Material biologic = cultura bacteriana

Spargere perete celular = chimic – lizozim + fizic - șoc termic

Rupere membrană celulară = soluție tampon cu SDS

Deproteinizare = amestec cloroform : alcool izoamilic 24:1 v/v

Precipitare ADN = alcool etilic absolut

IZOLARE ADN DIN
ȚESUT VEGETAL
❑ pentru izolarea ADN din țesuturi vegetale au fost elaborate numeroase
metode, diferențele constând în sursa de material biologic utilizat şi în
modalitatea de distrugere a peretelui celular
❑ în general, procedeele de obţinere a ADN vegetal trebuie să îndeplinească
următoarele CONDIŢII:

✓ pereţii celulari trebuie să fie degradaţi pentru a elibera constituenţii celulari;

- fie prin mojararea ţesutului îngheţat (preferabil în azot lichid)
- fie prin convertirea celulelor vegetale la protoplaşti (prin tratarea
ţesutului vegetal cu enzime specifice)
✓ membranele celulare trebuie rupte, astfel încât ADN să fie eliberat în
tamponul de extracţie; această etapă se realizează prin utilizarea unui
detergent, de obicei SDS (dodecilsulfat de sodiu) sau CTAB (bromură de
cetiltrimetilamoniu)
✓ protejarea ADN faţă de acţiunea nucleazelor endogene, eliberate prin liza
celulară, este asigurată atât de prezenţa detergentului utilizat cât şi de
folosirea EDTA în diferitele tampoane de lucru

Cum acționează EDTA

✓ în plus, tratamentul cu amestec fenol:cloroform:alcool izoamilic (25:24:1,

v/v/v) determină eliminarea proteinelor (inclusiv a nucleazelor) din lizatul
celular
✓ agitarea soluţiei ce conţine ADN trebuie să fie cât mai mică, pentru a nu rupe
moleculele de ADN; dacă se respectă această recomandare, se pot obţine
molecule lungi de 50 – 100 kb
❑ spre deosebire de tehnicile de izolare a ADN din alte surse, la plante apare un
aspect specific: ADN izolat poate fi contaminat cu polizaharide ce inhibă
activitatea unor enzime
❑ pentru a elimina acest inconvenient (mai ales atunci când sursa de ADN este
reprezentată de plante lemnoase) au fost elaborate o serie de metode, dintre care
unele presupun ultracentrifugarea sau folosirea unor reactivi costisitori
❑ s-a dovedit însă că, folosirea detergentului CTAB în mai multe etape ale
extracţiei ADN asigură eliminarea polizaharidelor contaminante

❑ ADN poate fi izolat pornind de la mai multe tipuri de ţesut:

frunze proaspete lăstari seminţe calus
suspensii celulare polen ţesut deshidratat (plante din ierbar)
 Materiale și echipamente necesare
- mojare și pistile sterile
- tuburi Eppendorf
- vârfuri pentru micropipetă
- centrifugă
- baie de apă
- balanță
- micropipete
Medii de cultură, reactivi, soluții necesare:
1. Tampon de extracţie:
- CTAB 1%
- Tris 1 M pH 7,5
- EDTA 0,5 M, pH 8,0
- NaCl 5 M
- β-mercaptoetanol 14 %
2. Tampon TE:
- Tris HCl 1 mM, pH 7,5
- EDTA 0,5 M, pH 8,0
3. Amestec de deproteinizare: cloroform:alcool
izolamilic (24:1, v/v)
4. Alcool etilic absolut
5. Soluţie stoc de RN-ază.
 Mod de lucru

1. Se folosesc 0,5 - 1g de ţesut vegetal (de preferinţă frunze tinere).

2. Materialul biologic este mojarat cu azot lichid sau nisip de quartz şi trecut în
tuburi Eppendorf.

ATENȚIE! Materialul vegetal poate fi mojarat direct în tampon CTAB 1% (0,5

ml), încălzit în prealabil la 65oC – pentru a mări eficiența de extractție a ADN.

IMPORTANT! Se poate adăuga polivinilpirolidonă 2 – 4% în tamponul de

extracție, pentru denaturarea polifenolilor, prezenți în cantități mari în unele tipuri
de țesut vegetal.
3. Se adaugă 1 ml tampon de extracţie CTAB 1%, preîncălzit pe baia de apă la 65oC
și se agită ușor.
4. Probele se incubează pe baia de apă, la 65oC, timp de 30 – 45 min., cu agitare
ocazională.
5. După incubare, probele se răcesc 5 min. la temperatura camerei.
6. Se adaugă 1 volum amestec cloroform:alcool izolamilic (24:1, v/v) (pentru
deproteinizare) şi se agită ușor 5 – 10 min.
7. Se centrifughează 10 min. la 8.000 rpm pentru îndepărtarea resturilor celulare și
a proteinelor precipitate.
8. Se transferă faza apoasă (supernatantul) cu o pipetă, într-un tub curat, evitându-se
contaminarea cu materialul depus.
9. Se adaugă 1 ml amestec cloroform:alcool izolamilic (24:1, v/v), se agită ușor
5 – 10 min. (se repetă deproteinizarea).
10. Se centrifughează 10 min. la 8.000 rpm.
11. Se reia supernatantul într-un tub curat şi se adaugă 0,7 volume izopropanol
rece.
12. Se amestecă ușor prin inversie, pentru precipitarea acizilor nucleici (proba
poate fi lăsată peste noapte la temperatura camerei, pentru o precipitare mai
eficientă).
13. Se centrifughează 5 min. la 12.000 rpm.
14. Se îndepărtează supernatantul astfel încât să nu se piardă sedimentul (ADN
precipitat).
15. Se adaugă 500 µl tampon de spălare (păstrat la frigider), 76% etanol v/v, 10
mM acetat de amoniu sau 70% etanol și se agită ușor; operația se repetă de 3
ori.
16. Se îndepărtează tamponul de spălare și probele se usucă în curent de aer
cald (37oC) sau la temperatura camerei, 10 – 20 min.
17. Sedimentul obţinut este reluat într-un volum minim de tampon TE și se
păstrează la -20oC.
18. Proba de ADN poate fi examinată electroforetic sau utilizată direct în
experimente.