B u n v e n i t l a

B u n v e n i t l a
Laboratorul
Laboratorul

de
de
Microbiologie
Microbiologie
IRASM
IRASM
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
Aleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6
tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: cponta@ifin.nipne.ro

Sistem

de manegement
al

calitatii

certificat
ISO 9001:2000
INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI
Cine
Cine
suntem
suntem

?
?
LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
Aleea Reactorului nr.2, Com. Magurele, jud. Ilfov, RO 19617 CP MG-6
tel. 021-404.23.20 fax 021-404.23.19 e-mail: cponta@ifin.nipne.ro

Sistem

de manegement
al

calitatii

certificat
ISO 9001:2000
INSTITUTUL NATIONAL DE CERECETARE DEZVOLTARE PENTRU FIZICA SI INGINERIE NUCLEARA HORIA HULUBEI
Cu
Cu
ce
ce

ne
ne

ocupam
ocupam

?
?
Laborator Laborator de de Microbiologie Microbiologie independent independent
Analize Analize pentru pentru produse produse farmaceutice farmaceutice ( (medicamente medicamente, , suplimente suplimente
alimentare alimentare) ) si si dispozitive dispozitive medicale medicale
Document de Document de referinta referinta: : European Pharmacopoeia European Pharmacopoeia, ed. a V , ed. a V- -a a
Clienti Clienti: : producatori producatori de de farmaceutice farmaceutice si si dispozitive dispozitive medicale medicale, in , in
deosebi deosebi interni interni
Oferta Oferta actuala actuala cuprinde cuprinde: :
Teste Teste de de Sterilitate Sterilitate ( (metoda metoda filtrarii filtrarii si si inocularii inocularii directe directe) )
Analize Analize de de Contaminare Contaminare Microbiana Microbiana: :
- -

Numarare Numarare

Total Total Germeni Germeni

Aerobi Aerobi

Mezofili Mezofili

(TAVC) (TAVC) si si
- -

Detectia Detectia

prezentei prezentei: : Salmonella sp Salmonella sp., ., E. coli E. coli, , St. St. arureus arureus si si

Ps. Ps. Aeruginosa Aeruginosa
- -

Detectie Detectie

si si

cuantificare cuantificare: : Enterobacterii Enterobacterii

totale totale

si si

alte alte

bacterii bacterii

gram negative gram negative
Analize Analize de de Contaminarea Contaminarea a a mediului mediului de de productie productie ( (TAVC TAVC): ):
aer aer, , suprafete suprafete de de lucru lucru, , apa apa, , amprenta amprenta manusii manusii
Am
Am
testat
testat

pana
pana

acum
acum

Comprimate Comprimate ( (filmate filmate sau sau nu nu ..) ..)

Materii Materii prime prime ( (lactoza lactoza, , celuloza celuloza, talc ..) , talc ..)
Capsule Capsule gelatinoase gelatinoase ( (goale goale, , pline pline, , moi moi, , uscate uscate ..) ..)
Geluri Geluri ( (unguente unguente) )
Supozitoare Supozitoare
Rasini Rasini farmaceutice farmaceutice
Materii Materii prime de prime de origine origine vegetala vegetala ( (tutun tutun, , ghiara ghiara diavolului diavolului ..) ..)
Siropuri Siropuri
Comprese Comprese de de tifon tifon si si netesut netesut simple simple sau sau impregnate cu impregnate cu geluri geluri / / unguiente unguiente
Seringi Seringi, ace , ace seringa seringa, , perfuzoare perfuzoare .. ..
Pansament Pansament toracic toracic ( (tifon tifon + + vata vata) )
Si Si

chiar chiar


Flacoane Flacoane goale goale (plastic, metal, (plastic, metal, su su sau sau fara fara capac capac ..) ..)
Spray cu antibiotic Spray cu antibiotic
Mojarat Mojarat din din insecte insecte
Carti Carti vechi vechi ale ale Bibliotecii Bibliotecii Nationale Nationale
Var Var razuit razuit de de pe pe pereti pereti ... ...
In total > 100 de In total > 100 de tipuri tipuri

de probe de probe diferite diferite


I
I
dentificarea microrganismelor patogene
dentificarea microrganismelor patogene
prin analiza secventelor genice
prin analiza secventelor genice
conservate
conservate

metoda PCR: principiu,
metoda PCR: principiu,
p
p
rocedura standard de operare,
rocedura standard de operare,
metoda de laborator,
metoda de laborator,
avantaje, limitari
avantaje, limitari
Proiect CEEX 78 / 2005 (BIOM)
Implementarea analizelor de identificare a
microorganismelor patogene
prin metode de biologie moleculara
si extinderea acreditarii laboratorului IRASM
Laboratorul Laboratorul de de Microbiologie Microbiologie
Detectia
Detectia

microorganismelor
microorganismelor

patogene
patogene

prin
prin

Metoda
Metoda

PCR
PCR
Reactia de polimerizare in lant a
Acidului Dezoxiribonucleic (ADN)
Este o tehnica prin care se genereaza multiple cpii identice,
pornind de la (ipotetic) 1 singura molecula de ADN - template.
Mai multe molecule sunt mai usor de detectat / analizat si de
prelucrat ulterior (transfer pe membrana, hibridizare, secventiere
etc)
Copiaza in vitro procesul biologic de Replicare a ADN
PCR
PCR
=
=
Polymerase Chain Reaction
Polymerase Chain Reaction
Reactia PCR a Reactia PCR a fost fost descoperita descoperita in in 1983 de 1983 de catre catre Kary Kary B. Mullis B. Mullis
(1993 (1993- -

