CURS 5 GENETICA MEDICALA

Sinteza proteinelor

Structura proteinelor, transcriptie, translatie si reglaj genic

Este activitatea fundamentala a fiecarei celule din organism. Ea reprezinta expresia

informatiei genetice din ADN si este un fenomen care se desfasoara intr-un singur sens:
ADN→ARN→proteine. Datorita universalitatii sale, acest proces este cunoscut sub
denumirea de dogma centrala a biologiei moleculare care descrie procesul format din doua
etape, transcriptia si translatia prin care se produce fluxul informatiei genetice din ADN genic
pana la proteina nou-sintetizata. In realitate, fluxul informatiei genetice nu este in totalitate
unidirectional. Exista secvente de ADN-retrotranspozoni (Tn clasa I), care sunt transcrise
mai intai in ARN si apoi sub actiunea unei revers transcriptaze sunt copiate sub forma de
ADNc care se insera aleatoriu in ADN. Exemplu de virus ARN care se insera prin
reverstranscriptie in genomul ADN este vs. HIV, genele XOTAIR.

Sintagma “Genele controleaza sinteza proteinelor”

Clasic - Functia genelor: o gena-un caracter.

Dr. Garrod (1890) descrie alcaptonuria. Postuleaza existenta unei legaturi intre gene si
proteine. Concept de erori innascute de metabolism.

Beadle si Tatum-Nobel 1968: o gena - o enzima (proteina) - Neurospora

O gena - un polipeptid (hemoglobina)

Modern:

O gena codifica mai multe polipeptide (mec de selectarea promotorilor, matisare alternativa,
editare ARN – ex: pro-opiomelanocortina)

Mai multe gene - un polipeptid (lanturile IG)

Structura proteinelor

Catene polipeptidice formate prin polimerizarea celor 20 de tipuri de aa

1.Structura primara: numarul, tipul si secventa aa

• unica, specifica si constanta;

• Determina functia si antigenicitatea proteinei.

2. Structura secundara-legaturi de hidrogen intre aa invecinati-structuri alfa si beta

3. Structura tertiara-configuratia tridimensionala

4. Structura cuaternara-2 sau mai multe catene identice

1. CODUL GENETIC

1
Intelegerea fluxului de informatie genetica cere cunoasterea modului particular in care sunt
codificate mesajele in structura ADN-ului cromozomial. Informatia genetica este inregistrata
in moleculele acizilor nucleici sub forma unui cod genetic.

Codul genetic este determinat de ordinea bazelor azotate in structura primara a ADN-ului.

Orice informatie genetica este reprezentata conventional prin semne – simboluri (A, G, C,
T/U);

Totalitatea semnelor conventionale care servesc la obtinerea unui mesaj reprezinta alfabetul
genetic.
4 simboluri (A, G, C, T/U) = 20 aminoacizi?

Watson si Crick au introdus in 1961 notiunea de codon – unitatea de functie a codului

genetic, format dintr-o succesiune de baze azotate, necesare pentru codificarea unui
aminoacid din structura proteinelor;

Initial s-a crezut ca unitatea de functie este reprezentata de un singur nucleotid, adica
codonul univoc. Daca codonul ar specifica strict un aminoacid, numarul codonilor obtinuti
ar fi de 4 x 1 = 4, deci ar fi specificati numai 4 aminoacizi, iar restul de 16 ar ramane
nespecificati;

Acelasi rationament poate fi aplicat si in cazul codonului biunivoc 4 x 4 = 16 codoni,

respectiv 16 aminoacizi, admitand faptul ca ordinea bazelor modifica tipul de aminoacid;

Nierenberg si Matthaei (1961) au demonstrat ca, dimensional, codonul este triunivoc, iar
fiecare aminoacid este codificat de o tripleta, succesiunea a trei nucleotide adiacente;

Prin aceasta asociere numarul combinatiilor posibile este de 4 x 4 x 4 = 64, care acopera si
depaseste numarul aminoacizilor din structura proteinelor.

1.1 Descifrarea codului genetic

Codul genetic a fost descris de catre Robert Holley, Har Gobind Khorana si Marshall
Nirenberg in 1965 si a insemnat inceputul erei geneticii moleculare. Codul a fost descifrat
experimental folosind polinucleotide sintetice cu secventa cunoscuta de ARNm si analizand
secventa de aminoacizi a proteinei sintetizate artificial. De exemplu, ARNm sintetic al
poliuracilului a produs un polipeptid alcatuit numai din fenilalanina, deci tripleta UUU codifica
fenilalanina(Premiul Nobel pentru chimie in 1968). Experimente similar au aratat ca tripleta
CCC este ARNm pentru prolina iar AAA este ARNm pentru lizina.

1.2 Caracteristicile codului genetic

Unitatea de functie a codului genetic este codonul. El este format din secventa liniara a
trei nucleotide;Reprezinta un sistem de corespondenta intre informatia din structura ADN-
ului si un anumit aminoacid Codul genetic este degenerat. Numarul combinatiilor posibile
este 4³ = 64 codoni. Fata de numarul aminoacizilor avem un surplus de 44 de codoni. Dintre
aceste triplete, multe participa la codificarea aceluiasi aminoacid. De exemplu, leucina este
codificata de 6 codoni diferiti: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA si CUG, iar arginina de 6 codoni:
CGU, CGC, CGA, CGG, AGA si AGG.Acestia sunt codoni sinonimi iar codul genetic este
degenerat, adica un aminoacid este specificat de mai multi codoni. Acest aspect se numeste

