METODE DE EXTRACTIE SI SEPARARE A CAROTENOIDELOR

DIN PLANTE

Consideratii generale

Dezvoltarea impetuoasa a tehnicilor de izolare si identificare a

compusilor naturali a avut ca rezultat o imbogatire rapida a numarului
pigmentilor carotenoidici. Pentru izolarea din amestecurile de produsi
naturali, se tine cont de proprietatile lor fizice si chimice.
Pigmentii carotenoidici sunt sensibili la lumina, caldura, oxigen, acizi
si baze alcaline. Din acest motiv, trebuie respectate anumite conditii,
pentru pastrarea materialului supus analizei. Prin expunerea la
lumina, in mod deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se
realizeaza fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la
fotodistrugerea lor. De aceea, materialele biologice ce contin
carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de actiunea luminii.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor
realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru.
Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la
200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate
prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30- 600C).
In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi oxidate,
ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in cromatograme, pe
coloana si pe strat subtire). Este necesar sa se lucreze in stare inerta (in
atmosfera de azot sau vacuum). Oxidarea in timpul extractiei si saponificarii
poate fi minima prin utilizarea unei atmosfere de azot.

Prin expunerea carotenoidelor sau a materialelor biologice actiunii

acizilor, au loc o serie de transformari, cum sunt descompunerile
oxidative, izomerizarea cis-trans si izomerizarea 5,6-epoxizilor la 5,8-
epoxizi. Inlaturarea acestor inconveniente se realizeaza prin
neutralizarea cu CaCO3, piridina sau dimetilalanina. De asemenea, se
lucreaza cu solventi purificati si proaspat distilati, indeosebi derivatii
clorurati, cum este diclormetanul, care contine in mod frecvent HCl.
Depozitarea pigmentilor carotenoidici se realizeaza la intuneric, sub
atmosfera de azot sau in vacuum, la o temperatura de .200C. Cel mai
bine se pastreaza in stare cristalina. Pastrarea sub forma de solutie
se realizeaza in eter de petrol, hexan sau benzen.
Determinarea unor constante fizice ca temperatura de topire,
temperatura de fierbere, densitatea, indicele de refractie, intensitatea

1
absorbtiei la anumite lungimi de unda etc., ofera date distincte care permit
individualizarea unui compus organic, caracterizarea lui. Totusi, in
cercetarile actuale se utilizeaza metodele spectrale, care ofera informatii
mai precise privind structura si proprietatile substantelor organice.
Metodele spectrale au avantajul, fata de metodele chimice de identificare,
ca furnizeaza date in timp mult mai scurt si sunt mai precise, necesita
cantitati mici de substanta si ofera posibilitatea analizarii continue, in
diferite etape ale prelucrarii compusului extras, fara modificarea
compozitiei substantei cercetate, ceea ce permite recuperarea sa.

In lucrarea de fata sunt prezentate principalele metode de extractie,

separare si identificare a compusilor organici, cu aplicatii directe la
pigmenti carotenoidici.

Metode de extractie
Generalitati privind metodele generale de extractie

Distributia intr- o mare varietate de materiale si lichide biologice a

compusilor biologic activi a facut sa nu se poata adopta o metoda general-
valabila de extractie care sa poata fi aplicabila in mod universal si adoptata
ca o tehnica standardizata. Acest lucru se datoreaza structurii diferite a
compusilor biologic activi, chiar si cei din aceeasi clasa deosebindu-se
intre ei prin lungimea catenei, prin grupari functionale specifice sau
configuratie, solubilizarii diferite in solventi etc. Metoda de extractie se

alege in functie
de natura materialului vegetal,
de
usurinta
extractiei cu
solventi,
de
cantitatea
si
proprietatile compusilor supusi extractiei
(solubilitate, termolabilitate) etc. [1]

Dupa natura substantei de extras, lichida sau solida, se aplica extractia

solid-lichid, in marea majoritate

a
cazurilor,
si
extractia
lichid-lichid,
adica
extractia
unui
lichid
sau
a principiilor active aflate intr-un lichid
(rezultatul primei faze de extractie), cu ajutorul altui lichid nemiscibil.

Produsul vegetal proaspat sau uscat se pulverizeaza sau se zdrobeste

foarte fin pana la gradul de maruntire convenabil realizarii extractiei.

