Sunteți pe pagina 1din 18

REZOLVAREA SUBIECTELOR

BIOLOGIA DEZVOLTARII ANIMALE

1. Ce este echivalenta genomica, unde a fost demonstrata experimental si cu ce tipuri de


nuclei?
Echivalenta genomica reprezinta propietatea tuturor celulelor unui organism de a poseda aceeasi
informative genetic cu a zigotului, dar care difera din punct de vedere fenotipic (diferitii produsi
genici),
A fost demonstrata prin experimentele lui Gordon (in anul 1975) care a transferat nucleii
celulelor somatice in ovocite de amfibian aflate in metafaza meiotica II.
A fost confirmata in 1997 odata cu clonarea primului mamifer oita Dolly.
2. Enumerati anomalii asociate clonarii.
- Eficienta scazuta: 10%→0% in cazul nucleilor din celule diferentiate (limfocite, neuroni), sau
50% in cazul nucleilor din celulele embrionare
- Majoritatea embrionilor mor dupa implantare
- Diferite maladii: obezitate, placenta marita, boli cardio-vasculare, tumori renale, hepatice,
pulmonare, cerebrale
- Exprimarea precoce a genelor specific nucleului donor
- Embrionii clonati nu activeaza genele cheie in stadii de blastocit
- Model aberant de metilare al ADN-ului.
3. Ce intelegeti prin reprogramare nucleara?
Reprogramarea nucleara presupune inducerea unor modificari a activitatii genelor prin plasarea
nucleului intr-un mediu citoplasmatic nou. Genele inactivate in cursul diferentierii vor fii
reactivate.
4.Care este diferenta dintre o celula specificata si una determinata?
Destinul unei celule specificate poate fii influentat de celulele vecine, in timp ce destinul unei
celule determinate nu poate fii influentat de alte celulele vecine, este un destin fix. Celulele
determinate se diferentiaza intr-un anumit tip celular indiferent de locul unde pot fii
transplantate.
5. Cum se mentine starea determinata pe parcursul diviziunilor celulare?
Starea determinata se mentine prin molecule ce definesc aceasta stare, de exemplu MyoD,
Myf.5, miogenina ca proteine miogene, iar memoria nucleara asigura transmiterea starii
determinate de la o celula la alta in cursul diviziunii celulare prin mentinerea unui model de gene
active si inactive dependente de modificarile intrinseci ale metilarii ADN-ului sau inactivarea
cromozomului X. Aceste molecule sunt factorii transcriptionali.
6. Ce este transdiferentierea? Exemple. Prin ce se deosebeste de dediferentiere?
Transdiferentiarea este un proces prin care un tip celular se transforma in alt tip celular inrudit,
cu aceiasi origine embrionara. Este o exceptie a procesului de diferentiere. S-a observat in
tesuturile regenerate. Exemple:
1) In cultura, celulele epiteliului pigmentat al irisului (de origine ectodermica) in prezenta
hialuronidazei, a tioureei si a serului fetal de vital se aplatizeaza, pierd pigmentul, iar
prin adaugare de acid ascorbic se obtin celule cristaliniene-de origine ectodermica.
2) In cultura celulelor cromafine secretoare daca se adauga NGF se diferentiaza in
neuroni simpatici care secreta noradrenalina, dar ambele tipuri celulare au origine in
crestele neurale.
3) Transdiferentierea poate avea loc si spontan in cursul dezvoltarii embrionare si larvare
la Drosophila, unde este determinata de mutatiile genelor homeotice. Astfel se produce
transformarea unei structuri (antena) in alta (picior).
Spre deosebire de transdiferentiere, dediferentiarea este procesul prin care un tip celular se
transforma in alt tip celular de alta origine embrionara. Noile celule isi pierd propietatile
structurale si functionale ale celulelor diferentiate de la care s-a pornit.
7. Care este diferenta dintre motivele zinc-finger ale factorilor transcriptionali din clasele:
C2H2, receptori nucleari, GATA si LIM?
Diferenta dintre motivele zinc-finger ale factorilor transcriptionali din clasele: C2H2, receptori
nucleari, GATA si LIM consta in faptul ca ionul de Zinc se leaga la diferiti aminoacizi:
• C2H2→Zincul se leaga la 2 Cys si 2His
• RN→Zincul se leaga la 4 Cys
• GATA→ Zincul se leaga la 4 His
• LIM→ Zincul se leaga fie la 3 Cys si o His, fie la 3 Cys si 1Asp.
8. Enumerati factorii transcriptionali ce contin motive: zinc-finger, leucin-zipper, HLH si
HTH.
 Motive zinc-finger se regasesc in cadrul clasei C2H2 (la factorii transcriptionali TFIIIA,
Krüppel, Hunchback, la membrii familiei Zic),precum si la receptorii nucleari, factorii
transcriptionali GATA, proteinele LIM.
 Motivele Leucin-Ziper se regasesc la factorii: C-JUN, NRL, Kreisler, CREB, CREM,
BBF-2, Sibo, Giant, AP-1.
 Motivele HLH exista la factorii: ADD1/SREBP1.
 Motivele HTH apar la nivelul: clasei proteinelor cu homeodomeniu (Fam. Proteinelor
cu homeodomeniu, fam. POU), clasei PAX, clasei Triptophan clusters cu Fam. ETS,
clasei Forkhead (FOX).
9. Definiti termenul de potentare genica.
Potentarea genecica este un mecanism care permite ansamblarea rapida a unui enhancer si
exprimarea sincrona a unor gene intr-o populatie de celule. Acest fenomen poate afecta si
parametrii temporali sau spatiali ai activarii genelor embrionare.