Premiul Premiul

Nobel) Nobel)

si si, , dupa dupa

1988 1988 a cunoscut o dezvoltare exploziva a cunoscut o dezvoltare exploziva
si si

o o rafinare rafinare

extraordinara extraordinara, fiind reactia care a revolutionat , fiind reactia care a revolutionat
Biologia Moleculara a Biologia Moleculara a A Acizilor Nucleici. cizilor Nucleici.
Dezvoltarea Dezvoltarea tehnicii tehnicii a are la baza descoperirea re la baza descoperirea Taq Taq- -Polimeraz Polimerazei ei, ,
enzim enzima a- -cheie cheie

a a reactiei reactiei, o , o polimeraza polimeraza

stabila la temperaturi inalte (~ stabila la temperaturi inalte (~94 94
o o

C), C),
la care moleculele de ADN, in mod normal dublu catenare, la care moleculele de ADN, in mod normal dublu catenare,
disociaza disociaza

si si

astfel astfel

fiecare fiecare

catena catena poate poate

fi fi

copiata copiata. .
Licenta de utilizare a reactieie PCR este detinuta de compania H Licenta de utilizare a reactieie PCR este detinuta de compania Hoffman La Roche offman La Roche
-

Instrument: termocycler
-

Program de incalziri / raciri repetate,
la t
o
C bine precizate
Principiul

tehnicii

PCR:
- -



moleculele moleculele

de ADN se de ADN se separa separa


- -



in in prezenta prezenta

enzimei enzimei

Taq Taq- -polimeraza polimeraza + + primeri primeri

+ + amestec amestec

de de
dNTP dNTP- -uri uri

( (monomerii monomerii) + MgCl ) + MgCl

2 2 . .
- -



fiecare fiecare

catena se catena se lasa lasa

copiata copiata , , dand dand

nastere nastere

unei unei

catene catene- -surori surori, ,
complet complet

noua noua

si si

identica identica
- -

La La randul randul

lor lor, , noile noile

catene catene

se se vor vor

separa separa

si si

vor vor

servi servi

drept drept

matrite matrite
- -

Astfel Astfel, din 1 , din 1 molecula molecula

initiala initiala

dublu dublu

catenara catenara 2 molecule 2 molecule dublu dublu- -
catenare catenare identice identice 4 molecule 4 molecule
- - dupa dupa 32 de 32 de cicluri cicluri: > 1 : > 1 milion milion de de catene catene identice identice
Denaturarea

moleculei

de ADN-matrita
ADN ADN- -ul ul est e est e o o
mac r omol ec ul a mac r omol ec ul a
pol i mer i c a pol i mer i c a, , al c at ui t a al c at ui t a
di n 2 di n 2 c at ene c at ene
c ompl ement ar e c ompl ement ar e, ,
ant i par al el e ant i par al el e
3
5
5
3
La 94 La 94
o o
C, C, c el e c el e 2 2
c at ene c at ene se se separ a separ a
Deanat ur ar ea Deanat ur ar ea
5
3
3
5
Alinierea

primerilor
Primerii = oligonucleotide
(15-20 pb),
complementare cu
capetele fragmentului de
amplificat; folosite ca
amorsa pentru
polimerizarea dNTP-urilor
Pr i mer i i
Pr i mer i i
se
se
al i ni aza
al i ni aza
l a ~52
l a ~52
o o
C
C
5
3
3
5
5
3
3
5
3 5
3 5
3 5
3
5
Taq
Taq
ex t ends
ex t ends
at 72
at 72
o o
C
C
Taq polymeraza recunoaste
capatul 3 al primer-ului atast
la catena-matrita si incepe
elongarea lui
Elongarea
Nucleotidele (caramizile)
se asaza pe baza de
complementaritate la
matrita si vor fi legate
intre ele de catre Taq-
polimeraza
Denaturare Denaturare / / aliniere aliniere / /
elongare elongare repetate repetate in in
cateva cateva zeci zeci de de cicluri cicluri
succesive succesive
Cyc l e 1
Cyc l e 2
Cyc l e 3
Detectarea

/ recunoasterea

ampliconilor

Ulterior, ampliconii (fragmentele ADN obtinute) se detecteaza
prin electroforeza in gel de agaroza

avand aceeasi dimensiune, toate moleculele vor avea acceasi
mobilitate electroforetica si vor genera benzi

la aceeasi

distanta;

greutatea moleculara a ampliconilor se poate afla prin
compararea cu un marker de greutate care migreaza in
paralel.

In PCR-ul in timp real (Real-Time PCR), produsul de amplificare
este detectat prin intermediul colorantilor fluorescenti (probe).

In chimia

reactiei

sunt

incluse diferite

tipuri

de sonde
oligonucleotidice

care, intr-o

anumita

etapa

a amplificarii, se prind

specific

fie de produsul

amplificarii, fie de fragmentul-tinta

ce
urmeaza

a fi copiat.

FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer; Fluorescence Resonance Energy Transfer; fenomenul fenomenul

are loc are loc numai numai

cand cand

fluorescent fluorescent- -ul ul

si si

quencer quencer- -ul ul

sunt sunt

apropiati apropiati

Fluorescenta

emisa

se cumuleaza

si creste

in intensitate

pe

masura

ce cantitatea

de ampliconi

creste
Real-Time PCR

Reactia

de polimerizare

in lant

a ADN,
monitorizata

in timp real

Monitorizarea

intensitatii

fluorescentei

chiar

in timpul

reactiei

PCR permite

detectia si cuantificarea
produsului

acumulat, fara a fi nevoie

de a mai
deschide tuburile dupa terminarea reactiei.