Alegerea
solventului
este
determinata
de
natura
principiilor
active,
proprietatile fizico-chimice ale solventului,
selectivitatea solventului. In
general,
substantele
termolabile sunt
extrase la rece
prin percolare
sau
agitare.
Pentru
extractia
la
cald
se
folosesc mai

multe
metode
in
functie
de
regimul
de extractie,
si
anume
extractia
la reflux, extractia
continua solid-lichid sau lichid-lichid. Cele mai bune rezultate se obtin
prin aplicarea extractiei in contracurent. O metoda eficace de extractie o
constituie ultrasonicarea materialului supus extractiei cu solventi.

2
Metode de extractie a carotenoidelor
Extractia carotenoidelor din produsul vegetal se realizeaza cu solventi
organici nepolari, de regula eter etilic sau cloroform, prin macerare, agitare
mecanica sau prin refluxare pe baia de apa in fierbere. Se impune un grad
de maruntire avansat, deoarece solventul nepolar nu patrunde prin
membrana celulara pentru a dizolva carotenoidele.

Materialul vegetal supus extractiei poate fi in stare proaspata sau

uscata.
Daca materialul supus extractiei se afla in stare proaspata, acest
lucru implica si existenta apei in tesuturi, pentru indepartarea ei fiind
necesara uscarea prealabila a materialului vegetal prin extractia cu
solventi miscibili cu apa (acetona, metanol, etanol), materialul
trebuind sa fie suficient de deshidratat pentru a se preta extractiilor
ulterioare cu solventi neaposi. In cazul materialului uscat, extractia se
realizeaza cu solventi nemiscibilicu apa.
Solutia extractiva organica contine derivati carotenoidici nativi, alaturi
de numeroase substante balast, cum ar fi clorofila.

Extractia din tesuturile plantelor superioare

Schema generala de extractie a carotenoidelor din produse vegetale

este cea prezentata mai jos.[2] Pentru tesuturile plantelor superioare
se cunosc o multitudine de metode de extractie, in continuare fiind
prezentate doua, ce constituie variante simplificate ale metodei
generale de extractie. [1]

Metoda I

Materialul vegetal este maruntit foarte fin (din considerentele aratate mai
sus) si omogenizat cu acetona, timp de 1-2 minute, in atmosfera de azot.
Omogenatul este filtrat, iar reziduul este supus extractiei ulterioare cu
acetona, pana cand omogenatul devine incolor. Extractele acetonice se
reunesc si se concentreaza la volum mic prin evaporare la rotavapor.
Peste extractul acetonic se adauga un volum egal de eter etilic proaspat
distilat, omogenizand amestecul si spalandu-l apoi cu o solutie de NaCl
(pentru ca eterul etilic sa se indeparteze usor si pentru a se evita
emulsionarea amestecului), pana la indepartarea completa a acetonei.

Aceasta metoda este foarte utilizata in cazul in care se realizeaza

extractii ale tesuturilor verzi ale plantelor, flori si fructe.

EXTRACTIA CAROTENOIDELOR DIN PRODUSE VEGETALE

PRODUS VEGETAL PULVERIZAT
-epuizare cu eter(cloroform);macerare,agitare,percolare,refluxare
FAZA ORGANICA
REZIDUU VEGETAL

-distilare volum redus;agitare Na2CO3

FAZA APOASA ALCALINA

FAZA ORGANICA
-saponificare KOH 10% in alcool(1-2 ore in baia de apa

(sapunuri ale acizilor grasi liberi)

in fierbere);racire;epuizare cu eter
FAZA ORGANICA
FAZA ALCALINA

(lipide saponificate)
-anhidrizare cu Na2SO4 sicc.,filtrare,
distilare vid volum mic
Hidrocarburi alifatice

FAZA ORGANICA

FAZA ORGANICA

REZIDUU TOTAL

precipitat alb-sidefos

o
-evaporare

CAROTENOIDIC
-racire 5-10 C;filtrare

reluari repetate cu eter

SOLUTIE EXTRACTIVA ETERICA
REZIDUU

filtrare;evaporare
reluari cu CH3OH 92%;
filtrare;evaporare
TOTAL CAROTENOIDIC I
TOTAL CAROTENOIDIC II

HIDROCARBURI CAROTENOIDICE

XANTOFILE DIHIDROXILATE

XANTOFILE MONOHIDROXILATE
ALTE CAROTENOIDE SUPERIOR OXIDATE

Metoda II

Aceasta metoda este utila in cazul in care se lucreaza cu cantitati mici

de substanta. Tesutul este maruntit si triturat cu Na2SO4 anhidru, pana
se obtine o pudra foarte fina, care este apoi supusa extractiei cu
acetona, urmata de eter etilic. Extractul se centrifugheaza, precipitatul
obtinut extragandu-se in continuare pana la incolor, solutiile
supernatante reunindu-se si concentrandu-se, transferandu-se apoi intr-
un volum egal de eter etilic, ca si in cazul metodei I.