10. Indicati factorii transcriptionali care se lega sub forma dimerica si monomerica de
ADN?
Receptorii orphan apartin clasei receptorii nucleari si sunt factori transcriptionali de tipul C4
care se leaga la ADN sub forma monomerica si dimerica. La fel si clasa PAX.
Sub forma monomerica se leaga la ADN urmatorii factori transcriptionali: proteinele cu
homeodomeniu, proteinele ETS, proteinele Forked, factorii transcriptionali T-BOX si MADS-
BOX, MEF2-Mynocyte Enhancer Binding actor.
Sub forma dimerica se leaga la ADN: receptorii nucleari, clasa Leu-Ziper, clasa HLH si clasa
HTH de la procariote.
11. Indicati factorii transcriptionali care depind de cofactori transcriptionali.
Exista factori transcriptionali care depind de cofactori transcriptionali: receptorii nucleari.
Receptorii pentru glucocoticoizi depind de cofactorul AP-1. De asemenea cofactorul TFIIB este
un factor bazal al receptorilor pentru progesteron si estrogeni. Iar proteinele TAF de la
Drosophila interactioneaza cu domeniul de legare al receptorilor RXR si al hormonilor tiroidieni.
12. Ce factori transcriptionali contacteaza fosa majora din ADN? Dar pe cea minora?
 Factorii transcriptionali care contacteaza fosa majora din ADN sunt: factorii Leucin-
Zipper interactioneaza cu fosa majora a ADN-ului prin intermediul aminoacizilor de la
nivelul suprafetei interne din cadrul domeniului bazic N-terminal. Superclasa factorilor
transcriptionali HTH interactioneaza si ei cu adancitura majora a ADN-ului fiind
implicati AA de la nivelul helixului de recunoastere. Factorul TFIIA interactioneaza si el
cu fosa majora din ADN-ului. Proteinele cu homeodomeniu – homeodomeniu
Antennapedia se asociaza cu curbura majora a ADN prin intermediul helixul de
recunoastere.
 Factorii transcriptionali care contacteaza fosa minora din ADN: clasa T-BOX, clasa
MADS-BOX, clasa HMG. Proteinele cu homeodomeniu – homeodomeniu Antennapedia
prin intermediul capatului N-terminal al bratului flexibil interactioneaza cu fosa minora a
ADN.
 Factorii transcriptionali Forkhead stabilesc contacte atat cu fosa majora cat si cu fosa
minora a ADN-ului. La fel si clasa Rel.
13. Daca in celule exista urmatoarele proteine: Id, MyoD, Myf5, Rb, AP1, ce fac ele,
prolifereaza sau se diferentiaza? Explicati de ce.
Id este un inhibitor al diferentierii. Se leaga la Myo D si Myf5 la nivelul situsurilor de legare la
ADN si deci aceste proteine devin nefuctionale. AP-1 este functional. Iar Rb are in stare
nefosforilata si are afinitate de legare la AND la Myo D si Myf5. Din cauza ca in celula Id este
atasat la MyoD, Myf5, Rb nu se mai poate lega la cele 2 proteine. Dar va fii fosforilat de o
protein-kinaza C si astfel devine functional.
Concluzie: celulele care prezinta Rb fosforilat si AP-1 nelegat la Myo D si Myf5 intra in
diviziune deci vor prolifera. Iar diferentierea este blocata.
14. Ce factori transcriptionali sunt activati dupa fosforilare?
Factori transcriptionali sunt activati dupa fosforilare: proteinele ETS, factorii transcriptionali
Forkhead, proteina Lin-31.
15. Indicati un tip de factor transcriptional sechestrat in citoplasma in forma inactiva si
precizati mecanismul de activare.
NFKB este un factor transcriptional din clasa Rel sechestrat in citoplasma, sintetizat intr-o
forma inactiva. Activarea NFKB are loc in nucleu si realizeaza in doua maniere:
 Fie prin degradarea IKB: IKB este inhibitorul lui NFKB fosforilata prin activarea unor
serin kinaze. O data fosforilata IKB este recunoscuta de enzimele associate cu ubiquidina
si cu ubiquinilaza pe lizinele N-terminale. Ubiquitinilarea determina o modificare de
conformatie careinduce disocierea NFKB- translocat in nucleu in timp ce IKB este
translocat la proteozom unde este degradata.
 Activarea NFKB implica peptide fosforilate pe resturile de Tyr care sunt recunoscute de
domeniul SH2 al proteinelor de semnalizare celulara. Fosforilarea Tyr din domeniul
reglator N-terminal al IKB determina activarea lui NFKB care e elberat si translocat in
nucleu.
16. Indicati categorii de factori transcriptionali care coopereaza in procesul transcriptional.
Exemple de interactii.

