o
legtur macroergic ceea ce determin apariia unui precursor activat. Energia din legtura
respectiv este folosit pentru formarea legturilor peptidice cu energie joas.

Iniierea i realizarea sintezei proteinelor


Translaia rapid i precis a ARNm n proteine necesit un dispozitiv molecular complex,
care merge de-a lungul ARNm, capteaz moleculele complementare ale ARNt, le aeaz n
poziie i apoi leag aminoacizii pe care i poart pentru a forma un lan proteic. Acest
dispozitiv de sintez a proteinelor este ribozomul, un mare complex format din 50 de proteine
diferite (proteinele ribozomale) i cteva molecule de ARN numite ARN ribozomal (ARNr), ce
reprezint 80% din ARN total.
La eucariote subunitile ribozomale sunt produse n nucleu prin asocierea cu ARNr
proaspt transcris cu proteinele ribozomale, care au ajuns n nucleu dup sinteza lor n
citoplasm. ntr-o celul se gsesc milioane de ribozomi.
Ribosomi sunt liberi n citoplasm sau sunt asociai cu reticulul endoplasmatic i au o
constant de sedimentare de 80S. Ribozomi disociaz n dou subuniti (reversibil) inegale
avnd constantele de sedimentare de 40 S i respectiv 60 S. ntre cele dou subuniti rmne un
canal ngust prin care trece ARNm purttor al informaiei genetice necesar pentru sinteza
proteinelor.
Subunitile ribozomale sunt exportate n citoplasm pentru a lua parte la sinteza proteic.
Ribozomii eucariotelor i procariotelor sunt asemntori ca structur i funcie. Sunt
alctuii dintr-o subunitate mic i una mare, care se asambleaz pentru a forma un ribozom cu o
mas de milioane de daltoni.
Subunitatea mic mperecheaz ARNt cu codonii de pe lanul
ARNm, n timp ce subunitatea mare catalizeaz formarea legturilor
peptidice care inser aminoacidul ntr-un lan polipeptidic.
Pentru a ncepe sinteza unei proteine cele dou subuniti se ataeaz mpreun pe un lan
de ARNm, de regul la nceputul lui (captul 5). Apoi ribozomul se deplaseaz de-a lungul
ARNm traducnd secvena nucleotidic n secvena unui aminoacid, cu cte un codon pe ciclu.
Ribozomul utilizeaz ARNt ca adaptori pentru a aduga fiecare aminoacid n poziie
corect la captul lanului polipeptidic (Figura 9.2) . Cnd sinteza este terminat cele dou
subuniti ale ribozomului se separ.

Note de
curs19
Biologie celulara si moleculara

Ribozomii funcioneaz cu o eficient remarcabil, astfel, ntr-o secund un ribozom


eucariot adaug doi aminoacizi la un lan polipeptidic, iar ribozomii bacterieni 20 de aminoacizi
pe secund.
Un ribozom conine 4 situsuri de legare pentru moleculele de ARN:
1. unu pentru molecula de ARNm
2. situsul A (aminoacil ARNt)
3. situsul P (peptidil- ARNt)
4. situsul E (exit)-reprezint situsul de legare a ART t descrcat
Translaia unui ARNm ncepe cu codonul AUG, iar pentru iniierea translaiei este necesar
un ARNt special. Acest ARNt iniiator poart ntotdeauna o metionin (Met), astfel nct,
proteinele nou sintetizate au ntotdeauna metionina ca prim aminoacid la captul terminal.

Figura 10. 2 Procesul de formare a lanului polipeptidic la nivel ribozomal


Acest ARNt initiator se leag mpreun cu factorii de iniiere la subunitatea mic
ribozomal, apoi acesta se leag la captul 5 al unui ARNm. Subunitatea mic ribozomal se
mic n direcia 5-3 de-a lungul ARNm cutnd secvena AUG (secvena iniial). Cnd a
ntlnit AUG, factorii de iniiere se disociaz de subunitatea ribozomal mic fcnd loc
subunitii ribozomale mari, care se asambleaz cu cea mic formnd ribozomul funcional
(Figura 10.3, Tabel 10.1).
Deoarece ARNt iniiator este legat la situsul ribozomal P, sinteza proteinei este gata s
nceap odat cu legarea urmtorului ARNt cuplat cu aminoacidul su (AA-ARNt) care se leag
la situsul ribozomal A. Formarea legturii peptidice dintre gruparea carboxil a aminoacidului
legat de ARNt din situsul P i gruparea amino a aminoacidului din situsul A (alungirea lanului
polipeptidic) este catalizat de o enzim numit peptidiltransferaz (face parte din structura

Note de
curs20
Biologie celulara si moleculara

subunitii 50 S ribozomale). Acesta etap necesit GTP i a factorilor de elongaie FE-Ts


(stable temperature) i FE Tu (unstable temperature).