Pentru ambele metode este necesara saponificarea, care

permite
indepartarea substantelor balast, mai ales a
clorofilei,
si
hidroliza
esterilor xantofilei. Saponificarea se realizeaza
prin adaugarea
de KOH

15% peste extract

(1:10,
v/v).
Aceasta
saponificare
se poate realiza in
doua moduri:

incalzirea amestecului alcalin timp de 10-15 minute pe baie de apa, in

atmosfera de azot,
la intuneric;
pastrarea la temperatura camerei sau la 50C, la intuneric, timp de 10-
15 ore.
Este de preferat utilizarea metodei de saponificare prin racire,
datorita faptului ca unii pigmenti carotenoidici (cum sunt xantofilele)
sunt labile termic, existand posibilitatea degradarii.

Extractia din alge

In cazul extractiei carotenoidelor din alge nu se mai aplica metoda generala

prezentata mai sus, datorita faptului ca, pentru o extractie eficienta, este
necesara o disruptie mecanica sau un pretratament. De asemenea, extractia
carotenoidelor din alge se realizeaza cu solventi mai polari decat acetona
(etanol sau amestec acetona:etanol), datorita faptului ca au polaritate mare si
permit efectuarea saponificarii pe extractul initial. [3]

Pretratamentul poate consta in suspendarea algelor in apa distilata si

racirea timp de 5-8 ore inaintea extractiei propriu-zise, apoi extractia cu
metanol. Un alt pretratament consta in decolorarea preliminara cu vapori
de apa sau tratarea cu apa fierbinte, timp de 2-3 minute, apoi racirea
rapida cu gheata. Acest ultim procedeu inlesneste extractia carotenoidelor,
dar are si un inconvenient, si anume posibilitatea distrugerii enzimelor care
actioneaza asupra carotenoidelor si clorofilelor.

Pentru o izolare eficienta a carotenoidelor din alge, acestea pot fi

supuse uscarii, desi, prin acest procedeu, unii compusi pot suferi
modificari, si pot exista diminuari ale randamentelor de extractie.
Un procedeu care implica uscarea prealabila a algelor a fost utilizat la
extractia carotenoidelor din Fucus serratus, cand algele sunt uscate
timp de cateva zile, macinate, apoi pudra este amestecata cu apa (800
ml apa la 500 g pudra), dupa care amestecul este eluat intr-o coloana
prin percolare cu amestec benzen:metanol (1:10, v/v). Eluatele de
culoare verde se indeparteaza, iar zona bruta se elueaza cu mult
solvent, se concentreaza si se cromatografiaza pe coloana de CaCO3.

Cromatografia

Cromatografia este o metoda fizica de separare bazata pe distributia

componentelor dintr-un amestec intre doua faze: una fixa, denumita faza
stationara, si alta mobila, ce strabate faza stationara. Faza stationara

5
poate fi un adsorbant solid (cromatografie de adsorbtie), un lichid
depus pe suprafata unui suport solid (cromatografie de repartitie), un
schimbator de ioni (cromografie prin schimb ionic) sau un gel
(cromatografie prin excluziune sterica).[5]
Cromatografia se aplica in scopul izolarii unor componenti prin
separarea acestora la elutia coloanei (in cromatografia pe coloana),
prin razuirea spoturilor de pe cromatoplaci (cromatografia in strat
subtire) sau prin taierea spoturilor de pe hartie (cromatografia pe
hartie).[6] Termenul de cromatografie, care inseamna .scriere in
culori. (chrom=culoare in limba greaca) a fost dat de Tvet (1906), cu
ocazia separarii colorantilor din frunze verzi (clorofile, carotenoide),
prin adsorbtie lichid-solid.