17. Indicati mecanisme de remodelare a cromatinei. Ce mecanisme asigura activarea


transcriptionala si care blocarea transcriptionala?
Remodelarea cromatinei poate fi realizata prin mai multe mecanisme:
 existenta proteinelor remodelatoare ale cromatinei care sunt implicate in blocarea
proteinelor homeotice si reglare genelor FOX la vertebrate – blocheaza transcriptia.
 metilarea ADN altereaza recunoasterea acizilor nucleici. Blocarea transcrierii genelor
metilate depinde de existenta unor represori transcriptionali care recunosc secventele
metilate fie independent, fie impreuna cu alte componente ale cromatinei.
 acetilarea histonelor asigura reglarea transcriptiei si activarea ei.

18. Ce intelegeti prin intiparire genomica? Cand are loc? Prin ce mecanisme se realizeaza?
Intiparirea genomica descrie procesul de blocare a genelor autozomale, in functie de
originea lor gametica. Desi genomurile parentale contin aceleasi gene, procesul de intiparire
permite exprimarea unor gene numai din genomul matern sau din cel patern. Are loc in cursul
diferentierii celulare germinale. Se realizeaza prin procesul de metilarea ADN- ului.
19. Care sunt mecanismele de compensare a dozajului?
Mecanismele de compensare a dozajului sunt:
 Absenta compensatiei caracterizeaza speciile la care cromozomii sexului sunt foarte mici
si poarta o fractie foarte mica de gene active.
 Intensificarea exprimarii genelor intr-un singur cromozom X la Drosophila
Se caracterizeaza prin faptul ca majoritatea genelor associate cromozomului X de la
mascul sunt transcrise de doua ori mai intens decat acelasi cromozom X de la female.
 Reducerea activitatii genelor in cromozomul X de la femele acest mecanism este folosit
in cursul evolutiei la doua grupuri dar intr-un mod diferit. La mamifere are loc
inactivarea cromozomului X in celulele somatice ale femelelor in timp ce la C. elegans
are loc o reducere a activitatii transcriptiei celor 2 cromozomi X a indivizilor
hermafroditi.
20. Ce este compensazomul?
Compensazomul este un complex hetreodimeric format din mai multe proteine (MSL1,
MSL2, MSL3, MLE, MOF) si are rolul de a acetila cromozomii vecini determinand transcrierea
intense a genelor respective. Aceste complexe se formeaza la sute de situsuri de-a lungul
cromozomului X la mascculi.
21. Enumerati rolurile localizarii ARNm.
 Asigura un control translational local.
 Asigura polaritatea embrionului sau a celulei.
 Evita exprimarea gresita a unui ARN.
 Evita formarea heterodimerilor in celule care exprima mai multe izoforme a unei
proteine.
22. Enumerati si definiti mecanismele de localizare a ARNm.
Mecanismele de localizare a ARNm sunt:
 Transportul nucleocitoplasmatic implica exportul transcriptilor printr-o anumita
regiune a nucleului si localizarea lor in citoplasma.
 Exportul din mitocondrii a fost demonstrat la Drosophila unde un ARN produs in
mitocondrii este exportat in citoplasma inconjuratoare si incorporat ulterior in granulele
polare
 Controlul spatial al stabilitatii ARN-urilor este un mecanism simplu dar neeficient
pentru localizarea unui ARN. Presupune faptul ca ARN-ul localizat corespunzator este
tradus, iar cel localizat necorespunzator este degradat.
 Ancorarea la componentele localizate anterior
 Transportul directional este cel mai frecvent. Consta in transportul ADN-ului printr-un
microtubul dintr-o regiune celulara in alta.
 Transportul dintr-un tip celular in altul este valabil pentru ARN-urile de la Drosophila
care sunt produse intr-un tip celular – celule nutritive (trofocite) transportate si localizate
in alt tip celular (ovocit).

