Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Îmbinarea alternativă (AS) este un mecanism de schimbare a îmbinării. Exonii pre-ARNm sunt legați
de AS în diferite ordine pentru a forma un număr mare de transcrieri cu secvențe diferite de
codificare a proteinelor (schimbări de cadru, inserții și deleții) și/sau elemente de reglare a ARN
(eficiența traducerii, stabilitatea și localizarea ARN-ului.
Au fost definite cinci modele universale de SA, inclusiv exoni casete, exoni care se exclud reciproc,
concurând 5 prim sau 3prim
locuri de îmbinare și introni reținuți (4,5,40). Studiile arată că mai mult de 90% dintre genele umane
suferă SA, cu modificări evidente între tipurile de țesuturi și etapele de dezvoltare (21,48,68). AS
produce rareori răspunsuri „da sau nu” la stimuli; în general, produsele AS coexistă într-o singură
celulă și oferă celulei capacitatea de a gestiona diferiți stimuli interni și externi. Interesant este că
până la o treime din transcrierile AS generează codoni de terminare prematură și suferă dezintegrare
a ARN-ului mediată de nonsens.
Splicing-ul este modulat de secvențe de ajutor scurte (~10 nt) care ajută la definirea exonilor reali.
Aceste secvențe conservate, numite elemente de reglare cis (numite și coduri de splicing), sunt
situate în regiunile exonice sau intrronice ale genei. Acestea conțin amplificatori de îmbinare exonic
și intrronic (ESE și, respectiv, ISE), care promovează includerea exonilor și, dimpotrivă, amortizoare
de îmbinare exonic și intrronic (ESS și respectiv ISS), care promovează excluderea exonilor
Cu toate acestea, au fost găsite excepții de la acest tip de reglementare. Unii factori de splicing care
acționează trans pot modula includerea sau excluderea exonilor în mod pozitiv sau negativ, în funcție
de regiunile de legare în raport cu exonul AS (15, 66). Aceste studii au arătat că situsurile
interacțiunilor proteină-ARN joacă un rol important în reglarea splicing-ului. În plus, unele elemente
de reglare cis pot regla AS prin determinarea directă a structurii secundare pre-ARNm (6). Studii
recente au indicat că controlul epigenetic determină nu numai ce părți ale genomului sunt exprimate,
ci și modul în care sunt îmbinate (38). Modelele AS și raportul relativ al factorilor specifici de
îmbinare cu acțiune trans sunt dinamice și răspund la semnalele intra și extracelulare. Modificarea
cromatinei, factorii de transcripție, modificările posttranscripționale și modificările posttranslaționale
reglează factorii de splicing cu acțiune trans, influențând nivelul lor celular, activitatea sau localizarea
Deși au fost efectuate numeroase studii asupra funcțiilor și mecanismelor AS pentru gene specifice,
rolurile evenimentelor AS (hărți de îmbinare a ARN) în general abia acum încep să fie explorate.
Micromatricele AS cu mai multe sonde hibridizate cu joncțiuni exon-exon permit profilarea la scară
largă a AS (5). După hibridizare, sondele din exonii constitutivi ai probei pot fi evaluate pentru
prezența sau absența joncțiunii exonului (44).
AS aberantă a fost bine cunoscută în multe boli, inclusiv cancer (11) și tulburări neurodegenerative
(1,22). În sistemul nervos, câteva mii de evenimente AS joacă un rol important în transportul ionilor,
recunoașterea receptorilor, neurotransmisia, memoriei și învățarea (1). Nu este surprinzător,
reglarea greșită a SA este importantă în bolile asociate (69). Siturile AS sunt afectate de multe mutații
ale elementelor cis-reglatoare care interferează cu secvența de reglare a ARN și de mutații ale
factorilor de splicing cu acțiune trans care modifică cantitatea sau activitatea factorilor. Boala
Parkinson (PD), a doua cea mai frecventă tulburare neurodegenerativă progresivă a sistemului nervos
central, afectează câteva milioane de oameni din întreaga lume (
Cele trei caracteristici clinice de bază ale PD sunt rigiditatea, tremorul în repaus și bradikinezia (53).