Figura 10.3 Iniierea procesului de sintez proteic


n ultima etap de cretere a lanului polipeptidic intervine factorul de cretere FE-G
(translocaza) i sursa de energie GTP.
Tabelul 10.1 Etapele alungirii lanului peptidic i caracteristicile la nivel ribozomal

Etapele creterii lanului polipeptidic Modificri la nivel ribozomal

ARNt -met Prsete situsul ribozomal P deplasndu-


se ctre situsul E
Peptidil ARNt (legat de lanul Se deplaseaz de la situsul A la P
polipeptidic n curs de sinteza) legat de
ARNm prin interaciunea codon-
anticodon
Translocaia ARNt Trecerea la situsul P
Deplasarea ribozomului de-a lungul
ARNm cu un codon, se elibereaz un nou
codon care va fi plasat in situsul A pentru
a fi recunoscut de anticodon

ARNm procariotic este policistronic, adic posed informaia necesar pentru sinteza mai
multor proteine diferite, care vor rezulta din aceeai molecul de ARNm, iar la eucariote ARNm
este monocistronic, adic poart informaia pentru sinteza unei singure proteine.

Note de
curs21
Biologie celulara si moleculara

Sinteza unei proteine este oprit printr-un semnal determinat de prezena codonilor stop:
UAA, UAG, UGA. Proteinele numite factori de eliberare se leag de codonul stop care ajunge n
situsul A al ribozomilor (Figura 9.4). Aceast legare afecteaz activitatea peptidil transferazei i
o determin s adauge o molecul de ap la peptidil-ARNt n locul unui aminoacid. Aceast
reacie desprinde captul carboxil al lanului polipeptidic n cretere, de pe ARNt i ca urmare
lanul polipeptidic este eliberat n citoplasm.

Figura 10.4 Finalizarea procesului de sintez a lanului polipeptidic-1-fixarea factorului


de eliberare pe codonul stop UAG; 2- desprinderea captului carboxil al lanului polipeptidic i
eliberarea acestuia de ribozom; 3-disocierea subunitilor ribozomale (dup Alberts, modificat)
Ribozomul elibereaz ARNm i se disociaz n cele dou subuniti, care se pot asambla pe
o alt molecul de ARNm pentru a ncepe un nou ciclu de sintez proteic.
ARNm poate fi tradus simultan de civa ribozomi, att la celulele procariote, ct i la
eucariote. Odat ce un ribozom s-a deplasat de pe situsul de iniiere, un alt ribozom se poate lega
de ARNm i poate ncepe sinteza unui lan nou polipeptidic.
Ca urmare ARN m este tradus de mai muli ribozomi aezai la intervale de 100-200
nucleotide. Grupul de ribozomi (4-50) ataai la o molecul de ARNm este numit poliribozom
sau polizom. Fiecare ribozom din grup funcioneaz independent pentru a sintetiza un lan
polipeptidic separat.

Note de
curs22
Biologie celulara si moleculara

Mecanismele moleculare de aciune a medicamentelor asupra funcionrii


acizilor nucleici i asupra sintezei de proteine
nelegerea modului n care funcioneaz replicarea ADN, sinteza ARN i translaia a
permis elaborarea unor medicamente care s foloseasc mecanismele de blocare a proceselor
nucleare sau de sintez proteic la organismele patogene.
Pe aceste principii au fost create, n special, medicamentele bacteriostatice Exist mai
multe ci de inhibiie bacterian:
1. Inhibarea precursorilor bazelor azotate din structura acizilor nucleici
Acidul tetrahidrofolic (THF) este o coenzim din sinteza bazelor purinice (adenina i
guanin) i a timidinei (constituieni majori ai acizilor nucleici). Formarea THF din precursorul
dihidrofolat (DHF) este catalizat de o enzim numit dihidrofolat reductaz.
Tabel 10.2 Modalitatea de aciune molecular (inhibiia sintezei bazelor azotate) a unor
tipuri de medicamente bacteriostatice