Asadar, un instrument de Real-Time

PCR este in
acelasi

timp

si un analizor in sine

(spre

deosebire, un
PCR simplu

realizeaza

doar

etapa

de amplificare,
urmand

ca

analiza

si detectia

produsilor

sa fie facuta

intr-o

etapa

post

PCR)
LightCycler
Roche
real-time
real-time
real-time
real
real
-
-
time PCR
time PCR
iCycler
BioRad
7700
Applied Biosystems
5700
Applied Biosystems
FluorTracker
Stratagene
hardware hardware
6000 Rotor Gene
Corbett Research
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Model de actiune folosind sonde de hibridizare adiacente
FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
Model de Model de actiune actiune folosind folosind sonde sonde de de hibridizare hibridizare adiacente adiacente
Reporter
Quencher
P
Phosphate
Emission
real-time
real-time
real-time
FRET
FRET
Amplicon
FRET
P
Excitation
Alinierea
Denaturarea
Denaturarea
95
o
C
FRET
Emission
P
Excitation
T
m
55
o
C
Alinierea primer-ilor
si a sondelor
Alinierea primer-ilor
si a sondelor
Citirea
Fluorometrica
Citirea
Fluorometrica
real-time
real-time
real-time
LightCycler
LightCycler
Operation
72
o
C
Elongarea
( extensia primerilor)
Elongarea
( extensia primerilor)
Aplicatii
Aplicatii

ale
ale
tehnicii
tehnicii

PCR
PCR
(conventional)
(conventional)
Prin Prin detectarea detectarea prezentei prezentei unui unui fragment de ADN, fragment de ADN, considerat considerat drept drept
marker marker , , intr intr- -un un genom genom
- -

Prezenta Prezenta

unei unei

anumite anumite

specii specii

sau sau

tulpini tulpini

bacteriene bacteriene

intr intr- -o o

populatie populatie

mixta mixta

(ex. (ex. confirmare confirmare

diagnostic bacteriologic) diagnostic bacteriologic)
- -

Caracterizarea Caracterizarea

si si

deosebirea deosebirea

unor unor

taxoni taxoni

infraspecifici infraspecifici

(ex. (ex. tulpina tulpina) )

cu cu
aplicatii aplicatii

in in epidemiologie epidemiologie
- -

Diferite Diferite

moduri moduri

de de utilizare utilizare

a a tehnicii tehnicii

pot pot da da

combinatii combinatii

de de markeri markeri

genomici genomici

ce ce

pot pot constitui constitui

un un pasaport pasaport genetic genetic pentru pentru

respectiva respectiva

varietate varietate

( (licenta licenta

pentru pentru

tulpini tulpini

de de interes interes, , soiuri soiuri

si si

hibrizi hibrizi



in in agricultura agricultura) )
- -

Diagnostic Diagnostic uman uman

pentru pentru

maladii maladii

non non- -infectioase infectioase

( (gena gena

mutanta mutanta

exista exista

sau sau

nu nu, , individul individul

este este

homo homo- -

sau sau

heterozigot heterozigot) )
Aplicatii
Aplicatii

ale
ale
tehnicii
tehnicii

Real
Real
-
-
Time PCR
Time PCR
Detectia Detectia

calitativa calitativa

( (prezent prezent / absent / absent ) ) si si

cantitativa cantitativa

( (cuantificare cuantificare
absoluta absoluta) a ) a unor unor

agenti agenti

infectiosi infectiosi

( (microorganisme microorganisme

si si

virusuri virusuri) )
Caracterizarea Caracterizarea

unei unei

gene de gene de interes interes

intr intr- -un un genom genom

( (nivel nivel

de de
expresie expresie) = ) = cuantificare cuantificare relativa relativa
Confirmarea Confirmarea unor unor maladii maladii metabolice metabolice de supra de supra- - sau sau sub sub- -exprimare exprimare a a unei unei gene ( gene (fata fata de un de un
nivel nivel normal normal ) )
Efectele Efectele unui unui tratament tratament- -pilot pilot asupra asupra exprimarii exprimarii unei unei gene gene- -tinta tinta ( (fata fata de o de o gena gena house house- -
keeping keeping - - al al carei carei nivel nivel de de transcriere transcriere nu nu se se modifica modifica in in urma urma tratamentului tratamentului) )
Discriminarea Discriminarea

alelelor alelelor
Detectia Detectia

SNP SNP- -urilor urilor

(Single Nucleotide Polymorphism) (Single Nucleotide Polymorphism)
Aplicarea

tehnicii

PCR
in Microbiologie
Detectia microorganismelor prin reactia PCR
clasic se bazeaza pe amplificarea unor
regiuni specifice din genomul acestora.

Permite

confirmarea sau infirmarea
prezentei microorganismului

suspectat

Rezultatul

este

de tip Microorganism X
PREZENT / ABSENT in Y grame

(ml) proba

Exista

pe

piata

truse

de diagnostic PCR (kit-uri)
- sisteme ready to use. Ele

includ

moleculele-

cheie

pentru

asigurarea

specificitatii

reactiei:
primerii

precum

si

celelalte

componente

(Taq, buffer etc.) care asigura

amplificarea

unei

regiuni

din genomul

tinta
Etapele

analizei

folosind

tehnica

PCR (clasic):

Precultivarea esantionului

de proba

(5-10 h) -

optional dar

recomandabil,
in functie

de natura

probei

Extractia ADN

Verificarea calitatii ADN-ului

extras (spectrofotometric

si

/ sau

electroforetic)

Reactia

PCR

Electroforeza pentru

revelarea

ampliconilor Rezultat: prezent /
absent

Timp

de realizare: ~ 24-48 h de la primirea

probei

(cu comanda

anticipata

!!)
Controale

asociate

unei

analize

prin

PCR (clasic)

Un ADN -

Control Pozitiv

(CP)

Un Control Negativ

(CN)