PD este cauzată de agregarea proteinelor, cum ar fi în corpii Lewy (LB) și pierderea neuronilor care
conțin dopamină în substanța neagră a creierului mediu (12). Deficiența de dopamină, disfuncția
proteazomală, activitatea complexului mitocondrial-1 și markerii stresului oxidativ caracterizează PD
(58). Deși majoritatea cazurilor de PD apar sporadic, mutația genetică și îmbătrânirea sunt factorii
majori care sunt legați fără ambiguitate de această tulburare. În prezent, nu este disponibilă o
terapie eficientă pentru PD, dar medicamentele, intervenția chirurgicală și managementul
multidisciplinar pot oferi ameliorarea simptomelor.
Direcțiile active de cercetare pentru tratamentul PD includ dezvoltarea unui nou model animal și
studiile potențialilor agenți neuroprotectori, terapia genică și transplanturile de celule stem
(8,24,37,43,59,70,71). Din cunoștințele noastre, șase gene, inclusiv PARK2 [proteina parkinson 2, E3
ubiquitin protein ligase (parkin)], SNCAIP [a-sinucleină, o proteină care interacționează (sinfilina)],
LRRK2 [kinază repetitivă bogată în leucină 2 (dardarina) ], SNCA (a-sinucleină), SRRM2
(serina/arginine repetitive matrix 2) și MAPT (microtubule-associated protein tau), sunt implicate în
evenimentele aberante de SA la pacienții cu PD. În această revizuire, evidențiem relevanța SA în PD.
În plus, discutăm despre utilizarea profilului AS ca potențial marker de diagnostic sau prognostic și ca
mijloc de aplicare a terapiei.
PARK2 Gena PARK2, care codifică parkinul, este mutată în parkinsonismul juvenil autosomal recesiv
(ARJP, absența LB-urilor în PD). Proteina este exprimată în mod normal în multe zone ale creierului și
este implicată în sistemul proteazomului ubiquitin ca o ubiquitin-ligază E3
D’Agata și Cavallaro au analizat speciile de ADNc care codifică variante AS de parkin din creierul uman
fetal și șobolan adult. AS are potențialul de a exprima sute de izoforme diferite de proteine cu
diferite compoziții de aminoacizi, modificări post-translaționale și structuri moleculare. Aceste
izoforme diferă prin prezența sau absența domeniului asemănător ubiquitinei, a unuia sau a două
degete inelare C3HC4, a domeniului degete inelare intermediare și a unui situs activ de tiol protează,
care nu a fost caracterizat anterior. Profiluri de expresie distincte apar în culturile primare de celule
neuronale și gliale. Diversitatea structurală a izoformelor AS de parkin poate avea implicații
importante pentru mecanismele patogenetice care stau la baza ARJP
Tan şi colab. a arătat o variantă AS a parkinului (E4SV) în substanța neagră și leucocite ale pacienților
cu PD sporadică. Ștergerea exonului 4 (122 bp) a creat o schimbare a cadrului de citire peste
joncțiunea exonilor 3–5 și un codon stop în aval de exonul 3. Proteina trunchiată a fost legată de o
pierdere totală a domeniului degetelor cu două inele și, prin urmare, cu o pierdere totală a activității
enzimatice. Expresia E4SV a fost crescută la pacienții cu PD sporadică comparativ cu martorii
sănătoși. Mai mult, expresia E4SV a crescut odată cu vârsta la pacienții cu PD, dar acest lucru nu a
fost observat la martori.
