DEFORMĂRI ALE CIOCULUI LA

PĂSĂRI TRANSMISE EREDITAR

Profesor coordonator: Simona Marc Zarcula

Student: Mușoiu Alexandru
 Pe baza noii generații de secvențiere de înaltă performanță și
tehnologie de calcul de înaltă performanță, expresia genică digitală
(DGE) poate fi utilizată pentru a captura întregul transcriptom al unui
țesut dat. Scopul acestui prim studiu a fost identificarea genelor legate
de fenotipul deformării ciocului folosind DGE ca punct de plecare
pentru dezvăluirea mecanismelor genetice moleculare care stau la baza
afecțiunii. Rezultatele au identificat seturi de gene reglate în sus și în jos
în ciocul deformat, comparativ cu normal. În combinație cu ontologia
genelor ulterioare și analizele de îmbogățire a căilor ale genelor
exprimate diferențial (DEG), sunt propuse și discutate unele gene
candidate și căi legate de deformarea ciocului.

Materiale și metode

Probe și izolarea ARN

Mandibulele inferioare ale ciocurilor au fost colectate de la 6

cocoși Beijing-You în vârstă de 56 de zile: 2 cu ciocurile încrucișate
(indivizii 1 și 2) și 4 cu ciocurile normale (indivizii 3, 4, 5 și 6). Indivizii
1, 3, 5 și 6 au fost frați întregi; la fel ca indivizii 2 şi 4. Puii fuseseră
incubaţi şi adăpostiţi în aceleaşi condiţii. ARN-ul total al mandibulelor
inferioare ale ciocurilor a fost izolat folosind TRIzol (Invitrogen, SUA)
conform instrucțiunilor producătorului urmat de tratament cu DNază
fără RNază (TIANGEN, China). Calitatea și cantitatea ARN-ului total
au fost evaluate cu un Biophotometer Plus (Eppendorf, Germania).
ARN-ul din ciocul individului 1 (deformat) și 6 (martor) a fost utilizat
pentru a determina DEG-urile la nivelul întregului genom folosind
profilarea DGE. Patru perechi de probe de ARN (2 și 4, 1 și 3, 1 și 5 și 1
și 6) au fost utilizate pentru a determina abundența relativă a 8
transcrieri utilizând PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR).
Profilarea etichetelor DGE și adnotarea secvenței ADNc a fost
preparat din ARN1 și 6, digerat și ligat cu adaptoare Illumina, așa cum s-
a recomandat, pentru a genera fragmente marcate de 17 bp pentru
secvențierea Solexa, care a fost realizată de BGI (Beijing, China).
Etichetele curate au fost obținute prin filtrarea secvențelor
adaptoare și eliminarea secvențelor de calitate scăzută (cele cu unele
baze ambigue), apoi mapate la genomul de referință și genele de găină.
Numai etichetele cu o potrivire perfectă sau o nepotrivire au fost luate în
considerare și adnotate în continuare. Nivelul de expresie al fiecărei
gene a fost estimat prin frecvența etichetelor curate și apoi normalizat ca
TPM (număr de transcrieri per milion de etichete curate) .

Identificarea DEG-urilor
 Expresia diferențială a genelor între ciocul deformat și normal a
fost determinată cu o metodă riguroasă a algoritmului, care a fost
dezvoltată pentru a identifica DEG-urile între două probe de către BGI
(Beijing, China), cu referire la metodele publicate de Audic și Claverie.
Notați numărul de etichete curate neechivoce din gena A ca x, deoarece
expresia fiecărei gene ocupă doar o mică parte din bibliotecă, p(x) este
în distribuția Poisson:

Numărul total de etichete curate al probei 1 este N1, iar numărul

total de etichete curate al probei 2 este N2; gena A deține etichete x în
eșantion1 și etichete y în proba 2. Probabilitatea ca gena A să fie
exprimată în mod egal între două probe poate fi calculată cu:

Valoarea P corespunde testului de expresie genică diferențială.

Genele au fost considerate ca fiind exprimate în mod semnificativ
diferit, cu o valoare P <0,005, FDR (rata de descoperire falsă) <0,001 și
un prag de variație relativă de 2 ori (|log2-Ratio (cioc deformat/cioc
normal)| >1) [18] în numărătoarea de secvențe din cele 2 biblioteci.
Toate genele din prezentul studiu au fost menționate din setul de date
genetice al GenBank.

Ontologia genelor (GO) și analiza îmbogățirii căilor deg-urilor

Pe baza bazei de date privind ontologia genelor și a căii KEGG,

analiza îmbogățirii funcționale a GO și analiza îmbogățirii căilor au fost
utilizate pentru a identifica clasificarea funcțională și, respectiv, căile
metabolice îmbogățite în mod semnificativ în DEG]. Formula a fost:

unde N este numărul total de gene cu

adnotări funcționale GO/KEGG, iar n este numărul de DEG-uri din N,
M este numărul genelor cu adnotări specifice GO/KEGG, iar m este
numărul de DEG-uri din M. În acest studiu, valoarea P ≤0,05 a indicat
termeni și căi go îmbogățite în mod semnificativ.