Un Control Intern (CI)

Marker de greutate

moleculara

pentru

confirmarea

identitatii

fragmentului

obtinut
Aplicarea

tehnicii

Real-Time PCR in microbiologie

Permite

in plus cuantificarea
(nr. de genoame

/ gram proba)

Analiza

este

mai

rapida

(nu

este

nevoie

de
electroforeza)
Etapele

analizei

calitative

prin

Real-Time PCR

Precultivarea esantionului

de proba

(5-10 h)

-

optional dar

recomandabil, in functie

de natura

probei

Extractia ADN

Verificarea calitatii ADN-ului

extras

Reactia

PCR Rezultat: prezent / absent
Etapele

analizei

cantitative prin

Real-Time PCR

Extractia ADN

Verificarea calitatii ADN-ului

extras
(spectrofotometric

si

/ sau

electroforetic)

Reactia

PCR Rezultat: Nr. Cpii/ g (ml)

Analiza

foloseste

strategia

Absolute
quantification: cu ajutorul

unei

curbe

standard
se genereaza

un rezultat

= o valoare

absoluta
0.5
1.5
2.5
0 10 20 30 40 50 60 70
Cycles
F
2
/
F
1
NEG
10
100
1000
10000
100000
1000000
real-time
real-time
real-time
real
real
-
-
time
time
PCR quantitation PCR quantitation
Threshold
Cycle
Incarcatura microbiana
T
h
r
e
s
h
o
l
d

C
y
c
l
e
0.5
1.5
2.5
0 10 20 30 40 50 60 70
Cycles
F
2
/
F
1
Test Sample
Threshold
Threshold Cycle
0
10
20
30
40
50
1 2 3 4 5 6
Concentration log 10
Threshold Cycle = 35
Load = 10
3.8
copies/ml
Controale

asociate

unei

analize

prin

Real-Time PCR

Internal control (IC)

un ADN diferit

de cel

tinta, cu
primerii

specifici

lui, care se amplifica

in paralel

cu proba

de testat, in fiecare

tub probeaza buna desfasurare a
reactiei (surprinde posibilele inhibari);
Metoda devine de fapt un multiplex PCR

Unul

sau

mai multe

Controale Pozitive (CP). La
analizele

cantitative

minim

3 CP, diferite

concentratii
curba standard

Cel

putin

un Control Negativ per

sesiune surprinde
posibile contaminari incrucisate
Rezultatele
Rezultatele

proiectului
proiectului

CEEX 78/2005 (
CEEX 78/2005 (

BIOM
BIOM

)
)

modul
modul

IV
IV
Implementarea Implementarea urmatoarelor urmatoarelor analize analize: :
- -

Detectie Detectie

si si

cuantificare cuantificare

Salmonella sp. Salmonella sp. prin prin

Real Time PCR Real Time PCR

folosind folosind

kit kit- -ul ul: :
Artus Artus Salmonella sp. RG Salmonella sp. RG ( (Qiagen Qiagen) )
- -

Detectie Detectie

si si

cuantificare cuantificare

Listeria Listeria monocytogenes monocytogenes Prin Prin

real Time PCR real Time PCR

folosind folosind

kit kit- -ul ul: : Artus Artus L. L. monocytogenes monocytogenes RG RG ( (Qiagen Qiagen) )
- -

Detectie Detectie

si si

cuantificare cuantificare

Legionella Legionella pneumophilla pneumophilla din din apa apa, , prin prin

Real Time PCR Real Time PCR


folosind folosind

kit kit- -ul ul: : Aqua Screen L. Aqua Screen L. pneumophilla pneumophilla Detection Kit for Real Detection Kit for Real
Time PCR Time PCR (Minerva) (Minerva)
- -

Detectie Detectie

si si

cuantificare cuantificare

Legionella Legionella sp. sp. din din apa apa, , prin prin

Real Time PCR Real Time PCR

folosind folosind

kit kit- -ul ul: : Aqua Screen Aqua Screen Legionella Legionella sp. Detection Kit for Real Time PCR sp. Detection Kit for Real Time PCR
(Minerva) (Minerva)
- -

Detectie Detectie

Legionella Legionella pneumophila pneumophila din din apa apa, , prin prin

PCR PCR clasic clasic



folosind folosind

kit kit- -ul ul: :
Aqua Screen Aqua Screen Legionella Legionella pneumophilla pneumophilla PCR Detection Kit PCR Detection Kit (Minerva) (Minerva)
Incercarile Incercarile de de mai mai sus sus sunt sunt un un inceput inceput de drum de drum
Procedura
Procedura

standard de
standard de
operare
operare

pentru
pentru

analizele
analizele

efectuate
efectuate

prin
prin

tehnica
tehnica

PCR
PCR
si
si

real
real
-
-
Time PCR (IRASM
Time PCR (IRASM
-
-
SOP
SOP
-
-
T05):
T05):
- -

Definirea Definirea

fluxului fluxului: :
Camera de Camera de reactivi reactivi ( (portionare portionare

reactivi reactivi

pentru pentru

a a evita evita

dezghetari dezghetari

repetate repetate

si si

pipetarea pipetarea

mix mix- -

ului ului

de PCR, de PCR, fara fara

ADN) ADN) Camera de ADN Camera de ADN ( (izolari izolari si si adaugare adaugare ADN in mix PCR: ADN in mix PCR: proba proba si si
CP CP Camera de Camera de amplificare amplificare si si Post Post- -amplificare amplificare
- -