Principiul metodei Tvet consta in stabilirea unui echilibru intr-un proces cinetic
de adsorbtie-desorbtie intre faza solida fixa si faza lichida mobila. Faza
stationara este alcatuita din material adsorbant, granular, plasat intr-o
coloana, iar faza mobila este o solutie a amestecului de separat intr- un
solvent potrivit. Solutia se deplaseaza in coloana prin cadere libera sau cu
ajutorul unei diferente de presiune. Pentru distantarea zonelor in care s-au

adsorbit
diversi componenti ai amestecului se adauga un solvent la
partea
superioara
A coloanei. Componentii migreaza cu viteze diferite,
datorita faptului ca sunt retinuti in mod diferit de catre faza stationara.
Procesul este denumit developarea cromatogramei.

Separarea completa a componentilor din coloana, numita elutia

cromatogramei,
se
realizeaza
prin
adaugarea
de solventi
diferiti
Si
culegerea solutiilor
respective
in vase
diferite.
Componentii
ies
Din
coloana in ordinea inversa adsorbabilitatii lor in faza stationara.

Dintre metodele cromatografice, cromatografia in faza gazoasa si

cromatografia gaz-lichid sunt
foarte
raspandite,
datorita faptului ca
pot
fi aplicate oricarui
amestec
de componenti lichizi cu temperaturi joase de
fierbere.
Pentru compusii organici
cu
volatilitate
redusa, se
utilizeaza
cromatografia in strat subtire si cromatografia pe hartie.

In cromatografia pe hartie, faza stationara este constituita dintr-o

foaie de hartie de filtru, pe care se
aplica la o
extremitate
o
picatura
din
amestecul
de
analizat.
Hartia
se introduce apoi cu
extremitatea
continand picatura intr-un eluent situat intr- un vas acoperit. Eluentul
urca prin capilaritate si antreneaza componentele in ordinea
crescanda a valorii Rf, ce reprezinta raportul dintre viteza de migrare
a componentului si viteza de migrare a eluentului:

6
 v c
Rf = v e

Practic se masoara distanta de migrare a solventului si distanta de

migrare a componentului.
Recunoasterea componentilor incolori se realizeaza cu ajutorul unui
reactiv specific cu care dau compusi colorati.
Cand se doreste separarea neta a componentilor unui amestec, se
realizeaza o cromatografie bidimensionala cand, dupa o prima developare,
hartia se usuca, se roteste cu 900 si se asaza intr-un nou eluent.

In cromatografia in strat subtire, faza stationara este un strat

adsorbant (de silicagel sau alumina) cu o grosime de fractiune de
milimentru, depus pe o placa de sticla.

Principiul separarii este acelasi ca la cromatografia pe hartie, insa

prezinta avantajul unei separari mai rapide si mai precise.

Metode de separare a carotenoidelor

Separarea carotenoidelor dintr-un amestec este dependenta de natura

lor, si anume de polaritatea moleculei si de gruparile functionale din
molecula, ce determina caracterul lor hidrofil. Datorita acestor proprietati
exista doua metode de separare a carotenoidelor, si anume:

repartitia intre doua faze lichide nemiscibile intre ele;

separare prin adsorbtie pe adsorbant.
Schema generala de separare implica urmatoarele etape:
- faza organica, obtinuta dupa saponificarea extractului, este anhidrizata
cu Na2SO4 sicc., se supune repartitiei intre eter de petrol-metanol 92%
pentru a separa hidrocarburile carotenoidice si xantofilele
monohidroxilate care trec in epifaza(eter), iar xantofilele dihidroxilate si
alte carotenoide superior oxidate trec in hipofaza (alcool);

- fiecare faza se supune cromatografierii pe coloana de oxid de

aluminiu (Al2O3 standardizat .Brockmann II-III) sau alt adsorbant,
utilizand ca eluanti eter, alcool etilic:eter (1:9, v/v), alcool etilic
absolut, acetona. Se retin fractiuni de 50-100 ml, carora li se
determina puritatea prin cromatografie in strat subtire, folosind drept
faza stationara silicagel, iar drept faza mobila un sistem de solventi.

7
Separarea prin repartitia lichid-lichid

Dupa cum s-a aratat mai sus, un sistem de repartitie il constituie eterul
de petrol si metanolul. Prin aceasta metoda se pot separa carotenoidele
hidrocarburice de xantofile. Separarea este utilizata ca o faza
preliminara cromatografiei pe coloana sau in strat subtire.