Analiza qRT-PCR pentru validarea DEG-urilor

Opt gene (tabelul 1), selectate din DEG-uri, au fost analizate de

qRT-PCR cu un sistem de detectare în timp real ABI 7500 (Applied
Biosystems, SUA) pentru a valida rezultatele DGE. Au fost utilizate
eșantioane totale de ARN (1 μg) din patru perechi de comparație. Gena
de menaj β-actina a fost folosita ca martor endogen. Grundurile
specifice genelor au fost proiectate din secvențele unigene de referință
disponibile în GenBank folosind Primer Premier 5.0 (Tabelul 1). qRT-
PCR a fost efectuat în trei exemplare conform specificațiilor
producătorului (TaKaRa SYBR PrimeScript RT-PCR Kit, Dalian,
China). După denaturarea la 95°C timp de 30 s, au fost utilizate 40 de
cicluri de 95°C pentru 5 s și 60°C pentru 32 s, urmate de denaturarea
termică pentru a genera curbe de topire pentru a verifica specificitatea
amplificării. Metoda ct comparativă (2−ΔΔCT) a fost folosit pentru a
determina modificările de pliere în abundența transcrierii. Testele t ale
elevilor au fost utilizate pentru a evalua diferențele dintre probele de
ARN ale ciocurilor deformate și cele normale.

Tabelul 1
 Rezultatele DGE au fost confirmate de qRT-PCR

Pentru a verifica analiza DGE de mai sus, 8

gene NPM3, LPL, BMP4, SGOL1, KRT19, sKer, MMP7 (matrice
metaloproteinaza 7) și MUC din DEG-uri au fost examinate de qRT-
PCR folosind ARN din ciocurile a 4 perechi de sib complet, cu și fără
fenotipul de deformare. Rezultatele (Figura 7) au arătat un bun acord cu
modelul de analiză al DGE, indicând fiabilitatea acestuia din urmă.

Figura 7. qRT-PCR de 8 transcrieri pentru validarea rezultatelor DGE.

Axa orizontală identifică cele 8 transcrieri examinate de qRT-PCR; axa verticală
prezintă nivelul relativ de expresie a genelor în țesuturile deformate (indivizii 1 și
2) față de cele normale (indivizii 3, 4, 5 și 6). Cele 4 perechi de indivizi au fost
toate sibs plin. Prima bară arată valoarea obținută din DEG folosind 1 și
6. NPM3 = nucleofosmină/nucleoplasmină 3; LPL = lipoprotein lipază; BMP4 =
proteina morfogenetică osoasă 4; SGOL1 = shugoshin-ca 1; KRT19 = Keratină
19; sKer = similar cu keratina Scale; MMP7 = matrice metaloproteinaza 7; MUC =
proteină mucină.

Mecanismul genetic molecular care stă la baza deformării ciocului

este probabil să fie foarte complex. Pe baza analizelor DGE și
bioinformatice utilizate în prezentul studiu, Curtea a identificat DEG-
urile în ciocurile deformate și normale, dintre care unele erau destul de
extreme, și a constatat căile îmbogățite ale DEG. Unele DEG-uri și căi
au fost selectate ca gene candidate probabile legate de deformarea
ciocului.

DEG-uri între ciocurile deformate și cele normale

În prezentul studiu, au fost identificate 1 156 de DEG-uri cu o

diferență de expresie de peste 2 ori mai mare. Dintre acestea,
aproximativ o treime au fost up-reglementate, iar restul au fost down-
reglementate în cioc anormale. Trei gene au fost selectate ca gene
candidate promițătoare pe baza funcțiilor lor cunoscute, precum și a
raporturilor lor diferențiale, identificate aici. Gena cea mai profund
reglată (log2-Ratio (cioc deformat/cioc normal) = 10,91) a
fost LOC426217, un membru ipotetic al genei keratinei 3. Keratina este
o proteină importantă a citoscheletului care joacă un rol esențial în
menținerea morfologiei celulare . Este, de asemenea, o proteină filament
intermediară care are funcții esențiale în menținerea integrității
structurale a epidermei și a apendicelor sale ], probabil incluzând ciocul.
Deși rolul mecanicist cheie al LOC426217 nu este încă cunoscut,
rezultatele DEG-urilor noastre sugerează că are un rol în menținerea
morfologiei ciocului. La cealaltă extremă, MUC a fost gena cea mai
reglată în jos (log2-Ratio (cioc deformat/cioc normal) = −12,11, adică
>4000-fold). Este, de asemenea, o genă din jurul multor familii de gene ,
al cărei produs de expresie este mucina, o cohortă de proteine foarte
glicozilate produse de țesuturile epiteliale și implicate în formarea
oaselor . Deja demonstrat de alții ca fiind o genă cheie în dezvoltarea
morfologiei ciocului și prezentat aici ca fiind oarecum up-reglementat
(log2-Ratio (cioc deformat/ cioc normal) = 1,55), BMP4 este inclus în
grupul nostru de gene candidate provizorii asociate cu deformarea
ciocului.

Concluzii

Din câte știm, aceasta este prima dată când genele legate de
deformarea ciocului au fost identificate folosind analiza expresiei
genelor la nivel de genom. Rezultatele au sugerat că 11 gene candidate
merită studii suplimentare : MUC,  LOC426217 , BMP4 , ACAA1
, LPL, ALDH7A1, GLA, RETSAT, SDR16C5, WWOX și MOGAT1.
Mai multe dintre gene corespund componentei celulare go categorie și
analiza KEGG a arătat importanța căi de biosinteza acizilor grași
nesaturați și metabolismul glicerolipid. Studii ulterioare, inclusiv
explorarea, analiza rețelei, analiza secvențierii și verificarea funcțională
vor fi efectuate în aceste gene candidate, care ar putea dezvălui în cele
din urmă cauzele punctuale ale deformării ciocului și mecanismele care
stau la baza tulburării la găini, precum și la păsările sălbatice.

Bibliografie : Identification of Genes Related to Beak Deformity of Chickens Using Digital Gene
Expression Profiling | PLOS ONE