Precautii Precautii

si si

reguli reguli

de de buna buna

practica practica

de de lucru lucru

in in Laboratorul Laboratorul

de de
Biologie Biologie

Moleculara Moleculara
- -

Fisa Fisa

de de urmarire urmarire

a a probei probei, , asociata asociata

analizei analizei

prin prin

tehnica tehnica

PCR (de la PCR (de la
primirea primirea

probei probei efectuarea efectuarea analizei analizei eliberarea eliberarea rezultatului rezultatului) )
- -

Interpretarea Interpretarea

controalelor controalelor

si si

criterii criterii

de de acceptare/respingere acceptare/respingere
asociate asociate

fiecarei fiecarei

etape etape

a a analizei analizei
Electroforeza Electroforeza

in gel de in gel de agaroza agaroza

2% a 2% a ampliconilor ampliconilor

de de Legionella Legionella

pneumophila pneumophila ( (Aqua Screen L. Aqua Screen L. pneumophilla pneumophilla PCR Detection Kit PCR Detection Kit
- - Minerva) Minerva)
CP M CP10
-1
CN
L. monocitogenes
undiluted
L. monocitogenes
dilution 10
-1
Treshlod
QS1
QS3
QS4
QS2
.

L. monocitogenes
nediluat
QS4
QS3
QS1
L. monocitogenes
diluat 10
-1

QS2
Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards )
Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR analiza pe probe de Listeria
monocytogenes (suspensie din cultura de 24 h), folosind kit-ul Artus L. monocytogenes RG
CN
Izolat

din cultura
Albendazol -

tablete
Quantitaive

Standards
QS1, QS2, QS3, QS4
Treshold
Izolat

din cultura
Fish Gelatine

Materie

prima
Graficul de fluorescenta al reactiei Real-Time PCR - analiza pe 2 izolate din probe farmaceutice,
folosind kit-ul Artus Salmonella sp. RG
QS3
QS2
QS4
QS1
Cultured isolate from
Fish Gelatine Materie

prima
Curba standard in 4 puncte (Quantitation Standards)
Avantajele
Avantajele

Detectiei
Detectiei

microorganismelor
microorganismelor

prin
prin

PCR:
PCR:
Materialul Materialul genetic genetic ( (ADN ADN- -ul ul) este ) este componenta componenta celulara celulara cea cea mai mai stabila stabila (nu se (nu se
modifica modifica cu cu starea starea fiziologica fiziologica, , mediul mediul de de cultura cultura sau sau varsta varsta celulei celulei) si ) si
definitorie definitorie pentru pentru caracterul caracterul de de specie specie. . Secventa Secventa codificata codificata in ADN in ADN sta sta la la
baza baza tuturor tuturor reactiilor reactiilor metabolice metabolice si a si a celorlalte celorlalte trasaturi trasaturi fenotipice fenotipice
( (caractere caractere de de cultura cultura, forma si , forma si aranjamentul aranjamentul celulelor celulelor dupa dupa diviziune diviziune etc etc) )
care se care se constituie constituie in in criterii criterii taxonomice taxonomice si au si au condus condus la la cheile cheile de de
identificare identificare actuale actuale. .
De De aceea aceea, , verificarea verificarea prezentei prezentei unei unei anumite anumite secvente secvente de ADN de ADN tipica tipica pentru pentru
o o specie specie/ /tulpina tulpina de de microorganism microorganism este este dovada dovada cea cea mai mai obiectiva obiectiva a a
prezentei prezentei lui, lui, metoda metoda detectand detectand practic practic baza baza fizica fizica ( (biologica biologica) a ) a
criteriilor criteriilor taxonomice taxonomice. .
Detectarea Detectarea prezentei prezentei unui unui fragment fragment tipic tipic urmarit urmarit constituie constituie dovada dovada
inechivoca inechivoca a a prezentei prezentei acelui acelui microorganism. microorganism.

Tehnica
Tehnica
este
este
inalt
inalt
sensibila
sensibila
,
,
putand
putand
detecta
detecta
(
(
intr
intr
-
-
o
o
reactie
reactie
optimizata
optimizata
)
)
chiar
chiar
1
1
singura
singura
molecula
molecula
de
de
ADN
ADN
-
-
tinta
tinta
/ tub
/ tub

Detecteaza
Detecteaza
si
si
formele
formele
viabile
viabile
dar
dar
necultivabile
necultivabile
,
,
precum
precum
si
si
celulele
celulele
moarte
moarte
dar
dar
intacte
intacte
(
(
Poate
Poate

surprinde
surprinde

aplicarea
aplicarea

unui
unui

tratament
tratament

de
de
decontaminare
decontaminare

a
a
unui
unui

material care a
material care a
fost
fost

initial
initial
infectat
infectat

cu
cu
microorganismul
microorganismul

respectiv
respectiv

conditii
conditii
de
de
igiena
igiena
-
-
AVANTAJ ?)
AVANTAJ ?)
Avantajele
Avantajele

metodei
metodei

PCR
PCR
fata
fata

de
de
metodele
metodele

clasice
clasice

este
este
foarte
foarte
specifica
specifica
(nu
(nu
lasa
lasa
loc
loc
de
de
interpretari
interpretari
subiective
subiective
),
),
cu
cu
conditia
conditia
ca
ca
primerii
primerii
sa fie
sa fie
proprii
proprii
doar
doar
unor
unor
anumite
anumite
specii
specii
sau
sau
grupuri
grupuri
de
de
microorganisme
microorganisme

tehnica
tehnica
este
este
rapida
rapida
,
,
evitand
evitand
timpii
timpii
mari de
mari de
incubare
incubare

permite
permite
analiza
analiza
simultana
simultana
a
a
tuturor
tuturor
izolate
izolate
lor
lor
suspecte
suspecte
prezente
prezente
intr
intr
-
-
o
o
proba
proba
(
(
prin
prin
metodele
metodele
conventionale
conventionale
,
,
inclusiv
inclusiv
prin
prin
testele
testele
biochimice
biochimice
tip API,
tip API,
izolatele
izolatele
suspecte
suspecte
se
se
repica
repica
si
si
se
se
testeaza
testeaza
separat
separat
)
)
Limitarile
Limitarile