23. Cum se poate regla traducerea prin intermediul proteinelor?


Reglarea traducerii se realizeaza prin intermediul unor proteine specific = proteinele
reglatoare ferice IRP (Iron Regulatory Protein) care recunosc secvente ale regiunii 5’UTR. In
cazul uni nivel ridicat de Fe in celule, proteinele IRP leaga Fe si devin inactive. In acest caz
ARN-ul este tradus. In momentul in care se iregistreaza un nivel scazut de Fe traducerea ARN-
ului este blocata .
Reglarea traducerii ARN-ului se poate realiza si la capatul 3’UTR- prin intermediul unor
proteine: este cazul ARN-ului care modifica receptorul transferinic. Acesta contine in regiunea
3’UTR o serie de elemente IRE, un element cu o regiune bogata in AU si o regiune recunoscuta
de situsul de recunoastere al ribonucleazei. Atunci cand exista o conentratie mare de Fe, IRP sunt
inactive si in acest caz ARN, receptorul transferinic este recunoscut de ribonucleaze si degradat.
In cazul unei cantitati mici de Fe, IRP lipsite de Fe devin active. Se atasaza la elementele IRE si
la proteinele ARN de degradare.
24. Explicati cum se poate bloca functia unui ARNm in cursul embriogenezei si
experimental?
In cursul embriogenezei indepartarea semnalelor de poliadenilare (care au rol in
activarea traducerii ARNm) blocheaza traducerea ARNm si maturarea ovocitara.
Experimental blocarea ARNm se realizeaza prin metode de interferenta. Duplexurile
ARNm lin-14-lin14 determina blocarea traducerii.
25. Enumerati (in ordinea activarii lor) categoriile de gene care actioneaza in cursul
dezvoltarii embrionare la Drosophila.
I. Gene necesare stabilirii segmentelor corporale:
Genele coordonatoare maternale:
 grupul de gene anterior: bicoid-gena cheie, exuperantia, swallow, staufen
 grupul de gene posterior: nanos-gena cheie, vasa, valois, tudor, oskar, pamilo
 grupul de gene terminal: torso- gena cheie, torso-like, trunk.
Axa dorso-ventrala:
 gena gurken
 gena twist
 gena snail
 gena rhomboid.
Genele zigotice:
Genele domeniilor nerepetitive sunt in numar de 5: gena hunchback, Krüppel, Knirps,
tailless si gena giant.
Genele perechi: - gena gürken, fushi tarazu, even-skipped.
Genele polaritatii segmentelor: - gena engruilea si gena wingless.
II. Gene necesare stabilirii identitatii segmentelor:
 Gene selectoare homeotice: genele homeotice formeaza complexele Antennapedia si
Bithorax care vor forma complexul HOM.
 Complexul Antennapedia: lavial, proboscipedia, defomed, Antennapedia
 Complexul Bithorax: Ultrabithorax, abdominal A, abdominal B.
26. Care gene zigotice de la Drosophila sunt activate de factori transcriptionali si care
folosesc alte mecanisme (ce mecanisme)?
Genele este activate de factori transcriptionali sunt urmatoarele : gena Knirps, gena
Krüppel si gena Hunchback zigotica.
Genele domeniilor nerepetitive sunt activate de produsii genelor maternale. Codifica factori
transcriptionali.
Genele polaritatii segmentelor sunt activate prin mecanisme de comunicare intercelulara.
De exemplu: exprimarea genelor engruilea si wingless este mentinuta prin semnalizare
intercelulara in celulele care exprima ambele gene.
27.Care sunt consecintele moleculare embrionare in urmatoarele situatii:
 Absenta proteinei nanos
Proteina nanos este codificata de gena nanos care este gena cheie a grupului posterior de
gene.In absenta proteinei nanos ARN-ul hunchback este tradus si se formeaza proteina
hunchback.
 Difuzia proteinei gurken pe fata ventrala a ovocitului, in spatial perivitelin ventral
Proteina gurken este receptata numai de celulele foliculare dorsale situate deasupra
nucleului. In celulele foliculare de pe fata ventrala a ovocitului proteina gurkeneste
absenta.
 Absenta proteinei Knirps
In regiunea posterioara se produc numai proteine Knirps, iar in absenta acesteia nu s-ar
produce nimic, reglajul genic in domeniile nerepetitive in regiunea posterioara nu are loc
si produsii genelor domeniilor nerepetitive nu pot influenta exprimarea genelor perechi;
embrionii nu pierd regiunea abdominala posterioara. Se extinde posterior domeniul de
exprimare al genei Krüppel
 Absenta proteinei even-skipped (eve)
Proteina even-skipped marcheaza marginea viitoarelor segmente. Nu se mai poate
exprima gena engrailed, gena care se exprima in celulele care contin o cantitate mare de
proteine eve si fushi-tarazu.
 Absenta proteinei wingless (wg)
Proteina wingless functioneaza ca un ligant pentru un receptor localizat in membrane
plasmatica a celulei vecine. Absenta ei determina inactivarea receptorilor, iar calea de
semnalizare nu are loc.
28. Dati exemple de mutatii homeotice, ce particularitate au aceste mutatii?
Mutatiile homeotice produc fenotipuri mai putin intalnite in care o parte a corpului este
inlocuita cu alta. Exemple:
Mutatia genelor Ultrabithorax determina transformarea halterelor la Drosophila intr-o
pereche de aripi suplimentare.
Proboscipedia- fenpotipul mutant - o parte a gurii se transforma in picior.
Antennnapedia- fenotipul mutant –antenele se transforma in picioare.