SNCAIP Synphilin-1, codificată de gena SNCAIP, este o proteină presinaptică legată de terminalele
sinaptice (52). Sinfilina-1 poate juca un rol cheie în formarea LB, deoarece coexprimarea parkinei,
sinfilin-1 și a-sinucleinei promovează formarea incluziunilor citoplasmatice care seamănă cu LB
(9,18). În plus, sinfilina-1 este unul dintre substraturile parkinei (9) și pare să conecteze sistemul
proteazomului ubiquitin cu funcția sinaptică. Sinfilina-1 are două domenii funcționale principale: unul
este
LRRK2 Kinaza 2 repetată bogată în leucină (dardarin), codificată de gena LRRK2, este un membru al
grupului ROCO din superfamilia Ras/GTPase. Se caracterizează prin existența mai multor domenii
conservate, inclusiv un domeniu Roc (Ras în proteine complexe), un domeniu COR (terminal C al Roc),
o regiune repetă bogată în leucină, un domeniu WD40 și un catalitic protein kinază. domeniul (14).
Funcția LRRK2 nu este încă cunoscută. Poate fi o kinază citoplasmatică care participă la fosforilarea
substraturilor implicate în patogenia PD (47,72). Gena LRRK2 are 51 de exoni și codifică o proteină
estimată de 2527 de aminoacizi. Mutațiile în LRRK2 sunt cea mai frecventă cauză genetică atât a
parkinsonismului familial cu debut tardiv, cât și a PD sporadic aparent.
SNCA a-Synuclein (a-syn) este o proteină presinaptică codificată de gena SNCA, prima genă indicată
în patofiziologia PD (51). O caracteristică neuropatologică a PD este existența LB-urilor în neuronii
substanței negre care supraviețuiesc, care constau în principal din a-syn (60). a-Syn are multe efecte
asupra funcției celulare: inhibă fosfolipaza D2 (50), se asociază cu transportorii de dopamină,
schimbând homeostazia dopaminei (35), funcționează ca un însoțitor molecular (49) și
interacționează cu proteine specifice pentru a modifica funcţia lor celulară (61). Structura a-syn este
caracterizată prin șase secvențe repetate care formează cinci elice amfipatice la capătul N-terminal și
printr-un capăt C-terminal acid, bogat în glutamat, care susține proteina în formă solubilă și
funcționează ca un chaperon. Dovezile acumulate evidențiază consecința dozajului a-syn și a
nivelurilor de expresie în patogeneza PD. Cu toate acestea, variabilitatea genetică în regiunea 3 ¢ a
SNCA a fost frecvent legată de susceptibilitatea la PD sporadic. Studiile au indicat că un capăt C-
terminal acid al a-syn este necesar pentru funcția sa fiziologică normală; ștergerea capătului C-
terminal permite proteinei să se agreeze mai ușor
Structura genică a SNCA relevă existența a șapte exoni, dintre care cinci corespund unei regiuni de
codificare. Studiile izoformelor AS ale SNCA au confirmat expresia diferențială legată de boală (3).
SNCA are patru izoforme majore: SNCA 140 cu lungime completă și transcripțiile trunchiate SNCA126
(ștergeri în cadru lipsite de exon 3), SNCA112 (ștergeri în cadru fără exonul 5) și SNCA98 (ștergeri în
cadru fără exon 3 și exon). 5) (7,65). În regiunile SNCA 3¢, o ștergere a exonului 5 (SNCA112) prezice
efecte funcționale relevante pentru patologia LB. Deleția provoacă scurtarea evidentă a capătului C-
terminal acid nestructurat și s-a dovedit că îmbunătățește agregarea a-syn, care poate direcționa
formarea LB (2,26,36,60). McCarthy și colab. a studiat efectul variantelor legate de riscul de PD la
regiunile SNCA 3¢ asupra nivelurilor de ARNm SNCA112 in vivo în 117 mostre de cortex frontal al
creierului de la pacienți normali neuropatologic. Polimorfismele cu o singură nucleotidă care
etichetează regiunile SNCA 3¢ au arătat efecte considerabile asupra nivelurilor comparative de ARNm
SNCA112 din nivelurile totale de transcript SNCA. Alelele „de risc” au fost asociate cu un raport de
expresie îmbunătățit al ARNm SNCA112 din total. McCarthy și colab. oferă dovezi pentru efectele
funcționale ale variantelor SNCA asociate cu PD în regiunea 3¢, indicând faptul că modularea
genetică a SNCA AS joacă un rol important în dezvoltarea PD
Unele studii au sugerat o corelație puternică între disfuncția proteazomală și agregarea a-syn
ca una dintre căile cheie responsabile pentru formarea LB-urilor și distrugerea neuronilor
dopaminergici (12,45). Toxine specifice mitocondriilor sau inhibitori ai complexului 1 - 1-metil-4-
fenilpiridiniu (MPP+), un produs metabolic al 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridinei (MPTP) și
rotenonei — generează simptome similare cu cele ale PD și amplifică expresia și agregarea a-sin (56).