metodei
metodei
Esantionul Esantionul de de proba proba din care se face din care se face extractia extractia ADN ADN este este ( (prin prin specificul specificul
tehnicii tehnicii) ) mic mic si si, in , in unele unele cazuri cazuri, , poate poate deveni deveni nereprezentativ nereprezentativ: : este este dificil dificil de de
concentrat concentrat 10 g 10 g proba proba solida solida (ex. (ex. pulbere pulbere pentru pentru Salmonella Salmonella) in ~ 100 ) in ~ 100- -
200 200 l de l de solutie solutie ADN ADN care care va va intra in intra in reactie reactie
De De aceea aceea este este recomandabila recomandabila o o etapa etapa de pre de pre- -cultivare cultivare (ex. (ex. peste peste noapte noapte) a ) a
intregului intregului esantion esantion de de proba proba pentru pentru a a imbogati imbogati populatia populatia tinta tinta si si a a usura usura
detectia detectia
Abia Abia luand luand in in consideratie consideratie si si aceste aceste date, date, tehnica tehnica devine devine Metoda Metoda ( ( Method Method ) )
Adunand Adunand si si timpul timpul pentru pentru EF, EF, analiza analiza va va dura dura ~ 24 ~ 24- -48 h ( 48 h (desi desi tehnica tehnica in in
sine se sine se poate poate efectua efectua in ~4 in ~4- -5 ore) 5 ore)
Sensibilitatea Sensibilitatea metodei metodei este este puternic puternic dependenta dependenta de de etapa etapa de de extractie extractie ADN ADN
si si anume anume de de cat cat de de eficient eficient ADN ADN- -ul ul din din masa masa probei probei de de testat testat poate poate fi in fi in
final final concentrat concentrat in in cateva cateva sute sute de de l de l de extract extract. In . In cazul cazul abordarilor abordarilor
cantitative cantitative, , factorul factorul eficienta eficienta extractiei extractiei trebuie trebuie introdus introdus in calcule la in calcule la
ajustarea ajustarea rezultatelor rezultatelor
Prezenta inhibitorilor procesului enzimatic poate conduce la Prezenta inhibitorilor procesului enzimatic poate conduce la
rezultate fals negative (situatie care se surprinde cu ajutorul rezultate fals negative (situatie care se surprinde cu ajutorul unei unei
reactii paralele cu rol de Control Intern). Situatia este critic reactii paralele cu rol de Control Intern). Situatia este critica daca se a daca se
doreste izolarea ADN direct din proba (pentru cuantificare). doreste izolarea ADN direct din proba (pentru cuantificare).
Fiind Fiind inalt inalt sensibila sensibila, , tehnica este predispusa la contaminari tehnica este predispusa la contaminari
incrucisate de la amplificarile anterioare, putand conduce la incrucisate de la amplificarile anterioare, putand conduce la
rezultate fals pozitive (situatii surprinse prin asocierea unui rezultate fals pozitive (situatii surprinse prin asocierea unui Control Control
Negativ, prevenite prin regulile de buna practica de laborator s Negativ, prevenite prin regulile de buna practica de laborator si i
reduse ca sansa prin folosirea Real reduse ca sansa prin folosirea Real- -Time PCR la care tuburile cu Time PCR la care tuburile cu
amplicon raman inchise) amplicon raman inchise)
Analiza cantitativa este considerabil limitata de matricea probe Analiza cantitativa este considerabil limitata de matricea probei i ( (mai mai
ales ales pentru pentru ca ca metoda metoda nu nu permite permite preincubare preincubare) ) in in cazul cazul unora unora
dintre dintre matrici matrici, ea , ea este este practic practic inaplicabila inaplicabila (ex. (ex. pulberi pulberi insolubile insolubile in in
apa apa) )
Necesesita Necesesita personal cu personal cu pregatire pregatire de de specialitate specialitate si si experienta experienta
Definirea
Definirea

domeniului
domeniului

de
de
rezultate
rezultate
Analiza prin Analiza prin tehnici tehnici PCR este din start (prin conceptie) directionata spre un anumit PCR este din start (prin conceptie) directionata spre un anumit
microorganism. Un rezultat negativ infirma prezenta acelui micro microorganism. Un rezultat negativ infirma prezenta acelui microorganism, fara a organism, fara a
spune ceva despre microorganismul prezent spune ceva despre microorganismul prezent de de fapt fapt in proba. in proba.
Consecutiv, un rezultat pozitiv insotit de o valoare indica numa Consecutiv, un rezultat pozitiv insotit de o valoare indica numarul de c rul de c pii genomice pii genomice
(care se echivaleaza cu numarul de indivizi prezenti in unitatea (care se echivaleaza cu numarul de indivizi prezenti in unitatea de proba). de proba).
Metoda nu poate identifica / cuantifica alte microorganisme deca Metoda nu poate identifica / cuantifica alte microorganisme decat cele pentru care a t cele pentru care a
fost pr fost pro oiectata. Proiectarea se face in mod primar, din alegerea primeri iectata. Proiectarea se face in mod primar, din alegerea primerilor si a lor si a
conditiilor de reactie si nu poate fi ulterior conditiilor de reactie si nu poate fi ulterior ajustata ajustata in sensul modificarii domeniului in sensul modificarii domeniului
de detectie. De aceea, rezultatele generate de metoda sunt de detectie. De aceea, rezultatele generate de metoda sunt absent / prezent absent / prezent, ,
respectiv respectiv prezent in numar de ... prezent in numar de ... / unitatea de proba / unitatea de proba
Analizele Analizele posibile posibile prin prin tehnica tehnica PCR se PCR se incadreaza incadreaza deci deci la la Detectarea Detectarea prezentei prezentei si si
respectiv respectiv Cuantificare Cuantificare sau sau Detectie Detectie cantitativa cantitativa
In In ambele ambele cazuri cazuri, , Laboratorul Laboratorul va va stabili stabili pentru pentru fiecare fiecare microorganism in microorganism in parte parte
domeniul domeniul pe pe care care metoda metoda se se poate poate aplica aplica: : limita limita minima minima si si maxima de maxima de detectie detectie. .
Alte
Alte