Medicament Caracteristici- efecte Mecanism de inhibare


bacterian
Sulfonamide -Bacteriostatice cu spectru Inhib sinteza acidului p-
larg aminobenzoic (PABA),
precursor n sinteza DHF
bacterian

Trimethoprim -bacteriostatic Inhib DHF reductaza


Co-trimoxazole -combinaii dintre Inhib sinteza THF prin
Trimethoprim i sulfonamide combinarea mecanismelor
(sulfmethoxazole) celor dou componente

Sulfasalazine -tratamentul infectiilor n tractul digestiv bacteriile


(salazosulfapyridine) tractului digestiv scindeaz compusul n
sulfanamide sulfapyridine i
mesalamide (5-aminosalycilic
acid)
Dapsone -n terapia unor boli severe Inhib sinteza DHF
lepra

Note de
curs23
Biologie celulara si moleculara

-tratament preventiv n
malarie, toxoplasmoz
actinomicoze

DHF este produs din acidul folic, vitamin ce nu poate fi sintetizat de organismul uman,
dar trebuie introdus din surse exogene, prin alimentaie. Spre deosebire de organismul
eucariotelor, bacteriile nu au nevoie de acid folic ntruct pot s-i sintetizeze DHF din
precursori ai metabolismului propriu.
Cunoscndu-se aceste elemente particulare ale bacteriilor, n privina sintezei de DHF, au
fost create medicamenete cu efect bacteriostatic (Tabel 10.2) care s nu afecteze celulele umane,
dar care s interfereze selectiv cu biosinteza bacterian a THF.

2-inhibarea funciei ADN i a enzimelor implicate n replicare sau transcripie


Sunt folosite substane care inhib citirea informaiei genetice (transcripia) ADN-ului
genernd distrugerea centrului reglator al metabolismului bacterian (Tabel 10.3). Unul din
mecanismele folosite de medicamente are ca int inhibarea unei enzime eseniale n desfacerea
moleculelor de ADN pentru realizarea transcripiei sau condensarea (superrsucirea) filamentelor
de ADN, dup replicarea acestuia. Aceasta enzim este denumit la bacterii giraz si face parte
din categoria topoizomerazelor II.
De asemenea, pot fi inhibate enzimele de tipul ARN polimeraze implicate direct n
catalizarea transcriiei.
Tabel 10.3 Modul de aciune al bacteriostaticelor prin mecanisme inhibitorii la nivel
enzimatic

Medicament Caracteristici- efecte Mecanism de inhibare


bacterian
ofloxacin -bactericid Inhibitor al girazelor
bacteriene
acid nalidixic -folosit n infectii urinare; Inhibitor al girazelor
afecteaz exlusiv bacteriile bacteriene
gram-negative
norflaxacin -spectru larg Inhibitor al girazelor
bacteriene
metronidazol Efect bactericid Distruge filamentele de ADN,
derivat al n condiii anaerobe, prin
azomycin conversia n metaboliireactivi
(nitroimidazole) (hidroxilamine)
timidazol Efect antiprotozoare precum: Similar metronidazol
Trichomonas vaginalis
(cauzeaz vaginite si
uretrite)
Entamoeba hystolitica
(infectii digestive grave,
Note de
curs24
Biologie celulara si moleculara

infectii hepatice)
rifampin Bactericid pentru formele Inhibitor al enzimelor de tipul
gram-negative i ARN polimeraze
grampozitive precum i
pentru micobacterii
(Mycobacterium
tuberculosis i M. Leprae)
rifabutin Idem rifampin si se Efect molecular similar
administreaz cand se creaz rifampin
rezistena la rifampin

3- inhibarea sintezei proteinelor


Mecanismele sunt diverse (Tabel 10.4) i const n:
- inhibarea recunoterii de ctre ARNm a complexului aminoacid-ARNt
-sinteza de proteine greite care sunt ulterior lizate
- inhibarea enzimelor peptidil- sintetaze precum i a funcionrii ribozomale.