Separarea prin repartitie intre doua lichide poate fi o alternativa a

saponificarii in vederea indepartarii clorofilei din extractele ce nu se pot
saponifica prin adaugare de baze, datorita existentei carotenoidelor
sensibile la aceste substante. Acest procedeu implica trecerea
xantofilelor in hipofaza metanolica, clorofilele trecand in epifaza. O alta
varianta este extractia unei solutii metanolice a unui pigment cu eter de
petrol, pana cand clorofilele sunt indepartate. In ambele cazuri,
xantofilele din hipofaza sunt trecute in eter etilic si apoi spalate cu apa.

Acest procedeu este din ce in ce mai putin utilizat datorita sensibilitatii

metodelor cromatografice, prin repartitie randamentul de separare fiind destul
de redus, carotenoidele, din cauza solubilitatii diferite, putandu-se gasi in
ambele fractiuni de repartitie. In cazul unei carotenoide ce poseda solubilitate
doar in unul din cei doi solventi (glicozid sau acid), acest procedeu se poate
aplica, preferandu-se, totusi, metodele cromatografice.

Separarea prin metoda distributiei contracurent

Acest procedeu consta in repartitie repetata intre cei doi solventi

descrisi mai sus, ajungandu-se la metoda denumita“distributia
contracurent”.[7] Dupa un numar suficient de mare de repartitii,
amestecul original este separat in fractiuni, avand fiecare o anumita
solubilitate: hidrocarburi carotenoidice, xantofile mono si dihidroxilate,
etc. Acest procedeu este urmat de o fractionare prin cromatografie pe
coloana, prin adsorbtie diferita datorata gruparilor specifice fiecarei
grupe de carotenoide. Acest procedeu este util in cazul separarii
xantofilelor foarte polare, care sunt puternic adsorbite.

Separea prin metode cromatografice

Pentru separarea carotenoidelor sunt foarte utilizate metodele

cromatografice, atat cea in strat subtire, cat si cea pe coloana.

Cromatografia in strat subtire

Cromatografia in strat subtire este o tehnica foarte utilizata in separarea si

purificarea carotenoidelor. Tehnica de baza a acestei metode a fost
descrisa de diferiti autori.[8] Gradul de purificare prin aceasta metoda este
mult mai mare, comparativ cu cromatografia pe coloana.

8
In functie de natura carotenoidului se vor alege faza stationara,
precum si faza mobila si sistemul de eluare din placi.
In cromatografia in strat subtire a carotenoidelor trebuie luate anumite
precautii, si anume:
aplicarea rapida a probei;
aplicarea probei la lumina slaba;
developarea imediata a cromatogramei;
developarea la intuneric a cromatogramei;
utilizarea unei atmosfere de azot.
Materialele biologice ce contin carotenoide sau solutiile lor trebuie ferite de
actiunea luminii deoarece prin expunerea carotenoidelor la lumina, in mod
deosebit la lumina solara directa sau la lumina UV, se realizeaza
fotoizomerizarea cis-trans, ceea ce poate conduce la fotodistrugerea lor.
Multe carotenoide sunt termolabile, in special xantofilele, incalzirea lor
realizandu-se doar in situatia cand este absolut necesar acest lucru.
Separarea carotenoidelor trebuie realizata la temperatura camerei, pana la
200C si la intuneric. In cazul saponificarii la cald, solutiile trebuie protejate
prin utilizarea solventilor cu puncte de fierbere nu foarte ridicate (30-600C).
In prezenta oxigenului (aer) sau a peroxizilor, multe carotenoide pot fi
oxidate, ele fiind foarte sensibile la oxigen in stare adsorbita (in
cromatograme, pe coloana si pe strat subtire).

Alegerea fazei stationare

Pot fi utilizati drept faza stationara foarte multi adsorbanti, dupa cum
rezulta din tabelul 1.
Sistemele cele mai utilizate in cromatografia in strat subtire cuprind
separarea carotenoidelor pe strat cu silicagel si developarea cu eter de
petrol (+5% eter etilic) sau pe MgO si developare cu benzen:eter de
petrol (9:1, v/v). Cromatoplacile ce au drept sistem stationar ZnCO3,
developate cu amestec hexan- alcool, dau rezolutii foarte bune pentru
xantofile, in timp ce CaCO3, MgO si Ca(OH)2 sunt utile atat in
separarea hidrocarburilor carotenoidice, cat si a xantofilelor.