conditii
conditii

pentru
pentru

efectuare
efectuare

analizelor
analizelor

prin
prin

tehnica
tehnica

PCR
PCR
si
si

Real
Real
-
-
Time PCR
Time PCR

Timp
Timp
de
de
realizare
realizare
pentru
pentru
fiecare
fiecare
tip de
tip de
analiza
analiza
: 24
: 24
-
-
48 h,
48 h,
in
in
functie
functie
de data
de data
comenzii
comenzii
si
si
de
de
alte
alte
analize
analize
solicitate
solicitate
la
la
acea
acea
proba
proba

Analiza
Analiza
pentru
pentru
respectiva
respectiva
proba
proba
a
a
fost
fost
anterior
anterior
validata
validata
la
la
laboratorul
laboratorul
nostru
nostru
pentru
pentru
metodele
metodele
conventionale
conventionale
(
(
nu
nu
este
este
la prima
la prima
analiza
analiza
)
)
Pharmacopoeia Europeana
Pharmacopoeia Europeana

utilizarea
utilizarea
metodelor de biologie moleculara in
metodelor de biologie moleculara in
controlul calitatii microbiologice
controlul calitatii microbiologice
(Eur. Ph., ed. a V
(Eur. Ph., ed. a V
-
-
a,
a,
Metode alternative
Metode alternative

cap.5.1.6)
cap.5.1.6)
Cerinte
Cerinte

privind
privind

validarea
validarea

metodei
metodei
Metoda
Metoda

introdusa
introdusa

pentru
pentru

prima data in ed. a V
prima data in ed. a V
-
-
a (2006),
a (2006),
la cap. 5.1.6.
la cap. 5.1.6.

Metode
Metode
alternative
alternative

(versus
(versus

Conventionale
Conventionale

)
)
Validarea
Validarea

metodei
metodei

este
este

o
o
necesitate
necesitate
Fiecare
Fiecare

tip de
tip de

Incercare
Incercare

(
(
Masuratoare
Masuratoare
)
)

necesita
necesita
validarea
validarea

a
a
diferiti
diferiti

parametri
parametri

Validarea
Validarea

vizeaza
vizeaza

analiza
analiza

in
in
ansamblul
ansamblul

sau
sau

(include
(include
toate
toate

etapele
etapele

procesului
procesului

)
)
Toate
Toate

rezultatele
rezultatele

parametrilor
parametrilor

validati
validati

sunt
sunt

raportate
raportate

la
la
metodele
metodele

conventionale
conventionale

(care
(care
sunt
sunt

luate
luate

drept
drept

referinta
referinta

)
)
Validarea
Validarea

Analizelor
Analizelor

de
de
Detectie
Detectie

(
(
calitative
calitative
)
)
Acuratetea Acuratetea si si precizia precizia = = rata rata relativa relativa

de de aparitie aparitie

a a rezultatelor rezultatelor

fals fals- -negative negative

si si fals fals

pozitive pozitive

prin prin

comparatie comparatie

cu cu

metodele metodele

conventionale conventionale, , atunci atunci

cand cand

se se
foloseste foloseste

un un inocul inocul

standardizat standardizat

( (referinta referinta) de ) de densitate densitate

mica mica
Specificitatea Specificitatea = = abilitatea abilitatea

metodei metodei

alternative de a alternative de a detecta detecta

in in proba proba

intrega intrega

gama gama

de de microorganisme microorganisme

pentru pentru

care a care a fost fost

conceputa conceputa

si si

numai numai

pe pe

acestea acestea

( (asuma asuma

si si

demonstrarea demonstrarea

selectivitatii selectivitatii; ; este este

opusul opusul

reactivitatii reactivitatii

incrucisate incrucisate ) )
Limita minima de Limita minima de detectie detectie = = cel cel