29. Definiti colinearitatea spatiala si temporala. Ordonati urmatoarele gene in functie de


momentul exprimarii lor spatiale (de-a lungul axei antero-posterioare) si temporale: Hox
c.12; Hox a.3; Hox d.1; Hox b.7; Hox a.6; Hox d.8; Hox c.5; Hox b.9; Hox c.11; Hox a.1;
Hox d.13.
Colinearitatea spatiala si temporala este o propietate a grupurilor Hox. Se refera la faptul ca
genele aflate spre extremitatea 3’ ale grupului se exprima mai devreme si in domeniile
anterioare. Genele aflate in extremitatea 5’ ale grupului se exprima progresiv si in domenii din ce
in ce mai posterioare.
Ordonarea genelor este urmatoarea: Hox a.1; Hox d.1; Hox a.3; Hox c.5; Hox a.6; Hox
b.7; Hox d.8; Hox b.9; Hox c.11; Hox c.12; Hox d.13.
30. Mentionati care din urmatoarele gene se pot exprima in regiunea gatului si care in
regiunea cozii unui embrion: Hox a.1; Hox d.13; Hox a.12; Hox b.2; Hox d.1; Hox a.13?
 In regiunea gatului se exprima genele: Hox a.1; Hox b.2; Hox d.1
 In regiunea cozii se exprima genele: Hox a.13; Hox d.13
 Hox a.12 nu apare.
31. Consideram urmatorul caz teoretic: gena Hox c.11 se exprima in mezodermul
vertebrelor sacrale. Conform caracteristicii dominantei posterioare ce vertebre vor fi
afectate in cazul inactivarii acestei gene?
Conform dominatei posterioare in cazul inactivarii genei Hox c.11 vertebrele din regiunea
toracala vor fi afectate
32. Enumerati genele Hox din grupul paralog 10
Genele Hox din grupul paralog 10 sunt: Hox a.10; Hox c.10; Hox d.10.
33. Indicati care din urmatoarele gene sunt mai asemanatoare structural si functional: Hox
c.10; Hox c.11; Hox d.10; Hox c.12; Hox a.11.
Urmatoarele gene prezinta asemanari structurale si functionale :
 Hox c.10 cu Hox d.10
 Hox c.11 cu Hox a.11
 Genele din grupurile paraloage sunt mult mai asemanatoare unele cu altele decat cu
genele vecine din fiecare grup Hox.

34. Definiti inductia prin apozitie si prin intermediul unui gradient morfogenetic.
Exemple.
Inductia reprezinta procesul prin care o celula sau un grup de celule embrionare
influenteaza diferentierea si comportamentul altor celule.
Inductia prin apozitie se realizeaza intre doua straturi embrionare in care un strat
denumit inductor elibereaza semnalele receptionate de un strat adiacent care in urma
semnalelor se va diferentia pe o anumita cale de dezvoltare.
Exemple: inductia mezodermului la amfibieni (mezodermul da nastere la mai multe
tipuri de celule: muschi, sange, notocord, pronefros). Inductia mezodermala poate fi
demonstrate in cultura. Daca se preleva un fragment de tesut localizat in polul animal si se
plaseaza in cultura va forma aici derivate epidermale. Daca acelasi fragment este plasat in
cultura in contact cu tesutul vegetativ, in calota animala se constata aparitia de sange si
celule musculare. Daca intre calota animala si tesutul vegetative se interpune un filtru cu poli
prea mici pentru a permite contacte celulare, inductia mezodermala are loc. Substantele
inductoare difuzeaza prin spatiile intercelulare si nu trec de la o celula la alta prin
intermediul jonctiunilor. Sunt suficiente 2 ore pentru inductia muschilor. Dupa 5 ore are loc
inductia completa a tesutului mezodermal.
Inductia prin intermediul unui gradient morfogenetic se realizeaza in interiorul unui
strat embrionar, sursa moleculelor inductoare fiind un grup de celule localizate la
extremitatea acestui strat. Moleculele inductoare se dispun in stratul respective sub forma
unui gradient de concentratie, astfel incat celulele se diferentiaza in accord cu concentratia
moleculelor inductoare din spatial extracelular.
Exemple: inductia membrelor la vertebrate: debuteaza prin proliferarea celulelor
mezodermale care se acumuleaza sub ectoderm in regiunea pectorala si pelvinica pentru a
forma mugurii membrelor. Varful mugurelui este acoperit de o zona groasa de ectoderm care
poarta denumirea de creasta ectodermala apicala. Aceasta structura este esentiala pentr
alungirea mugurelui membrelor si dispare atunci cand se formeaza degetele.
Mugurii menmbrelor se alungesc continuu prin alungirea mezenchimului de sub creasta
ectodermala apicala. Aceasta zona apicala sau de crestere se disperseaza la aproximativ 200
μm de la creasta ectodermala apicala. Moleculele eliberate de creasta ectodermala apicala
mentin diviziunea celulara din zona de crestere astfel incat celulele depasesc zona, ele
diferentiindu-se intr-o maniera caracteristica.
Celulele care parasesc primele zona de crestere formeaza structural zone marginale de
crestere, in timp ce celulele care sufera diviziuni in zona de crestere devin structurile cele
mai distale ale membrelor.
Elementele scheletice ale oaselor de diferentiaza intr-o directie proximal distala,
primul os care apare in cazul membrului anterior este humerusul, urmat de radius , ulna,
articulatiile si ultimele care apar sunt oasele degetelor.