2
redundanta informationala. Desi este un termen peiorativ, caracterul degenerat al codului
genetic este un avantaj informational deoarece unele mutatii genice ce produc codoni
sinonimi nu modifica proteina codificata de gena (mutatii silentioase sau izo-semantice).
Aceasta degenerare este un sistem de protectie impotriva efectului mutatiilor. Codul genetic
inscris in molecula ADN-ului este recunoscut in structura ARN-ului mesager prin
complementaritatea bazelor: C » G, G » C, T » A, A » U. Codul genetic nu este
ambiguu. Un codon dat recunoaste un singur tip de aminoacid. Codificarea este
inepuizabila. De exemplu, secventa de 10 dezoxiribonucleotide realizeaza 1 milion de
combinatii sau fraze diferite, iar dintr-o secventa de 15 dezoxiribonucleotide pot rezulta
cateva sute de milioane de combinatii diferite. Mesajele au codoni speciali. Sunt
reprezentati de un codon start sau initiator AUG, si 3 codoni denumiti non-sens (UAA,
UAG, UGA) care semnifica oprirea sintezei proteice. Codonul initiator AUG (cu care se
incepe cadrul deschis de lectura) specifica metionina. Codonii stop semnaleaza incheierea
sintezei si eliberarea polipeptidului format (prin fixarea unor factori de eliberare). Codoni
start alternativi pot fi GUG sau UUG; acestia in mod obisnuit reprezinta valina si leucina
dar in prezenta unor factori initiatori ai translatiei sunt tradusi drept metionina si formil-
metionina. Ceilalti 61 de codoni sunt codoni sens care semnifica cei 20 de aminoacizi. Intre
codoni nu exista semne de separare sau virgule. Citirea mesajului se face in flux
continuu pana la codonul terminator. Intre codoni nu raman dezoxi-ribonucleotide izolate,
neintegrate in componenta unui triplet functional. Codul genetic nu accepta suprapunere.
Fiecare codon poseda bazele proprii, care nu participa in acelasi timp la structurarea altui
codon. Codul genetic este universal. Aceeiasi codoni codifica aceiasi aminoacizi la marea
majoritate a genelor la animale, plante si micoorganisme, iar semnalele START si STOP
sunt universale si ele.

Exceptii de la universalitate ale codului genetic

Acestea se refera mai ales la desemnarea unuia sau doi codoni terminatori drept codoni
codificatori la nivelul genelor mitocondriale si al aminoacizilor nestandardizati.

Acestea se refera mai ales la desemnarea unuia sau doi codoni terminatori drept codoni
codificatori la nivelul genelor mitocondriale si aminoacizilor nestandardizati(selenocisteina-
UGA, pirolizina-UAG).

Codul genetic se modifica prin mutatie.

Principalele tipuri de mutatii, limitate la un singur cistron constau din: insertia repetitiva,
substitutia sau deletia unei baze din structura ADN-ului. Daca intr-o celula prin mutatie se
suprima sau se insera 1-2 nucleotide (sau un alt numar care nu este multiplu de 3) se
produce o decalare a cadrului de lectura al genei care duce la aparitia altui codon. Toti
codonii vor fi diferiti si se va sintetiza o proteina in care toti aminoacizii vor fi diferiti de la
locul in care s-a produs mutatia (numita frameshift).

3
Fig.1: Mutatiile in codul genetic

1. Repetitii trinucleotidice

In Boala Huntington: insertii CAG care adauga serii de glutamine. Boala Kennedy, produsa
prin amplificarea trinucleotidica a secventei CAG in primul exon al genei receptorului
androgenic. Sindromul X Fragil caracterizat de insertii CGG pe cromozomul X; practic
acestea nu sunt legate de arginina deoarece mutatia este localizata in regiunea 5’
netranslata;

2. Mutatii missense

• Anemia Sickle-cell: GAG se transforma in GTG in pozitia 6 a genei beta a

hemoglobinei;

• APC: varianta missense GAC la GTC

3. Mutatii nonsens:

• β-thalassemia (β-globin gene)

• Boala McArdle’s – glicogenoza prin mutatie nonsens in gena miofosforilazei

4. Deletia:

• Fibroza chistica – deletia UUU

O alta caracteristica este fenomenul de amplificare a codului genetic.

4
Din 2001 au fost creati 40 de aminoacizi de sinteza. H. Murakami si M. Sisido au emis
teoria codonului format din 4 si 5 baze. Steven A. Benner a construit al 65-lea codon
functional (in vivo).

2. SINTEZA DE PROTEINE SI POLIPEPTIDE poate fi impartita in 2 etape:

2.1 Transcriptia informatiei genetice de la ADN catre moleculele de ARNm;

2.2 Translatia/ Traductia informatiei genetice intr-un lant polipeptidic.

2.1.1 TRANSCRIPTIA LA PROCARIOTE

2.1.1.1 Tipuri de ARN-polimeraze

La procariote toate cele 3 tipuri de ARN sunt transcrise de aceeasi ARN-polimeraza. La

eucariote fiecare tip de ARN este transcris de catre un tip diferit de ARN-polimeraza.

• ARN-pol I (localizata în nucleol): ARNr 28S,18S, 5,8S

• ARN-poI II (localizata în nucleoplasma): ARNm codificat in toate genele structurale si

ARNsn; microARN(ARNmi – fragmente non-codante care au rolul de a controla
activitatea ARNm)

• ARN-pol III (localizata în nucleoplasma): ARNt si ARN 5S, ARNsn.

2.1.1.2 Definitie transcriptie

Procesul de copiere a informatiei genetice a unei gene sub forma codificata, complementara
si antiparalela intr-o molecula de ARN.Prin asamblarea ribonucleotidelor in structura ARN-m,
respectandu-se principiul complementaritatii bazelor se reproduce fidel, in negativ,
informatia genetica din segmentul cistronului de ADN.

2.11.3 Replicare vs.transcriptie/ARNpol vs. ADNpol

Comparatie ARN Pol ADN Pol

Functie Transcriptie Replicare

Rol Produce copii ARN ale genelor Copiaza intregul

genom

Localizare Portiuni ale ADN Intregul cromozom

Frecventa De cate ori este necesara o proteina Eveniment unic

Sensul 5’ → 3’ 5’ →3’
sintezei

Moment al Folosita in transcriptie in timpul fazelor G Folosita in replicare in

5
aparitiei timpul fazei S

Primer Nu este necesar Necesar pentru

initierea replicarii

Baze utilizate A, G, C, U, Mg²+ A, G, C, T, Mg²+

Matrita Da Da

Fidelitate ↓(mai multe erori decat ADN pol, dar ↑(intervin mec de
persista doar o generatie de prot) reparare)

Produs ARN monocatenar(ARNm, ARNt, ARNr) ADN dublu catenar

rezultat

2.1.1.4. Etapele transcriptiei

 Initierea;
 Elongatia;
 Terminarea.