Folosind mimetice ale parkinsonismului [MPP(+), rotenonă] și oxidanți înrudiți, Kalivendi și colab. au
identificat un AS generat de oxidant al ARNm SNCA, care induce SNCA112. Această izoformă AS are o
localizare modificată și inhibă puternic funcția proteazomală. Inducerea SNCA112 a fost blocată de
MEK-1 [protein kinaza activată de mitogen (MAPK) kinaza 1] și îmbunătățită prin suprimarea căii
kinazei reglate de semnal extracelular (Erk)-MAP kinazei. Supraexprimarea SNCA112 a promovat
moartea celulelor în celulele dopaminergice umane în comparație cu proteina de lungime completă.
Exprimarea SNCA112 și disfuncția proteazomală a fost, de asemenea, clară în substanța neagră și
într-o măsură mai mică în striatul, dar nu și în cortex, a șoarecilor tratați cu MPTP. Kalivendi și colab.
arată că AS generată de oxidanți de SNCA joacă un rol central în mecanismul morții celulelor
neuronilor dopaminergici și, prin urmare, are ca rezultat PD (33). O considerație atractivă este că
variantele polimorfe legate de PD ar putea afecta SA de SNCA ca un mecanism potențial al bolii.
MAPT Gena MAPT codifică proteina tau. Tau este o proteină asociată cu microtubuli (MT) care
funcționează fundamental pentru a ajuta la asamblarea și stabilitatea MT. Exprimat în principal în
neuronii sistemului nervos central, este important în transportul axonal, polaritatea axonilor și
morfogeneza neuronală. Mutațiile MAPT modifică funcția proteinei sau reglarea genelor și induc
incluziuni citoplasmatice filamentoase insolubile în demența frontotemporală cu parkinsonism-
cromozom 17 de tip (FTDP-17), o boală autozomal dominantă (39). Unele mutații silențioase, cu sens
greșit sau cu ștergere ale MAPT sunt în regiunea de codificare și reduc activitatea de legare a tau la
MT și/sau scad capacitatea tau de a promova asamblarea MT în comparație cu tau normal. Aceste
mutații duc probabil la formarea filamentelor tau
În sistemul nervos central al omului adult, șase izoforme tau sunt generate din aceiași exoni sau AS
de exoni: exonii 2, 3 și 10. Exonii 9 până la 12 codifică patru domenii de legare MT cu repetare
defectuoasă. Exonul 10 (E10), care include o repetare de 31 de aminoacizi, dă cele trei izoforme cu
câte patru repetări de legare MT (4R tau). Celelalte trei izoforme tau au doar trei repetări fiecare (3R
tau). Mutațiile Tau ale FTDP-17 care cresc includerea E10 induc producția de exces de 4R tau, așa
cum se arată atât în tau solubil, cât și în cel insolubil din probele de autopsie FTDP-17 (25,29). Un
raport normal (1:1) de izoforme 3R la 4R tau este necesar pentru suprimarea dezvoltării patologiei
tau (28). Creșterea incluziunii E10 rezultă din mutații la capătul 3¢ al exonului 10, produse de cele
două baze terminale ale E10 și 16 baze din intronul adiacent, care formează destabilizarea buclei
stem ARN. Această buclă stem generează un loc de legare favorabil pentru ARN-ul nuclear mic U1 și
astfel crește eficiența de îmbinare a E10. La indivizii sănătoși, această buclă inhibă accesul mașinilor
de îmbinare la E10, blocând astfel includerea sa în ARNm. În plus, toate mutațiile raportate sporesc,
de asemenea, complementaritatea secvenței site-ului de îmbinare 5¢ la capătul 5¢ al ARN-ului
nuclear mic U1 (16). Elementele cu acțiune cis din E10 influențează, de asemenea, alegerea locului de
îmbinare
D’Souza și colab. indică faptul că mutațiile tau pot crește sau scădea AS de tau E10 acționând asupra
a trei elemente de reglare diferite care acţionează cis. Aceste elemente includ un ESE care poate fi fie
consolidat (N279K) fie distrus (delK280), provocând fie includerea constitutivă, fie excluderea E10 din
transcrierile tau. E10 conține un al doilea element de reglementare, care este un ESS, a cărui funcție
este abolită de o demență frontotemporală silentioasă cu mutație parkinsonism-17 (FTDP-17)
(L284L), care are ca rezultat includerea excesului de E10. Un al treilea element care blochează AS de
E10 este conținut în secvențele intrronice care flanchează site-ul de îmbinare de 5 ¢ al E10, iar
mutațiile FTDP-17 din acest element sporesc includerea E10.