35. Cum testati daca o molecula poate induce mezoderm?


Testarea unei molecule care induce mezoderm se realizeaza prin 2 metode:
 Metode de inducere in embrion- se realizeaza in 2 variante experimentale:
- Injectarea moleculelor potential inductoare in emisfera vegetative a unui embrion
normal de 32 de celule. Dupa acest tratament se formeaza embrion cu 2 axe dorsale.
Moleculele testate pot induce formarea unei axe dorsale suplimentare complete sau
incomplete.
- Injectarea moleculelor inductoare in orice punct al zonei marginale, dintr-un embrion
ventralizat, prin iradiere cu ultraviolete. La acesti embrioni se stabileste o axa dorsala
in jurul punctului de injectie. Si in acest caz restabilirea poate fi partiala sau totala.
 Metode de inducere in cultura- se realizeaza in 2 variante experimentale:
- Cultivarea explantelor din calota animala intr-un mediu de cultura ce contine
molecule la care urmeaza sa se testeze capacitatea inductoare mezodermala.
- Injectarea in polul animal al unei blastule timpurii a unui ARNm ce codifica o
potentiala molecula inductoare mezodermala dupa care se izoleaza explante din
calota animala si se cultive in vitro. In acest caz moleculele mezodermale inductoare
se formeaza endogeni. Metoda este cunoscuta si sub denumirea de “autoinductie”

36. Prin ce mecanism actioneaza proteinele eliberate din organizatorul Spemann?


Proteinele eliberate de organizatorul Spemann sunt: proteina Noggin, proteina Chordin si
proteina Follistatin. Proteinele Noggin si Chordin blocheaza calea BMP prin legarea de liganzii
BMP si blocarea accesului acestora la reglarea receptorilor corespunzatori. Proteina Follistatin
inhiba activitatea BMP intr-o maniera diferita de cea folosita de Chordin si Noggin. Acasta
proteina anuleaza semnalizarea BMP4 prin formarea unui complex trimeric Follistatin-BMP4-
Receptor.
37. Indicati moleculele implicate in formarea celor 3 axe ale membrelor la vertebrate si
precizati zonele din care sunt eliberate.
In formarea celor 3 axe ale membrelor la vertebrate participa:
 Axa antero-posterioara: proteina Sonic hedgehog, proteinele BMP2 si BMP4 sunt
eliberate de zona polarizata, localizata in marginea posterioara a mezenchimului, din
mugurii membrelor.
 Axa dorso-ventrala: gena Wnt7a eliberata din ectodermul dorsal si gena engrailed
eliberata din ectodermul ventral.
 Axa proximal distala: factori de crestere fibroblastici (FGF):FGF8, FGF4, FGF2 sunt
eliberati de creasta ectodermala apicala.
38. Enumerati caile de semnalizare embrionara si moleculele implicate in fiecare cale cu
precizarea functiei acestora.
Calea de semnalizare Hedgehog
 Costal 2 (Cos2) inhiba functia Hedgehog si ancoreaza la microtubuli un complex de 400-
500KDa format din Ci-Fu-Cos2.
 Cubitus interruptus (Ci) are rol in blocarea transcrierii, mediaza activarea
transcriptionala. Poate fii un activator sau un inhibitor asupra genelor.
 Receptorul Patched (Ptc) are rol in legarea ligandului Hedgehog.
 Receptorul Smoothened (Smo) initiaza calea de semnalizare specifica.
Calea de semnalizare TGFβ
 Domeniul MH1 in stare activa are capacitatea de a se atasa de ADN.
 Domeniul MH2 are o functie efectoare si participa la interactiile interproteice.
 Receptorii TGFβ de tip I intervin in fosforilarea proteinelor SMAD si cei de tip II in
autofosforilarea sau fosforilarea receptorilor de tip I. Receptorii de tip I si de tip II leaga
cu mare afinitate ligandul cand sunt asociati si cu afinitate foarte scazuta cand sunt
separati.
 Proteinele SMAD au un rol important in traducerea semnalelor si activarea genelor tinta.