Alegerea solventului
Solventii utilizati in separarea carotenoidelor prin cromatografie in strat
subtire sunt eluanti slabi, cum ar fi eter etilic, benzenul, precum si
amestec de solventi acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-
benzen etc. Solventii care dau o inalta rezolutie, datorita proprietatilor
lor, sunt alcoolii tertiari. Cloroformul este in general omis datorita
urmelor de acid clorhidric pe care le contine si care pot conduce la

9
transformari ale carotenoidelor. Acidul acetic este utilizat doar in cazul
carotenoidelor puternic adsorbite pe adsorbant.

Adsorbanti utilizati pentru cromatografia in strat subtire a

carotenoidelor (tabelul 1):

Nr.crt
Adsorbant

Al2O3

Celuloza

CaCO3:MgO:Ca(OH)2 (30:6:5, m/m/m)

Ca(OH)2

Ca(OH)2:silicagel (1:1, m/m)

Kieselguhr

Manitol

MgO

MgO:celita(1:2, m/m)

MgO:silicagel (1:1, m/m)

Silicagel

Zaharoza
ZnCO3

Detectarea carotenoidelor

Datorita faptului ca acesti pigmenti sunt colorati, se poate realiza si

identificarea vizuala a lor (se poate detecta vizual pana la 0,05 g - caroten).
Carotenoidele, insa, se decoloreaza rapid pe placa cromatografica, din acest
motiv fiind necesara stropirea cromatoplacii cu o solutie de parafina in eter de
petrol [8]. Unele carotenoide carbonilice sau produsii de descompunere
oxidativa pot fi identificati cu o solutie de rodamina 1% in acetona [9] sau prin
stropirea cu o solutie de SbCl3 in cloroform. Cea mai sensibila metoda
ramane totusi identificarea cu vapori de iod, cand se formeaza spoturi de
culoare bruna, prin aceasta metoda identificandu-se si eventualele impuritati.
Compusii incolori pot fi detectati prin vizualizarea fluorescentei verde
caracteristica la absorbtie in ultraviolet.

Eluarea carotenoidelor din cromatoplaci

Eluarea se face in functie de stratul adsorbant si de polaritatea

carotenoidelor. La cromatografiere pe silicagel G eluarea se face cu eter

10
etilic sau eter etilic +5-10% etanol (carotenoide polare), iar la
cromatografiere pe MgO eluarea se face cu acetona (hidrocarburi
carotenoidice si xantofile). Eluarea se face dupa scoaterea zonei
colorate de pe suport, urmatã de filtrare.

Cromatografia pe coloana

Cea mai importanta metoda de separare a carotenoidelor, cromatografia

pe coloana, a fost inlocuita recent cu cromatografia in strat subtire prin
caracteristicile sale de adsorbtie. Aceasta metoda este utilizata prin
imbunatatirea ei odata cu descoperirea cromatografiei in faza lichida de
inalta performanta, metoda care prezinta avantajele utilizarii cantitatilor
mici de substanta si vitezei de separare mari, dar limitata la o anumita
scara, neputand fi utilizatã in scopuri preparative [10].

In functie de natura carotenoidului se vor alege adsorbantul si

solventul de developare adecvat.
Dintre adsorbantii utilizati in cromatografia pe coloana pentru separarea
carotenoidelor, pot fi amintiti celuloza, Ca(OH)2 (utilizat mai ales la
separarea hidrocarburilor carotenoidice), zaharoza, amidon, silicagel,
Al2O3 (folosit la separarea monohidroxicarotenoidelor), CaCO3 si MgO
(acestia fiind utilaizaþi la separarea carotenoidelor cu polaritate
intermediara, cum este cazul xantofilelor). Pe aceeasi coloana se pot
utiliza si adsorbanti diferiti asezati in functie de puterea de adsorbtie, cel
mai adsorbant fiind asezat in partea superioara a coloanei.[11]

Solventii utilizati in cromatografierea pe coloana a carotenoidelor sunt

eluanti slabi. De obicei se lucreaza cu amestec de solventi, cum ar fi
acetona-eter etilic, etanol-eter etilic, acetat de etil-benzen etc. Coloana de
adsorbtie trebuie incarcata cu adsorbant in proportie de ¾, o parte
ramanand pentru solvent si extract. Adsorbantul trebuie sa fie foarte bine
compactat in coloana, din acest motiv umplerea coloanei realizandu-se cu
1portiuni mici de adsorbant ce trebuie apoi tasat. Extractul carotenoidic
trebuie sa fie foarte concentrat pentru a se putea adauga in coloana o
singura data. Dupa ce amestecul de pigmenti a fost introdus in coloana, se
incepe developarea cu solventi diferiti, incepand cu cel mai nepolar.[12]
In cromatografia pe coloana se disting trei procedee de baza pentru
separarea carotenoidelor, si anume :
cromatografia in zone;
cromatografia elutiei in trepte c)cromatografia elutiei in gradient.