2.1.1.4.1 FAZA DE INITIERE A TRANSCRIPTIEI

Incepe cu o secventa particulara de ADN denumita situs promotor, unde se ataseaza

enzima ARN-polimeraza-ADN-dependenta, care initiaza transcriptia. ARN-polimeraza
sintetizeaza acid nucleic in directia 5’ la 3’, iar citirea matritei de ADN se face in directia 3’ la
5’. La acest nivel se gaseste si o subunitate proteica denumita factor sigma, care are rolul
de a mentine conformatia de dublu helix necesara recunoasterii situsului promotor. In
momentul in care complexul ARN-polimeraza/factor sigma recunoaste corect promotorul,
factorul sigma se disociaza de ARN polimeraza si enzima incepe sa despiralizeze helixul de
ADN, formand o regiune de dezoxiribonucleotide neimperecheate, care serveste drept
matrita pentru sinteza ARN-ului.

ARN polimeraza de la E. coli este formata din 6 subunitati polipeptidice: 2 subunitati alfa; 1
beta; 1 beta prim; 1 omega. Subunitatea sigma-asigura legarea specifica a ARN-pol la
anumite secvente de ADN numite promotor fata de care creste afinitatea ARN-pol si scade
afinitatea enzimei pentru catena non-matrita. Primele 5 subunitati sunt strans unite in miezul
enzimei. Enzima miez se poate lega nespecific la AND. Holoenzima ARN polimeraza
recunoaste secventa initiala a unei gene, regiunea de start, care este cunoscuta sub
denumirea de regiunea promotor. Informatia continuta de promotor face enzima ARN
polimeraza capabila sa recunoasca precis punctul initial de la care incepe transcriptia.

Initierea α-leaga ADN (secvente reglatorii), proteine, ARN-pol. Β – rol catalitic (leaga NTP si
formeaza legaturile fosfatdiesterice. β’- leaga AND. σ – recunoaste promotorul. Ω –
asambleaza ARN-pol. Beta si beta prim formeaza impreuna centrul activ al enzimei.

6
Fig 2: Initiere transcriptie procariote(ARNpol+fact. σ)vs. eucariote(ARNpol+FT)

Initierea α-leaga ADN (secvente reglatorii), proteine, ARN-pol. Β – rol catalitic (leaga NTP si
formeaza legaturile fosfatdiesterice. β’- leaga AND. σ – recunoaste promotorul. Ω –
asambleaza ARN-pol. Beta si beta prim formeaza impreuna centrul activ al enzimei.

Structura promotorului la bacterii

Este alcatuit din regiunea de recunoastere

situata in pozitia -35 pb fata de situsul initial
de transcriptie(tss). Are structura TTGACA si
la nivelul ei se ataseaza ARN polimeraza.
Aceasta structura se refera la catena
superioara care nu va fi transcrisa. Polimeraza
paraseste secventa -35 si se deplaseaza in
aval spre o alta regiune conservata. Aceasta
este a doua secventa de consens (TATAAT) si
este situata in pozitia -10 fata de tss. Este
denumita PRIBNOW BOX(PB). Distanta dintre
PB si secventa -35 este de aproximativ 16-
18pb. PB este regiunea unde polimeraza se
ataseaza ferm de ADN si se considera ca este
pozitia in care helixul de ADN se deschide pentru a permite imperecherea de recunoastere
intre matrita de ADN si ARNm. Regiunea deschisa se intinde de la PB pana la cateva pozitii
inaintea punctului +1 (tss). Numai una dintre cele doua catene de ADN este folosita drept
matrita, catena numita antisens (3’→5’). Se obisnuieste sa se descrie secventa genica de pe
catena sens. Transcriptul de ARN(5’→3’) va fi complementar ca directie si structura (cu
exceptia U care inlocuieste T) cu catena sens. Primul nucleotid al transcriptului de ARN este
de obicei o purina (A sau G) situata la capatul 5’. Aceasta inseamna ca pe catena antisens a
secventei de ADN care va fi transcrisa se va gasi la capatul 3’ o pirimidina (T sau C).
Initierea transcriptiei se incheie odata cu formarea primei legaturi fosfat diesterice intre
NTP+1 si NTP+2.

2.1.1.4.2 Faza de elongatie

7
In timp ce polimeraza se deplaseaza de-a lungul catenei antisens, pe lantul de ARN sunt
adaugate resturi de ribonucleozid monofosfati (AMP, CMP, GMP, sau UMP) la capatul 3’.
Aceste nucleotide rezulta din clivarea precursorilor ribonucleozid trifosfati (ATP, CTP, GTP si
UTP) de o molecula de pirofosfat (PPi). Subunitatea sigma se detaseaza de pe restul
enzimei dupa ce s-au format 6-10 legaturi fosfodiesterice de NTP si se poate atasa la un alt
complex polimerazic. Regiunea deschisa a ADN-ului se extinde pe o portiune de aprox.
15pb, deoarece dublul helix de ADN se reface in spatele enzimei sub actiunea
topoizomerazei. Fiecare transcript in crestere va avea un capat 3’ liber la care se poate
atasa capatul 5’ al unui nou nucleotid

2.1.1.4.3. Etapa de terminare a transcriptiei

Se realizeaza prin doua mecanisme:

• Ro dependent

• Situsuri ter

a. Mecanismul ro dependent
Ro este o helicaza ATP-dependenta care are rolul de a desface duplexul ADN-ARN. ARN-
pol intalneste o zona bogata in GC si incetineste transcrierea. Proteina ro ajunge ARN-pol si
disociaza ARN de ADN.

b.

Mecanismul ro independent:
Situsurile ter sunt bogate in secvente palindromice GC cu structura simetrica in oglinda
urmate de regiuni bogate in secvente AT (aprox. 6-8 resturi A) pe catena codificatoare).
Secventa inversata, prin transcriere, genereaza un ARN in ac de par (prin formarea unei
regiuni dicatenare), care se termina cu numeroase secvente uridilice (complementare cozii
poli-A). ARN-pol se opreste cand ajunge la un situs ter. Pauza permite ARN sa formeze un
ac de par. Acul de par cu coada poli-U distruge legaturile spatiale intre ARN si ARN-pol.
Complexul de elongare este astfel disociat si elongarea se termina

8
Fig. 3: Secventa semnalizatoare a terminarii transcriptiei

2.1.2 TRANSCRIPTIA LA EUCARIOTE

Diferita fata de procariote. Eucariotele au 3 ARN-polimeraze diferite, in vreme ce

procariotele au decat una. ARNm eucariot este prelucrat inainte de a fi utilizat pentru sinteza
proteinelor.

2.1.2.1. Tipuri de ARN-polimeraza la eucariote:

ARN polimeraza I (nucleol) sintetizeaza ARNr 28S, 18S si ARNr 5,8S; ARN polimeraza II
sintetizeaza ARNm (complementar si antiparalel cu catena matrita) codificat in toate genele
structurale, ARNmi si ARNsn; ARN polimeraza III sintetizeaza ARNt, ARNsn si ARNr 5S.