Calea de semnalizare WNT:


 Proteoglicanii – sunt molecule implicate in calea WNT deoarece s-a constatat ca
glicozaminoglicanii sulfati afecteaza semnalizarea wingless in vitro. Proteoglicanii
functioneaza ca niste coreceptori si sunt imolicati direct in activitatea receptorilor WNT
prin formarea unui complex tripartite, la suprafata celulelor. Proteoglicanii sechestreaza
proteinele WNT si le concentreaza langa receptorii corespunzatori.
 Receptorii Frizzled/MOM-5 participa in diferite cai de semnalizare celulara.
 Dishevelled(Dsh) – implicata in semnalizare WNT la vertebrate, este o proteina
adaptoare necesara pentru ansamblarea unui complex de semnalizare analog GRB2 in
calea de semnalizare RAS.
 Zeste-white3 (Zw3)Glicogen sintetaz kinaze3 (GSK3) – fosforileaza catenin-β libera
din citoplasma.
 Axin – se leaga de GSK3 si poate facilita catenin-β, furnizeaza un support pe care se
asambleaza GSK3 impreuna cu substantele ei catenin-β si APC.
 Armadillo (ARM)/WRM-1/catenin-β – mediaza adeziunea celulara si participa la
traducerea semnalului WNT.
 APC/APR-1 – interactioneaza cu microtubulii si cu alte proteine.
 Pangolin/POP-1/TCF-1 – se comporta ca represori in absenta semnalului WNT.
Calea de semnalizareNotch-Delta
 Liganzii DSL66 sunt formati din mai multe regiuni: o regiune extracelulara, o regiune
transmembranara si o regiune citoplasmatica.
 Receptorii LNG72 leaga ionii de Ca si impiedica dimerizarea inaintea activarii de catre
liganzi.
 Efectorii CSL73 functioneaza ca activatori sau inhibitori ai transcriptiei.