Tabel 10.4 Medicamente implicate n inhibarea sintezei proteice

Medicament Caracteristici- Mecanism de inhibare


efecte bacterian
Tetraciclina Inhib legarea complexului
AA-ARNt la ARNm prin
blocarea sistemului
codon(ARNm)-anticodon
(ARNt)
Streptomycin Gram-negativ Induc sinteza unor secvente
Kanamycin bactericid indicat n proteice gresite
(aminoglycoside) tratamentul
tuberculozei
Chloramphenicol Inhib enzimele de tipul
peptid-sintetaze (peptidil
transferaze)
Erythromycin Bacteristatic (formele Inhibitor avansat al
(Erythromycin stearate- sarea gram-pozitive) ribozomilor
Erythromycin succinate-ester) Bine tolerat
Derivati: Folosit n alergii la
-Azithromycin peniciline
-Clarithromycin
-Roxithromycin
Clindamycin Bacteristatic n Inhibitor avansat al

Note de
curs25
Biologie celulara si moleculara

special pentru gram- ribozomilor


pozitive aerobe i
anaerobe
Este semisintetic
(include derivati de
Streptomyces sp)

CAPITOLUL 11

MODIFICRILE FIZIOLOGICE ALE LANURILOR POLIPEPTIDICE


SUB INFLUENA ENZIMELOR
Enzimele i mecanismele catalizei enzimatice
Reglarea activitii enzimatice

Enzimele citocrom P450

Asamblarea proteinelor prin formarea de legturi covalente ntre catenele polipeptidice nu


este singura cale de construcie a unor structuri proteice mai complicate. Lanurile polipeptidice
nu acioneaz ca nite proteine globulare singulare, ci se asociaz n agregate de monomeri sau
oligomeri.
nainte de asociere, lanul polipeptidic poate suferi ns scindri sau transformri ale
resturilor de aminoacizi componeni pentru a putea rspunde obiectivului fiziologic al
organismului de a dispune de proteina potrivit la locul i la timpul necesar. Modificarea
resturilor de aminoacizi confer, de exemplu enzimelor, noi proprieti.
Inactivarea i degradarea proteinelor reprezint o proprietate biologic tot att de
important ca i sinteza lor. Degradarea lor este necesar pentru a elimina proteinele deficiente
sau nedorite la un moment dat.

Note de
curs26
Biologie celulara si moleculara

Stadiul primar n degradarea unei proteine este scindarea specific a ctorva legturi
peptidice, urmat de proteoliza nespecific comun tuturor proteinelor. Se pare c n procesul de
transformare a catenelor polipeptidice au loc nu numai procese de scindare, ci si procese opuse
proteolizei, adic legarea captului C-terminal al unei peptide cu captul N- terminal al altei
peptide obinndu-se lanuri mai mari (fenomen observat n unele activiti bacteriene).
Proteoliza limitat cu ajutorul enzimelor este modul frecvent ntlnit la organismele vii
pentru sinteza proteinelor active.
Exemple :
- activitatea precursorilor enzimelor proteolitice
- procese morfogenetice ale unor virusuri
- mecanisme succesive ce intervin n coagularea sangelui
- mecanisme implicate n formarea diferitelor proteine ca insulina, glucagonul,
colagenul, proteinele virale.

n general ntr-o peptid se modific, dup terminarea biosintezei, puine resturi de


aminoacizi i prin aceasta se modific specificitatea ei. Modificarea restului de aminoacid se face
de obicei la captul N-terminal, gruparea amino fiind acetilat (mai rar formilat).
Modificri functionale prin proteoliz sunt evidentiate la tripsina. Dup cum se tie este
secretat n duoden, avnd ca precursor inactiv tripsinogenul care este scindat de enterokinaz
(localizat pe membrana celulelor epiteliale ale duodenului).
Aciunea specific a enterokinazei este legat de prezena n tripsinogen a secvenei ASP-
ASP-ASP-ASPLYS care servete drept semnal pentru recunoterea regiunii de scindare, dup
restul de lizin.
Dup acelai principiu al secvenei semnal sunt activate i proteinele plasmatice, acestea
funcionnd ca sisteme de aprare a organismului pentru eliminarea celulelor bacteriene sau
tumorale (cunoscute sub numele de imunoglobuline).