Cele trei polimeraze nu sunt capabile sa recunoasca si sa se lege de secvente specifice din
promotori. Ele au nevoie de factorii de transcriptie, de care depind in totalitate. FT sunt
proteine care recunosc specific secventele promotorilor si initiaza transcriptia. Majoritatea
promotorilor care interactioneaza cu ARN polimeraza II contin o secventa conservata numita
caseta HOGNESS( TATA box).

2.1.2.2. ARN polimeraza II

9
ARN polimeraza se fixeaza la promotor numai cuplata cu FT generali. ARN pol la eucariote
este formata din 12 subunitati care faciliteaza fixarea la ADN, desfacerea catenelor,
polimerizarea ARN si deplasarea enzimei de-a lungul catenei transcrise. ADN bicatenar intra
in enzima ARNpol printr-un sant si ajunge la situsul activ unde este indoit in unghi drept si
cele doua catene se desfac partial, expunand catena matrita. Ribonucleotidele activate
patrund printr-un por si sunt fixate complementar la catena transcrisa de ADN. Moleculele de
ADN si ARNm parasesc enzima prin puncte diferite.

Fig 4: Structura ARN polimerazei

2.1.2.3. Factori de transcriptie

2.1.2.3.1. Factorii de transcriptie generali

Interactioneaza cu miezul promotorului si sunt implicati in formarea complexului de

preinitiere. Sunt trans-reglatori pentru ca sunt produse de alte gene decat cele asupra carora
actioneaza. Ei se fixeaza la elementele cis-reglatoare(secventele de consens TATA, CAAT,
CG).

Cinci factori generali de transcripție sunt necesari pentru inițierea transcripției de către ARN
polimeraza II în sistemele in vitro reconstituite. Promotorii multor gene transcrise prin
polimeraza II conţin o secvenţă similară cu TATAA la -25 până la -30 de nucleotide în
amonte de situsul de pornire a transcripţiei. Această secvență (numită cutie TATA) seamănă
cu elementul de secvență -10 al promotorilor bacterieni, iar rezultatele introducerii mutațiilor
în secvențele TATAA au demonstrat rolul lor în inițierea transcripției. Primul pas în formarea
unui complex de transcripție este legarea unui factor de transcripție general numit TFIID la
caseta TATA (TF indică factorul de transcripție; II indică polimeraza II). TFIID este el însuși
compus din mai multe subunități, inclusiv proteina de legare a TATA (TBP), care se leagă în
mod specific la secvența consens TATAA și alte 10-12 polipeptide, numite factori asociați
TBP (TAF). TBP leagă apoi un al doilea factor de transcripție general (TFIBB) formând un

10
complex TBP-TFIBB la promotor. TFIIB, la rândul său, servește ca o punte către ARN
polimerază, care se leagă de complexul TBP-TFIBB în asociere cu un al treilea factor, TFIIF.

Fig 5: Formarea complexului de transcriptie

După recrutarea ARN polimerazei II la promotor, este necesară legarea a doi factori
suplimentari (TFIIE și TFIIH) pentru inițierea transcripției. TFIIH este un factor
multisubunitate care pare să joace cel puțin două roluri importante. În primul rând, două
subunități ale TFIIH sunt helicaze, care pot derula ADN-ul în jurul situsului de inițiere.
(Aceste subunități ale TFIIH sunt, de asemenea, necesare pentru repararea exciziei
nucleotidelor). O altă subunitate a TFIIH este o protein kinază care fosforilează secvențele
repetate prezente în domeniul C-terminal al celei mai mari subunități a ARN polimerazei II.
Se crede că fosforilarea acestor secvențe eliberează polimeraza din asocierea sa cu
complexul de inițiere, permițându-i să continue de-a lungul șablonului pe măsură ce
alungește lanțul de ARN în creștere.

Fig. 6: Holoenzima constă dintr-un complex preformat de

ARN polimerază II, factorii generali de transcripție TFIIB,
TFIIE, TFIIF și TFIIH și alte câteva proteine care activează
transcripția. Acest complex poate fi recrutat direct asupra
unui promotor prin interacțiunea cu TFIID (TBP + TAF).

2.1.2.3.2. Factorii de transcriptie specifici

Se fixeaza pe alte elemente cis-reglatoare situate in

amonte fata de promotor. Au rol in controlul la distanta al
expresiei genice.

11
Secventele enhancer sunt situsuri de legare pentru o mare varietate de FT. Ele au rolul de
a stimula rata transcriptiei.
Inhibitorii/Silencers-reduc transcriptia.
Locus control regions(LTR)-cis reglatori pentru expresia in anumite perioade
ontogenetice(alfa si beta globina).
Secvente izolatoare/insulators - blocheaza raspandirea efectului unor reglatori
Mecanism:
Aceste elemente pot fi situate la mii de nucleotide de SST, pot fi pe catena opusa sau in alte
molecule/cromozomi
Dupa fixarea FT, ADN face o bucla si regiunea de reglare se apropie de promotor, unde
interactioneaza cu complexul transcriptional bazal format din ARN-pol si FTgenerali.

Fig. 7: FT specifici si modul de interactiune cu regiunile cis-reglatoare

Se reaminteste structura genei

• Cadrul deschis de lectura

• Regiunile de reglare: Regiunea 5’-promotorul, regiunea 3’

Fig 8: Structura genei

Cadrul deschis de lectura

• SST –situsul de start

• Regiunea 5’UTR -secventa lider, incepe la +1 si se termina la codonul initiator

• Are secventa de consens 5’-CCAGCCATG-3’

• Exonii-secvente codante, in medie 8/gena

• Intronii-secvente necodante, incep cu 5’GT si se termina cu AG3’(semnale pentru

decuparea corecta) Ultimul exon contine un codon stop(TAA, TAG, TGA)

• Regiunea 3’UTR cu secventa AATAAA→AAUAAA(situs de poli-A)

12
2.1.2.4. Structura promotorului

Este localizat in pozitia -25pb in amonte fata de tss(+1) si are secventa de consens 5’-
TATAAA-3’. Este inconjurat de secvente GC. Factorii de transcriptie care se leaga in
vecinatatea casetei TATA se atasaza pe rand. Primul care se atasaza este TF IID, cunoscut
sub denumirea de proteina TATA deoarece recunoaste secventa TATA. Dupa atasarea TF