39. Care sunt consecintele moleculare in caile de semnalizare embrionara in cazurile de


mai jos. Figurati in fiecare caz calea de semnalizare in respectiva situatie.
a. Proteina Armadillo/β-Catenin nu prezinta domeniul central ce contine cele 13
repetitii armadillo;
- Proteinele in lipsa domeniului central nu mai pot interactiona cu regiunile acide ale
APC, TCF si ale caderinelor si nu mai este degradata.
- Calea de semnalizare WNT
b. Nu exista proteine Co-SMAD
- In absenta proteinelor Co-SMAD receptorii reglati de SMAD nu se mai asociaza are
loc heterodimerizarea cu proteina SMAD
- Calea de semnalizare TGFβ
c. Nu are loc adugarea de cholesterol la capatul N-terminal al peptidei N-terminale
Hedgehog;
- Proteina nu mai este modificata covalent, peptide nu mai este ancorata in membrane
celulei respective, nu se mai produce palmitoilarea cisteinei, peptide nu mai
difuzeaza in spatial celular si nu mai permite semnalizarea pe distante scurte si lungi
- Calea de semnalizare Hedgehog.
d. Doua celule vecine exprima:una proteina Delta cealalta LAG-2. Ce cale de
semnalizare este initiate?
- Calea de semnalizare Notch-Delta
41. Enumerati si precizati principiul metodelor de detectare a apoptozei
A. Detectarea apoptozei pe baza morfologiei celulare
1. Detectarea apoptozei prin microscopie optica- presupune colorarea cu Hematoxilina-
eozina. In acest caz citoplasa si nucleul celulelor moarte apar mai intens colorate decat in
celulele viabile.
2. Detectarea apoptozei prin microscopie electronica- prin aceasta metoda celulele
apoptotice sunt mai greu de distins de celule la inceputul metafazei sau de o celula mica,
bogata in proteine. In microscopia electronica ca o celula sa fie considerata apoptotica
trebuie sa indeplineasca anumite criterii:
- la inceputul apoptozei, tipul celular poate fi identificat prin prezenta aspectelor
caracteristice, de tipul miofibrilelor in cazul cardiomiocitelor sau fibrelor musculare
triate;
- membrana plasmatica intacta, chiar primele stadii tarzii ale dezintegrarii celulare;
- nucleu si citoplasma electrodensa;
- inmugurirea celulei;
- vacuole mai clare;
- dezorganizarea citoplasmatica;
- fragmentare nucleara;
- tesuturile sunt incluse in rasini sintetice si pot fi sectionate la 1 μm si colarate cu
Albastru de toluidina.
B. Detectarea apoptozei prin colorare vitala.
Modificarile celulare ce conduc la expunerea fosfatidil serinei pe fata externa a
membranei plasmatice sunt reflectate de o crestere modesta a permeabilitatii celulelor apoptotice,
aspect care permite folosirea colorantilor vitali pentru identificarea apoptozei.
 Albastru de Nille- colorantul se acumuleaza in compartimentele acide ale celulelor de
tipul lizozomilor. Pentru observarea apoptozei in straturile profunde, embrionul poate fi
congelat dupa colorare si sectionat pentru a fi observate la microscop celulele moarte sau
in curs de apoptoza se coloreaza in albastru inchis.
 Acridin orange- se poate intercala in ADN sau ARN, se poate asocial si electrostatic.
Colorantul emite fluorescenta verde (525 nm), cand este asociat cu ADN si rosie cand
este asociat cu ARN (650 nm).
 Lyso Tracker Red (LTR)- actioneaza prin acumularea in compartimentele intracelulare
si in regiunile unde exista o cantitate mare de activitae fagolizozomala, rezultata din
fagocitarea corpilor apoptotici de catre celulele vecine. LTR poate fi fixat cu aldehide si
penetreaza usor in tesuturi. Colorantul retine fluorescenta in tesuturile hidratate in
metanol si clarificate in alcool benzilic si benzoat de benzil.
C. Detectarea fragmentarii ADN
 Electroforeza- apoptoza este corelata cu fragmentarea internucleozomala a ADN.
Extractele nucleare din celulele apoptotice prezinta un aspect de scara (ADN “lader”)
dupa electroforeza in gel de agaroza.
 Metoda Tunel- permite marcarea oricarui capat 3’ liber din ADN. Marcarea poate fi
vizibila in celulele necrotice si celulele micotice in faza S, in special in celulele cu numar
mare de cromozomi. Majoritatea fragmentelor ADN sunt extrase din celule necrotice si
numarul de fragmente okazaki incelulele aflate in faza S a ciclului celular este mai mic
decat numarul capetelor libere dintr-o celulal apoptotica.
 Metoda “cornet”- procedura microelectroforetica pentru vizualizarea directa a alterarii
ADN intr-o singura celula. Celulele mamiferelor suspendate intr-un gel de agaroza
subtire, pe o lama de microscop, lizate cu detergenti in prezenta unei concentratii mari de
saruri au fost supuse electroforezei in conditii neutre si colorate cu coloranti fluorescenti.
In cursul electroforezei, fragmentele de ADN migreaza spre anod mai repede decat
nucleul. Imaginea rezultata a fost denumita dupa aspectul de cometa.
D. Detectarea fosfatidil serinei expuse
Una din modificarile membranare care au loc in stadiile timpurii si intermediare ale
apoptozei este reprezentata de translocarea fosfatidil serinei de pe faza intern ape cea
externa a membranei plasmatice. Fosfatidil serina se poate detecta folosind Annexin V
marcata cu fluorocrom sau biotina.
E. Detectarea lizozomilor si a vacuolelor autofagice.
Se folosesc substrate pe baza de naftol, care se cupleaza cu o sare de diazoniu, pentru a
forma in tesut, precipitate insolubile de culoare rosie-bruna. Alte enzime lizozomale pot fi
detectate folosind substrate compatibile.
F. Detectarea activitatii caspazei-3.
Caspaza-3 este o cistein-proteinaza activata la sfarsitul cascadei apoptotice. Este sechestrata
in citoplasma sub forma inactiva de zimogen si activate prin clivaj proteolitic de catre alte
caspaze. Ea cliveaza substrate proteice ce contin secventa DEVD, aspartatul terminal fiind critic.
Peptida DEVD poate fi cuplata cu un compus fluorescent (AFC). In momentul in care peptide
DEVD- AFC este clivata de caspaza-3 se elibereaza AFC care poate fi monitorizat cu un
fluorimetru. In celulele vii, pentru vizualizarea activitatii caspazei-3 se foloseste peptida
permeabila PhiPhiLux. Aceasta face parte dintr-o clasa de substrate proteazice fluorogenice
folosite initial pentru a detramina daca epiteliul corneean detasat contine caspaza-3.