Enzimele i mecanismele catalizei enzimatice


Majoritatea reaciilor biologice sunt catalizate de proteine-enzime, care le accelereaz
viteza. Asemenea reacii se vor desfura n cteva fraciuni de secund, dac sunt catalizate de
enzimele adecvate.
Asemntori altor catalizatori, enzimele se caracterizeaz prin dou proprieti
fundamentale. Prima se refer la faptul c, enzimele cresc viteza reaciilor chimice, fr ca ele
nsele s fie consumate sau modificate de reacie. A doua: ele cresc viteza reaciilor fr s
modifice echilibrul chimic ntre reactani i produi.
Pentru ca reacia s se desfoare, substratul trebuie s treac mai inti ntr-o stare de
energie nalt, numit stare de tranziie. Energia necesar pentru a ajunge n aceast stare de
Note de
curs27
Biologie celulara si moleculara

tranziie este numit energie de activare i ea constituie o barier pentru evoluia reaciei
deoarece limiteaz viteza de reacie.
Enzimele celulare se combin cu moleculele biologice i reduc energia de activare a unor
reacii. Prin scderea a energiei de activare pentru o reacie sau alta, enzimele direcioneaz
moleculele biologice pe diferite ci metabolice. Activitatea enzimatic implic legarea lor la
substrat cu formarea unui complex enzim-substrat. Acest etap de legare este o
interaciunea foarte specific.
Situsurile active sunt alctuite din aminoacizi situai n diferite pri ale lanului
polipeptidic. Substraturile iniiale se leag la situsul activ prin interaciuni necovalente, care
includ legturi de hidrogen, legturi ionice i interaciuni hidrofobe.
Multe enzime pe lng faptul c reunesc mai multe substraturi i modific conformaia
substraturilor pentru a le apropia de starea de tranziie, particip direct la procesul catalitic. De
exemplu, chimotripsina este un membru al familiei de enzime serin proteaze, care diger
proteinele prin cataliza hidrolizei legturilor peptidice.
Diferii membri ai acestei familii de enzime (chimotripsina, tripsina, elastaza i trombina)
au specificitate de substrat distinct, deoarece cliveaz legturile peptidice adiacente dintre
diferii aminoacizi.

Astfel, n timp ce, chimotripsina diger legaturile adiacente ale aminoacizilor hidrofobi,
cum ar fi triptofanul i fenilalanina, tripsina diger legturile adiacente aminoacizilor bazici,
cum ar fi lizina i arginina.
Situsurile acestor enzime conin trei aminoacizi- serina, histidina i aspartanul, care
determin hidroliza legturii peptidice.
Substraturile se leag la serin proteaze prin inseria aminoacidului adiacent la situsul de
clivare n interiorul unui buzunar de la nivelul situsului activ al enzimei.
Natura acestui buzunar determin specificitatea substratului pentru diferiti membri ai
familiei de serin proteaze.

Coenzimele
Sunt molecule mici care acioneaz mpreun cu enzimele pentru a amplifica viteza
reaciilor. Aceste coenzime sufer modificri reversibile n reacia n care se implic. Ele sunt
reciclate si pot participa la numeroase reacii enzimatice.
Coenzimele servesc ca i transportori pentru diferite tipuri de reacii chimice. Astfel,
coenzima nicotinamid adenin dinucleotid (NAD+) funcioneaz ca un transportor de electroni n
reacii de oxido-reducere.
Multe coenzime transfer grupri chimice adiionale cum ar fi carboxil (biotina) sau grupul
acil (coenzima A) sau sunt derivai ai vitaminelor (NAD+ de la niacina, FAD de la riboflavin).

Reglarea activitii enzimatice

Note de
curs28
Biologie celulara si moleculara

O modalitate obisnuit de reglare este inhibiia prin feed back sau reglarea alosteric, n
care activitatea enzimatic este controlat prin legarea moleculelor mici la situsuri reglatoare de
pe enzime.
Moleculele reglatoare nu se leag la situsul catalitic, ci la un alt situs alosteric, de pe
protein (allo = altul, steric = situs). Legarea moleculelor reglatoare schimb conformaia
proteinei, care la rndul ei i modific forma situsului activ i activitatea catalitic.
n cazul treonin dezaminazei, enzima care face cataliza transformrii aminoacidului
treonin n izoleucin, legarea moleculei reglatoare (izoleucina= produsul reaciei ) i inhib
activitatea enzimatic. Uneori ns, moleculele reglatoare servesc ca activatori, stimuland enzima
int.
Activitile enzimatice pot fi reglate, prin interaciunea lor cu alte proteine i prin
modificrile covalente, cum ar fi adiia gruprilor fosfat la resturile de serin, treonin, sau
tirozin. Fosforilarea este un mecanism de reglare a activitii enzimatice. Adiia gruprilor
fosfat poate s stimuleze sau s inhibe activitile enzimatice.
De exemplu, celulele musculare rspund la epinefrin (adrenalin) prin clivarea
glicogenului n glucoz oferind o surs de energie pentru stimularea activitii musculare.
Descompunerea glicogenului este catalizat de enzima glicogen fosforilaz, care este activat
prin fosforilare ca rspuns a legrii epinefrinei la un receptor de pe suprafaa celulei musculare.
n schimb, prin fosforilare se inhib activitatea enzimei glicogen sintetaza i se mpiedic
sinteza glicogenului din glucoz. Fosforilarea proteinelor are un rol important, de asemenea, n
procesele de cretere i difereniere celular.