Biomarkeri diagnostici, prognostici sau predictivi Până în prezent, diagnosticul PD apare în principal în
clinici și se bazează pe expresia fenotipică. Găsirea markerilor de laborator va îmbunătăți precizia
diagnosticului, va permite detectarea preclinică și va urmări progresia bolii. În secțiunile anterioare,
am discutat mai multe exemple care arată o legătură între dezvoltarea SA și PD. Este remarcabil că
izoformele AS par a fi specifice PD. Mai mult, dovezile arată că un set diferit de gene suferă schimbări
în profilurile AS în timpul dezvoltării PD. Shehadeh și colab. a efectuat analize cu microarray de exon
din sângele periferic al pacienților cu PD și a constatat că 218 gene suferă evenimente semnificative
de SA (55). Aceste evenimente specifice AS au sugerat imediat utilizarea lor potențială ca biomarkeri
de diagnostic, prognostic sau predictiv. În plus, relațiile dintre profilurile AS și PD nu necesită
identificare, ci doar că aceste legături sunt suficient de fiabile pentru a fi predictive. În viitor,
utilizarea de noi ecrane la nivelul genomului va fi importantă pentru analiza semnăturilor AS ale PD și
pentru identificarea diferitelor stadii și subclase de PD.
Figura 1. Diferite abordări terapeutice sunt utilizate în prezent pentru a viza splicing alternativ pentru
tratamentul PD. (A) Transcrierile AS specifice PD care conțin secvențe unice pot fi vizate și degradate
utilizând tehnica interferenței ARN (ARNi). (B) Variantele AS legate de PD conțin epitopi unici care ar
putea fi utilizați ca ținte pentru anticorpi specifici sau interferență mediată de peptide. (C) Mulți
compuși chimici au fost identificați pentru a modula calitatea și cantitatea factorului de îmbinare cu
acțiune trans. (D) Oligonucleotidele modificate sintetic pot viza și hibridiza la elemente de reglare cis
ale AS și pot suprima selecția exonilor nepotriviți prin inhibarea legării factorilor de splicing cu
acțiune trans.
analizând consecințele fiziologice și patologice legate de PD care rezultă din exprimarea diferitelor
izoforme AS. Mai mult, modelele de diferență AS și raportul relativ al factorilor specifici de îmbinare
cu acțiune trans pot fi utili ca markeri moleculari ai PD. Înțelegerea îmbunătățită a mecanismelor SA
va oferi, de asemenea, o oportunitate de a dezvolta strategii de pionierat pentru terapii care vizează
variante specifice de SA ale PD. MULȚUMIRI: Acest studiu este susținut parțial de Consiliul Național
de Știință (Taiwan) (NSC101-2314-B-039-010- MY2), China Medical University (CMU98-N2-01) și
Departamentul de Studii și Cercetare Clinice de Sănătate din Taiwan Centrul de Excelență (DOH101-
TD-B-111-004). Autorii nu declară niciun conflict de interese.