IID este permisa atasarea TF IIA, TF IIB, ARN-polimeraza, TF IIE si IIH. Secventa TATA
determina situsul exact pentru initierea transcriptiei, dar nu este singurul. Alte doua
secvente sunt caseta CAAT si caseta GC. Acestea au rol in modificarea expresiei genice
prin controlul transcriptiei. CAAT box are secventa de consens GGCCAATCT si este
localizata in pozitia -80 in amonte fata de +1. Mutatiile in CAAT reduc nivelul transcriptiei de
la promotor in aval; Mutatiile in TATA box reduc partial activitatea transcriptionala, dar
altereaza major situsul initial de transcriptie. GC box cuprinde 2 casete, fiecare cu secventa
de consens GGGCGG. Una dintre casete este situata in amonte si cealalta in aval fata de
caseta CAAT. TATA box si CG box interactioneaza cu cativa factori de transcriptie bine
definiti. CAAT box este recunoscuta de diferite molecule proteice, unele dintre ele facilitand
transcriptia. Secventele enhancer sunt situsuri de legare pentru o mare varietate de FT. Ele
au rolul de a stimula rata transcriptiei.

2.1.2.5. Maturarea ARNm precursor- numai la eucariote

13
Transcriptele primare de ARN formate sufera un proces de maturare nucleara care fac ARN
disponibil si util translatiei si are 2 etape:

1. Modificarea extremitatilor ARNm precursor

Are rol de cresterea stabilitatii (protectie la actiunea endonucleazelor), facilitarea

transportului in citoplasma si recunoasterea si fixarea la subunitatea 40S a ribozomului
Precoce in transcriptie este adaugat un nucleotid neobisnuit 7-metilguanilat la capatul 5’ al
ARN-pm, numit cap (capac, boneta, calota). Acesta are rolul de atasare a ribozomilor
pentru translatie. In momentul in care transcriptia este aproape completa, la capatul 3’ este
atasata o serie de 50-250 nucleotide cu adenina, numita coada poli-A. La aceasta coada
se adauga proteina PABP(polyA binding protein). Rolul sau este de a transporta ARN-m in
afara nucleului, de a-l stabiliza impotriva degradarii in citoplasma si initierea translatiei.
Dupa transcriptia ARN-pm, regiunile non-codante sunt excizate iar regiunile codante sunt
unite prin complexe de ribonucleoproteine numite spliceozomi pentru a forma ARN-m
matur, care trece apoi in citoplasma pentru a fi translat in proteine.

Fig 9: Prelucrarea extremitatilor ARN

2. Matisarea ARNm este un termen care semnifica innadirea a doua capete. Se descriu
urmatoarele secvente de semnal: 5’GT(GU in ARN) –situs donor si 3’AG situs acceptor dar
si situsul de conexiune sau de legatura(branch site) cu nucleotidul A

Etape 1. Sectionarea jonctiunii exon intron 5’GU

2. Atasarea nucleotidului terminal G la nucleotidul A al situsului de

bransare(transesterificare) si formarea unei structuri lasou/bucla

3. Sectionarea intronului la jonctiunea 3’AG, indepartarea lui si unirea segmentelor

de ARN exonic(transesterificare).

Reactiile sunt mediate printr-un complex ARN-proteine(spliceozomi) format din 5 tipuri de

ARNsn(U1,U2,U4,U5,U6) si proteine

14
2.1.2.6. Matisarea alternativa

Ordinea exonilor in ADN si transcriptul primar sunt pastrate in ARNm matur. Exista, cu toate
acestea, o flexibilitate in utilizarea exonilor, in sensul ca in celule diferite vor fi retinuti in
ARNm numai o parte din exoni, restul fiind eliminati odata cu intronii – matisare alternativa.
Aceasta duce la tipuri diferite de ARN din aceeasi gena, deci tipuri diferite de polipeptide.
Aceste proteine pot fi inrudite(izoforme) ca in cazul mielinei sau troponinei C sau complet
diferite (de exemplu gena calcitoninei produce in celulele C tiroidiene precursorul
calcitoninei iar in creier precursorul unui neuromediator CGRP.

2.1.2.7. Exemplu de expresie a genei beta globinei.

15
Fig 10: Structura si secventa nucleotidica a capatului 5’ al genei β-globinei(bratul
scurt al cromozomului 11)

Transcrierea de la 3’ la 5’ incepe de la punctul indicat de start pentru a produce ARNm.

Cadrul de citire este determinat de codonul initiator AUG, iar codonii urmatori sunt cititi sub
forma aa.

Fig 11: Structura nucleotidica completa a genei β-globinei

Lantul de beta-globina este un polipeptid format din 146aa, codificat de o gena care ocupa
1,6kb pe bratul scurt al cromozomului 11. Gena are 3 exoni si 2 introni. Secventele necesare
pentru initierea corecta a transcrierii genei sunt localizate in promotor, pana la 200 pb
distanta fata de locul initierii transcrierii.

O secventa importanta este TATA box, bogata in adenina si timina si care se gaseste in
amonte cu aprox 50pb, care vor fi transcrise, dar nu si translate in aa. Regiunea CCAAT sau
CAT box este situata in amonte fata de TATA box si are rol de reglare a transcriptiei.

16
Secventele GT si AG sunt importante pentru procesul de splicing ARN la jonctiunea intron-
exon. Secventa AATAAA este important pentru adaugarea cozii poli-A. Codonul initiator
ATG(AUG in ARNm) si codonul stop TAA(UAA in ARNm) sunt evidentiate si ele.