mai mai mic mic

numar numar

de microorganisme de microorganisme
prezent prezent

intr intr- -o o

proba proba, ce , ce poate poate

fi fi detectat detectat

urmand urmand

un un anumit anumit

protocol protocol

(se (se iau iau

in in considerare considerare

decat decat

microorganismele microorganismele

din din

proba proba

originala originala, , nesupusa nesupusa

diluarii diluarii

sau sau

incubarii incubarii) )
Robustetea Robustetea = = masura masura

capacitatii capacitatii

metodei metodei

de a de a ramane ramane

neafectata neafectata

de de
modificari modificari

mici mici

si si intentionate intentionate

in in parametrii parametrii

de de testare testare; da ; da indicatii indicatii

despre despre

corectitudinea corectitudinea

metodei metodei

atunci atunci

cand cand

se se modifica modifica

conditii conditii

precum precum

diferiti diferiti

operatori operatori

( (analisti analisti), instrumente, ), instrumente, loturi loturi

de de reactivi reactivi

si si laboratoare laboratoare
Validarea
Validarea

analizelor
analizelor

de
de
Cuantificare
Cuantificare

(
(
Detectie
Detectie

cantitativa
cantitativa
)
)
Acuratetea Acuratetea = = cel cel

mai mai apropiat apropiat

rezultat rezultat

al al

metodei metodei

alternative de o alternative de o
valoare valoare obtinuta obtinuta

prin prin

metoda metoda

conventionala conventionala. . Trebuie Trebuie

demonstrata demonstrata

pe pe

tot tot

domeniul domeniul de de lucru lucru

al al

testului testului

( (atat atat

in in termeni termeni

de de specie specie

detectata detectata

cat cat

si in si in termeni termeni

de de numar numar

de de indivizi indivizi

cuantificati cuantificati). Se exprima ). Se exprima ca ca

% %
de de recuperare recuperare

a a microorganismului microorganismului

dupa dupa aplicarea aplicarea

metodei metodei
Precizia Precizia = = grad grad

de de potrivire potrivire

intre intre

diferite diferite

incercari incercari

( (diferenta diferenta

intre intre

rezultate rezultate) ) atunci atunci

cand cand

procedura procedura

este este aplicata aplicata

repetat repetat

la mai la mai multe multe

esantioane esantioane

dintr dintr- -o o

suspensie suspensie

omogena omogena

de microorganisme de microorganisme

in in
conditiile conditiile

de de testare testare. Se exprima de . Se exprima de obicei obicei

ca ca

variatie variatie, , deviatie deviatie
standard standard sau sau

coeficint coeficint de de variatie variatie al al

unei unei

serii serii

de de masuratori masuratori
Specificitatea Specificitatea = = abilitatea abilitatea

metodei metodei

alternative de a alternative de a detecta detecta

in in proba proba

intrega intrega

gama gama

de de microorganisme microorganisme

pentru pentru

care a care a fost fost

conceputa conceputa

si si

numai numai

pe pe

acestea acestea

( (asuma asuma

si si

demonstrarea demonstrarea

selectivitatii selectivitatii; ; este este

opusul opusul

reactivitatii reactivitatii

incrucisate incrucisate ) )
Linearitatea Linearitatea = abilitatea metodei alternative de a genera rezultate = abilitatea metodei alternative de a genera rezultate
propotionale ca valoare cu concentratia microorganismelor prezen propotionale ca valoare cu concentratia microorganismelor prezente in te in
proba, pe un domeniu definit de concentratii; se determina pe proba, pe un domeniu definit de concentratii; se determina pe domeniul domeniul
corespunzator scopului corespunzator scopului
Domeniul Domeniul = = intervalui intervalui

intre intre

nivelul nivelul

inferior inferior si si

cel cel

superior de superior de
microorganisme microorganisme

ce ce

pot pot fi fi

detectate detectate

cu cu precizie precizie, , acuratete acuratete

si si

linearitate linearitate, ,
folosind folosind

metoda metoda

alternativa alternativa; ; se determina prin studii de precizie, se determina prin studii de precizie,
acuratete si linearitate acuratete si linearitate
Robustetea Robustetea = masura capacitatii sale de a ramane neafectata de variatii = masura capacitatii sale de a ramane neafectata de variatii
mici dar voite ale parametrilor. Ea ofera o indicatie asupra mici dar voite ale parametrilor. Ea ofera o indicatie asupra increderii in increderii in
rezultate rezultate, in diferite conditii de lucru considerate , in diferite conditii de lucru considerate normale normale , precum: , precum:
operatorul, instrumentele, diferite loturi de reactivi, diferite operatorul, instrumentele, diferite loturi de reactivi, diferite

labpratoare; se labpratoare; se
poate defini ca poate defini ca rezistenta intrinseca a metodei rezistenta intrinseca a metodei la diferite la diferite influente influente
exercitate de variabile din mediul operational sau inconjurator, exercitate de variabile din mediul operational sau inconjurator,

asupra asupra
rezultatelor. rezultatelor.
Robustetea Robustetea este un parametru ce trebuie determinat de producatorul este un parametru ce trebuie determinat de producatorul
metodei, insa daca utilizatorul modifica parametri considerati c metodei, insa daca utilizatorul modifica parametri considerati critici, ritici,
acesta trebuie sa evalueze efectele acestei modificari asupra ro acesta trebuie sa evalueze efectele acestei modificari asupra robustetii bustetii
metodei. Robustetea unei metode cantitative se judeca drept abil metodei. Robustetea unei metode cantitative se judeca drept abilitatea itatea
de a cuantifica, cu o relevanta statistica, diferite microorgani de a cuantifica, cu o relevanta statistica, diferite microorganisme sme- -test in test in
concentratii cunoscute, in urma varierii a diferiti parametri concentratii cunoscute, in urma varierii a diferiti parametri
Bibliografie
Bibliografie
European Pharmacopoeia, ed. a V
European Pharmacopoeia, ed. a V
-
-
a (2006), cap. 5.1.6
a (2006), cap. 5.1.6
Alternative Methods
Alternative Methods
Quality Assurance / Quality Control Guidance for
Quality Assurance / Quality Control Guidance for
Laboratories Performing PCR Analyses on
Laboratories Performing PCR Analyses on
Environmental Samples
Environmental Samples

EPA (United States
EPA (United States
Environmental Protection Agency), October 2004
Environmental Protection Agency), October 2004
Guidelines for
Guidelines for
Acreditation
Acreditation

of Swiss Medical
of Swiss Medical
Laboratories performing Nucleic Acid
Laboratories performing Nucleic Acid
-
-
based Diagnostic
based Diagnostic
Procedures
Procedures

Doc. Nr. 323.e / 2004, rev. 00,
Doc. Nr. 323.e / 2004, rev. 00,
Schweizerische
Schweizerische

Akkreditierungsstelle
Akkreditierungsstelle

(SAS)
(SAS)