Enzimele citocrom P450


Cirocromul P450 este o familie multigenica de enzime, diversificate filogenetic, ca rspuns
la modificarile de mediu (dieta in principal), localizate n microzomii hepatici.

Enzimele P450 polimorfe pot produce abolirea, alterarea cantitativa sau calitativ sau
chiar potenarea unui medicament.

Alele P450 complet inactive au fost descoperite pentru CYP2D6, CYP2C19 i CYP2A6.
Alelele incomplet homozigote duc la absena total a enzimei active i la diminuarea capacitii
de metabolizare. Au fost identificate peste 30 alele i cam 55 variante de CYP2D6 deficiente.

Principalele cauze de variaie n metabolizarea medicamentelor sunt:


1) polimorfismul genetic
2) inducia sau inhibiia datorat terapiilor concomitente sau factorilor de mediu.

Tabel 11. 1. Enzime citocrom P450 CYP2D6 polimorfe i distribuia global a variantelor
majore de alele.

Note de
curs29
Biologie celulara si moleculara

Consecine - Caucazieni Asiatici Africani Etiopieni-


Alela
funcie % % % saudii %

CYP2D6*2xN Enzima 1-5 0-2 2 10-16


hiperactiv

CYP2D6*4 Enzima 12-21 1 2 1-4


inactiv

CYP2D6*5 Absena 2-7 6 4 1-3


enzimei

CYP2D6*10 Enzima 1-2 51 6 3-9


instabil

CYP2D6*17 Scade 0 ND 34 3-9


activitatea

Metabolismul ultrarapid este produs de gene CYP2D6, multiduplicate sau


amplificate. Au fost raportate alele cu 2, 3, 5 i 13 copii genetice, numrul indivizilor cu multiple
copii de gene CYP2D6 este mare n Etiopia i n Arabia Saudit (1/3 din populaie) i foarte
puini au gene CYP2D6 deficiente (Tabel 11.1).

CYP2C9 constituie una din izoenzimele principale ale citocromului P450 cu rol n
metabolismul medicamentelor. Astfel, CYP2C9 este responsabil de metabolizarea a 5% din
medicamentele prescrise, cele mai importante fiind: glipizida (hipoglicemic oral), fenitoina
(anticonvulsive, antiaritmic) acioneaz la nivel celular intervenind n funcionarea canalelor
ionice, transportul activ, stabilitatea membranelor i derivaii cumarinici (anticoagulani,
compui antineoplazici).

Analiza polimorfismului genetic CYP2C9 poate fi utilizat pentru identificarea variantelor


enzimatice cu activitate alterat care afecteaz metabolismul medicamentelor i care se asociaz
n cursul tratamentului cu un risc crescut de reacii adverse.

Enzima CYP2D6 i opioidele

O persoana cu 2 alele CYP2D6 nefuncionale are o metabolizare slab a medicamentelor n


timp ce o persoan cu una sau dou alele funcionale are un metabolism extensiv, iar o persoan
cu mai multe gene CYP2D6 duplicate sau amplificate are o metabolizare ultrarapid.

Subiecii cu 13 copii ale genelor CYP2D6 formeaz o cantitate mai mare de metabolii
dect cei cu mai puine gene CYP2D6 active. Se formeaz masiv morfina, la aceti subieci, cnd
iau codein care este metabolizata de CYP2D6.

Note de
curs30
Biologie celulara si moleculara

Efectul opioid al codeinei este corelat cu concentraia plasmatic a morfinei produs prin
metabolizarea codeinei administrate. Codeina este ineficace la doze uzuale, la 7-10% din
populaia alba, din cauza alelelor CYP2D6 nefuncionale, homozigote. Pe de alt parte, la
persoanele cu metabolism ultrarapid, codeina administrat poate produce masiv morfina.

Note de
curs31