2. 2. TRANSLATIA/TRADUCTIA INFORMATIEI GENETICE

Elementele implicate in realizarea translatiei sunt: ARN-r, ARN-t, Aminoacizi, Enzime

Donatorii de energie

2.2.1. ARN-t, aminoacizi

2.2.1.1. Activarea aa
In timpul translatiei ARN-t specifici fixeaza aminoacizii specifici, ii transfera pe ribozomi si ii
insera intr-o pozitie specifica , in functie de mesajul din ARN-m. Cuplarea si transportul
specific se fac in prezenta ATP-ului si a aminoacil-ARN-t-sintetaza specifica. Activarea
aminoacidului si transportul sau specific se desfasoara in doua etape:

- prima etapa corespunde activarii aminoacidului:

R-CH(NH2)-COOH + Enzima + ATP = R-CH(NH2)-CO-O-AMP-E + PP

aminoacid aminoacid activat

- in etapa a doua are loc cuplarea aminoacidului activat cu ARN-t:

R-CH(NH2)-CO-O-AMP-E + ARN-t = R-CH-CO-O-ARN-t + AMP + E

aminoacil-ARN-t

2.2.2. ARNt

17
Acest proces este efectuat de catre portiunea anticodon a moleculelor de ARN-t
complementare cu secventa de codoni de pe ARN-m. ARN-t este o molecula tridimensionala
cu forma de frunza de trifoi inversata, cu lungime de aprox. 70 nucleotide. La capatul 3’ se
poate atasa un aminoacid specific. La capatul opus se gaseste bucla anticodon, care
contine o serie de trei baze complementare cu codonul de pe ARN-m, numit capatul de
citire. Bucla DHU – dihidrouridina – recunoaste si leaga aminoacil - ARNt sintetaza. Bucla
TΨC contine pseudouridina (Ψ) si ribotimina (T) – asigura legarea de subunitatea 50S a
ribozomului.

2.2.3. Ribozomii si ARNr

La bacterii sunt formati din doua subunitati, diferite prin constanta de sedimentare: marea
subunitate are 50S (ARNr 23S, 5S, 34 proteine) iar mica subunitate are constanta 30S
(ARNr 16S, 21 tipuri de proteine). La om, subunitatile sunt 60S (ARNr 5S, 5,8S, 28S, 46
tipuri de proteine) si 40S (ARNr 18S, 33 tipuri de proteine). Fiecare subunitate este
constituita din complexe de proteine(40%) si ARN-r (60%);

Fixarea ARN-m de ribozomi se face la la subunitatea de 40S.Ribozomii au 4 situsuri

functionale: pe subunitatea mica situsul de fixare al extremitatii 5’ a ARNm; pe
subunitatea mare situsul P (peptidil) si A(aminoacil) unde se fixeaza moleculele de ARNt
incarcate cu aminoacizi specifici si situsul de iesire E (exit). O molecula de ARN-m poate fi
explorata de mai multi ribozomi, formand poliribozomul sau polizomul. Fixarea ARN-m de
ribozomi se face la la subunitatea de 40S.

18
Fig 12: Situsuri ribozomale

2.2.4. Translatia/traductia informatiei genetice(procariote)- 3 etape

A. Faza de initiere
Pentru a initia translatia o unitate ribozomala de 30 S se leaga la o secventa scurta de
ARNm numita situsul de legatura ribozomal. Secventa incepe intotdeauna cu semnalul
AUG, denumit codon initiator. Anticodonul complementar de pe ARN-t va fi UAC si
transporta specific numai metionina. Aceasta cuplare se realizeaza in prezenta a doi factori
de initiere de natura proteica (Fc si Fb). Subunitatea ribozomala de 50S se ataseaza apoi la
complexul de initiere, iar factorii de initiere se desprind si se formeaza ribozomul de 70S. Se
formeaza astfel capul de citire, favorizat de un alt factor de initiere Fa, in prezenta unei
molecule de GTP. Subunitatea mare are doua situsuri alaturate: situsul aminoacil-A si
situsul peptidil-P. Situsul P este primul ocupat de ARN-t adaptor.

19
 B. Faza de elongatie
Soseste al doilea ARN-t adaptor, care transporta un aminoacid care care se fixeaza de
ribozom in situsul A. In prezenta peptidil-transferazei din ribozom se stabileste o legatura
peptidica intre cei doi aminoacizi. Dupa legarea aminoacizilor, ARN-t initiator paraseste
situsul P ribozomal prin situsul de iesire E. Ribozomul avanseaza trei baze pe secventa
ARN-m. Prin avansare , al doilea ARN-t trece pe situsul P. Situsul A este eliberat prin
avansare, cuprinzand codonul urmator din secventa ARN-m. Soseste al treilea ARN-t
adaptor, care ocupa situsul A. Se formeaza o noua legatura peptidica intre aminoacizii 2 si
3, dupa care ARN-t paraseste ribozomul. Lantul polipeptidic in crestere strabate un tunel in
interiorul subunitatii 50S;

C. Faza de terminare
Acest proces continua de nenumarate ori in directia 3’-5’ pana cand ribozomul atinge un
codon stop (UAA, UAG, UGA). Factorii eliberatori elibereaza lantul polipeptidic de pe ARN-t,
iar cele doua subunitati ribozomale vor fi reciclate. In timpul fazei de elongatie proteina ia o
forma functionala tridimensionala.

3. REGLAREA SINTEZEI PROTEICE

Mecanismele de reglare au fost studiate cel mai bine la bacterii. Exemplul clasic: Modelul
operonului descris de catre Francois Jacob si Jacques Monod la E.coli – premiul Nobel
1965. Ei au demonstrat experimental si teoretic ca sinteza proteinelor nu este constanta in

20
timp ci variaza in functie de necesitatile celulei. Operonul lac este necesar pentru
transportul si metabolizarea lactozei la E.coli. Este activ numai cand lactoza este prezenta si
glucoza lipseste, deci confera capacitatea de a utiliza lactoza ca sursa de energie, atunci
cand glucoza lipseste din mediu.

Fig 13: Operonul Lac

3.1. Mecanismele de reglare au la baza actiunea unor enzime si au fost descrise

pentru procariote.

Enzimele care intervin in reglarea sintezei proteice pot fi controlate prin 2 mecanisme:

A. Controlul genetic al sintezei enzimei;

B. Controlul activitatii enzimatice (inhibitie de feed-

back)

A. Controlul genetic al sintezei enzimatice se refera la controlul transcriptiei ARN-m

necesar pentru sinteza unei enzime.

Acest control se realizeaza prin intermediul proteinelor reglatoare care se pot atasa la ADN
si pot bloca sau amplifica functia ARN-polimerazei. Proteinele reglatoare pot functiona ca:

1. Represori (control genetic negativ)

a. Corepresori (operonul trp);
b. Inductori (operonul lac);
2. Activatori (control genetic pozitiv).
1. Represorii sunt proteine reglatoare care blocheaza transcriptia ARN-m.
Represorii se leaga la o portiune de ADN numita operator care se gaseste in
aval de promotor. Legarea proteinei reglatoare la operator blocheaza trecerea
ARN-polimerazei de operator si transcrierea secventei de gene structurale ale
enzimei – control genetic negativ. Represorii sunt proteine alosterice care
au un situs de legare pentru o molecula specifica numita corepresor - care
modifica forma proteinei represor astfel incat ea sa se poata cupla cu
operatorul si sa blocheze transcriptia.
Inductorul altereaza forma proteinei reglatoare, blocheza cuplarea cu operatorul si permite
transcriptia. Reglarea prin inductor este caracteristica operonului lactoza si este necesar
pentru transportul si metabolizarea lactozei la E. coli.

21
Operonul lac de la E. coli contine gene implicate in metabolismul lactozei. Este activ numai
cand lactoza este prezenta si glucoza lipseste. Represorul lac si CAP (catabolit activator
protein) regleaza operonul on/off ca raspuns la nivelurile de glucoza si lactoza. Represorul
lac este un senzor pentru lactoza. CAP este senzor pentru glucoza

Un operon inductibil in absenta inductorului (operonul lactoza)

Gena reglatoare codifica o proteina represor activa. Proteina represor se leaga apoi la
regiunea operator a operonului. ARN polimeraza nu se poate lega de regiunea promotor a
operonului cind proteina represor activa este legata de regiunea operator. Daca ARN
polimeraza nu se leaga la regiunea promotor genele celor 3 enzime (Z, Y si A) nu sunt

transcrise in ARNm. In lipsa transcriptiei celor 3 gene enzimatice, cele 3 enzime necesare
pentru utilizarea lactozei de catre bacterie nu sunt sintetizate.

Modelul de functionare al unui operon inductibil in prezenta inductorului (operonul

Lac)

Gena reglatoare codifica o proteina represor activa. Lactoza, molecula inductoare se leaga
de proteina represor activa. Legarea inductorului inactiveaza proteina represor. Proteina
represor inactiva nu se mai poate lega la regiunea operatoare a operonului. Deoarece

proteina represor inactiva nu este capabila sa se lege la regiunea operatoare, ARN

polimeraza va fi din nou capabila sa se lege la regiunea promotor a operonului. ARN
polimeraza este acum capabila sa transcrie cele 3 gene enzimatice (Z, Y si A) in ARNm.
Odata cu transcrierea acestor gene sunt sintetizate cele 3 enzime necesare bacteriei pentru
a utiliza lactoza.

Reglarea sintezei proteice la procariote prin co-represor: operonul Trp

22
In cadrul operonului Trp se sintetizeaza cele 5 enzime necesare sintezei triptofanului. Trp
functioneaza drept corepresor prin legarea de proteina represor inactiva care se transforma
in represor activ si blocheaza cuplarea ARN polimerazei, inhiband transcriptia celor 5 gene
necesare sintezei trp si astfel nivelul triptofanului din mediu scade.

Fig 14: Operonul represibil in absenta co-represorului

Fig 15: Operonul represibil in prezenta co-represorului(triptofan)

2. REGLEREA SINTEZEI PROTEICE PRIN CONTROL GENETIC POZITIV

Activatorii sunt proteine reglatoare care promoveaza sau initiaza transcriptia.
Activatorii controleaza gene care au un promotor la care ARN-polimeraza nu se poate atasa.
Activatorul este o proteina allosterica care se poate lega de situsul activator de legatura.
ARN-polimeraza nu se va putea lega de promotor si nu va putea transcrie genele. Legarea
unei proteine inductor la activator ii va modifica forma si aceasta se va atasa la situsul
activator de legatura. ARN-polimeraza se leaga de promotor si initiaza transcriptia – control
genetic pozitiv.

23
 Fig 16: Activitatea unei proteine activatoare in absenta inductorului

O proteina activatoare in prezenta inductorului

B. Controlul activitatii enzimatice(inhibitie prin feed-back)

• Inhibitie non-competitiva;

• Inhibitie competitiva.

24
Inhibitia noncompetitiva prin enzime allosterice

Produsul final (inhibitor) al caii metabolice se combina cu situsul allosteric al enzimei,

aceasta altereaza situsul activ al enzimei astfel incit ea nu se mai poate lega la substratul
initial al caii. Aceasta blocheaza sinteza produsului final.

Inhibitia competitiva a activitatii enzimatice

Produsul final (inhibitor) al caii metabolice se leaga la situsul activ al primei enzime a caii.
Ca rezultat enzima nu se mai poate lega la substratul initiator al caii metabolice.

3.2. REGLAREA SINTEZEI PROTEICE LA EUCARIOTE

Exista diferente majore intre reglarea sintezei la eucariote si procariote. Eucariotele au
histone si cromozomii sunt stans infasurati in cromatina, iar procariotele au proteine legate
direct de ADN care se poate exprima mult mai usor. Procariotele nu au introni iar fiecare
gena are propria sa regiune reglatoare. Eucariotele folosesc factori de transcriptie si regiuni
promotoare pentru reglarea controlata a fiecarei gene. Eucariotele au introni; ca urmare se
produce procesarea ARNm, care este folosit mai ales in reglarea expresiei genice la
eucariote.

Reglarea expresiei genice se produce la mai multe niveluri: pretranscriptional, transcriptional

si posttranscriptional.

3.2.1. CONTROL PRETRANSCRIPTIONAL

Se refera la exprimarea in spatiu a genelor in anumite celule, organe sau tesuturi;

Topoizomerazele- suprainrulare ADN cu cresterea gradului de torsiune al cromatinei-

modifica accesul FT la promotorul genelor - reduce transcriptia;

Modificari in conformatia ADN-ului-trecerea de la forma B la forma Z- ADN este mai accesibil

transcriptiei(in procese maligne-favorizeaza transcriptia);

Mecanisme epigenetice= modificari ale complexului nucleoproteic, ce nu implica schimbari

in secventa nucleotidica

1. modificarea histonelor nucleozomale-acetilarea(la H3, H4) amplifica transcriptia, iar

metilarea are efecte diferite, dependente de pozitia aminoacidului(metilarea lizinei in
4,36 si 79 ale H3 activeaza transcriptia, metilarea lizinelor in pozitiile 9,20 si 27
reprima transcriptia)

2. Remodelarea cromatinei prin schimbarea pozitiei nucleozomilor

3. Metilarea ADN- in insulele CpG din struct promotor- represia transcriptiei

4. Amprentarea genomica (sindrom Prader-Willi si Angelman)

5. Inactivarea cromozomului X

3.2.2. CONTROL TRANSCRIPTIONAL

Punctul primar de control este reglarea activitatii ARN-polimerazei II. Activitatea ei este
controlata de: elemente cis-reglatoare(TATA, CAAT, GC pe care se fixeaza FT trans-
reglatori), factori de transcriptie transreglatori, controlul la distanta al expresiei genice prin
enhancers sau silencers, reglare prin liganzi, ca raspuns la semnalele extracelulare(sunt

25
receptori intracelulari la care se ataseaza diferiti hormoni si au efect de factori de
transcriptie), selectarea promotorilor pentru gene care au mai multi promotori(gena
distrofinei, cu cel putin 8 promotori, 2,4Mb, 79 exoni).

Selectarea promotorilor

Prin folosirea alternativa a promotorilor se pot produce izoforme ale unei proteine, cu
proprietati diferite in diferite tesuturi.

Fig 17: Gena distrofinei 2,4Mb, 79 exoni, care are cel putin 8 promotori.

Patru promotori sunt situati in regiunea reglatoare 5’ si sunt specifici pentru cortexul
cerebral, muschi, cerebel, limfocite si determina 4 izoforme mari de distrofina, diferite prin
capatul amino-terminal, datorita folosirii alternative a exonului 1. Alti 4 promotori sunt interni
si determina izoforme mici de distrofina din rinichi, retina, celule schwann.

3.2.3. CONTROL POSTTRANSCRIPTIONAL

Se realizeaza prin urmatoarele mecanisme principale:

Adaugarea secventei cap la extremitatea 5’ a ARNm cu rolul de a-l proteja de actiunea 5’ a

exonucleazelor si de atasare a ribozomilor.

Procesul de splicing

26
Adaugarea cozii poli-A (poliadenilare) la capatul 3’ actioneaza protector impotriva
exonucleazelor si stimuleaza viteza translatiei.

Sunt descrise si mecanisme secundare care controleaza expresia genica dupa

transcriptie. Acestea cuprind:

1. Matisarea alternativa sau diferentiala

2. Poliadenilarea alteranativa
3. Editarea ARNm
4. Modificarea stabilitatii si stocajului ARNm
Controlul procesarii ARN(Matisarea alternativa sau diferentiala)

Este limitat la eucariote si determina cum si cand este splitat sau procesat transcriptul
primar pentru a forma ARNm. Aceasta prelucrare consta din eliminarea intronilor dar si a
unor exoni codanti – matisare alternativa. Acest fenomen de selectie a exonilor explica faptul
ca din 22.000 de gene se pot obtine peste 100.000 de proteine. De exemplu, unele
transcripturi de ARN produc diferite tipuri de ARNm din aceeasi gena, in diferite tipuri de
celule numai prin folosirea selectiva a exonilor-matisare alternativa (gena calcitoninei cu 2
variante-calcitonina in celulele C tiroidiene si peptidul neuromodulator in hipotalamus).

Poliadenilarea alteranativa

Numeroase gene contin la nivelul 3’UTR mai multe situsuri de poliadenilare in acelasi exon
si pot modifica durata de viata a ARNm, astfel sintetizandu-se o cantitate mai mica de
proteina identica.

Fig 18: Poliadenilare alternativa in exoni/introni → proteina trunchiata. Poliadenilare

alternativa in 3’ UTR → modifica durata de viata a ARNm → proteina de lungime
normala, dar in cantitate mica

Editarea ARNm

27
Este un mecanism evolutiv prin care se modifica structura ARNm in timpul procesului de
maturare (modificari nucleozidice, deaminare, editare la virusuri). Ex: editarea C->U in gena
pt apolipoproteina B sau a genei pt NF1(neurofibrina), sau editarea U→C(in gena WT1
tumorii Wilms).

Fig 19: Editarea ARNm pentru Apo-B produce doua proteine cu lungimi si functii
diferite

Se produc modificari enzimatice specifice(substitutia, insertia, deletia) unui nucleotid care

modifica secventa si lungimea proteinelor codificate.

Modificarea stabilitatii si stocajului ARNm

Intensitatea sintezei unei proteine depinde de cantitatea de ARNm si de durata lui de viata.

De exemplu, ARNm al beta globinei are un timp de injumatatire mult mai mare decat al altor
secvente, deoarece este foarte utilizata. ARNm produs de oncogenele c-MYC si c-FOS are
o stabilitate anormal de mare-sinteza proteine oncogene-stim. proliferarea celularaCresterea
stabilitatii este determinata de lungimea secventei poliadenilice din regiunea 3’UTR.

Stocajul post-transcriptional al ARNm in nucleu sau citoplasma constituie o modalitate de

reglare a sintezei de proteine.

3.2.4. Controlul translational

Determina care ARNm va fi translat in proteine si cand.

Se realizeaza prin

 fenomenul de interferenta pe care il produc molecule mici ARN micro cu rol de

incetinire a translatiei
 prin degradarea mutatiilor non-sens premature din ARNm( care ar produce proteine
anormale) si
 prin factori externi.

28
De exemplu, translatia poate fi inhibata de ARNm cuplat cu diferite proteine specifice sau
stimulata de secvente nucleotidice speciale de la capatul ARNm, care faciliteaza cuplarea
ribozomilor.

1. Reglare prin interferenta ARN/Premiul Nobel 2006(Andrew Fire si Craig Mello)

Ribonucleaza Dicer: clivare ARNdc in fragmente de 20-25 nucleotide ARNsi(cand ARNdc este de
origine exogena) sau ARNmi(cand ARNdc este endogen)
Prin helicaza se desface ARNmi/ARNsi in monocatene care vor fi incorporate in complexul de
inactivare RISC(RNA-Induced-Silencing-Complex) → Complex ARNsi/ARNm care produce
degradarea ARNm sau blocarea translatiei.
2. Reglarea translationala sub actiunea factorilor externi(reglarea sintezei de feritina)

In 5’UTR si 3’UTR -element cis-reglator, numit IRE(Iron Response Element) – ac de par

Fe2+↓ fixare proteina ce opreste sinteza pe matrita de ARN

Fe2+ ↑ continua sinteza

Videoclipuri informationale:

1. https://www.youtube.com/watch?v=KZBljAM6B1s&t=
2. https://www.youtube.com/watch?v=gG7uCskUOrA

29
3. https://www.youtube.com/watch?v=QvNdzLALvkI
4. https://www.youtube.com/watch?v=LuOaEe89_HE&t=
5. https://www.youtube.com/watch?v=LY36NxERR3s

30