11
Cromatografia in zone

Amestecul de carotenoide care se afla intr-un solvent nepolar se aplica pe la

partea de sus a coloanei. Pentru separarea zonelor pe coloana este utilizat
un solvent adecvat pentru developare. Zonele sunt scoase din coloana,
fiecare zona fiind apoi eluata individual cu un solvent polar.

Cromatografia elutiei in trepte

In aceasta metoda se aplica principiul general al cromatografiei pe

coloana, si anume introducerea amestecului carotenoidic in partea
superioara a coloanei, apoi aplicarea solventilor, in functie de polaritate.
Pigmentii sunt eluati in ordinea cresterii afinitatii lor de adsorbtie si
colectati. Fiecare zona eluata este apoi evaporata la sec, redizolvata
intr-un volum mic de solvent, in vederea spectrofotometrarii.

Concluzii

In perioada actuala, cand pe plan national si international se pune un

accent deosebit pe valorificarea
superioara a plantelor de cultura si a
celor din flora spontana, a
surselor naturale in general, in functie de
compozitia lor chimica, cunoasterea substantelor biologic active se impune
ca o cerinta de prima marime. Numai prin cunoasterea compozitiei
chimice a plantelor, a mecanismelor biochimice ce stau la baza
fenomenelor biologice se vor putea obtine hibrizi noi de plante, cu
continut ridicat in substante biologic active, care maresc valoarea
biologica a plantelor in care se gasesc.
Pentru stabilirea formulei moleculare, a structurii moleculare si a
proprietatilor fizico-chimice a unui compus biologic activ, este
necesara mai intai izolarea lui din amestecul de compusi naturali.
Metodele de extractie a compusilor biologic activi se aleg in functie de
proprietatile compusilor supusi extractiei. Extractia carotenoidelor din
produsul vegetal se realizeaza cu solventi organici nepolari (eter etilic,

cloroform), prin macerare, agitare mecanica sau prin refluxare pe

baia de
apa
in
fierbere,
impunandu-se un grad de maruntire
avansat,
Datorita
faptului
ca solventul nepolar nu patrunde prin membrana
Celulara
pentru a
dizolva carotenoidele.

Metodele de separare se aleg de asemenea in functie de proprietatile

fizice si chimice ale substantelor ce urmeaza a fi separate. Dintre
metodele utilizate frecvent la separarea carotenoidelor, o importanta
deosebita o prezinta metodele cromatografice, atat pe coloana cat si
in strat subtire, precum si separarile prin repartitia lichid-lichid si prin
metoda distributiei contracurent.

12
BIBLIOGRAFIE

V.Tamas, G.Neamtu-“Pigmenti carotenoidici si metaboliti”, vol 1, Ed.

Ceres, Bucuresti (1986)

I.Ciulei, V.Istudor, M.Palade-“Analiza farmacognostica si fitochimica a

produselor vegetale”, Ed. Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1997)

B.Amotz, A.Katz, M.Avron- J.Phycol., 18:529-37 (1982)

I.Pogany, M.Banciu-“Tehnica experimentala in chimia organica”,

Ed.Stiint.Encicl.Bucuresti (1977)

M.Iovu - Chimie organica, Ed Didactica si Pedagogica, Bucuresti (1982)

E. Lederer, M.Lederer-“Chromatography. A Review of Priciples and

Applications”, Elsevier, Amsterdam (1979)

I.A.Curl, G.F.Bailey - J.Agr.Food Chem., 9, 403 (1977)

E.Stahl-“Thin-Laye Chromatography”, Springer-Verlag, N.Y. (1979)

[9]J.Avigan, D.Steinberg - J. Lipid Res., 4, 100 (1963)
[10] AB Barua, JA Olson- J.Chromat.Biomed.Sci.Appl., 707:1-2, 69-
79 (1998)

[11]J.Dietz Bryant, J.D.McCord, L.Knight Unlu, J.W.Erdman-

J.Agric.Food Chem.,vol.40, No.4, 545-549 (1992)

[12] P.Hugueney, S.Romer, M.Kuntz, B.Camara- J.Biochem., 209, 399-407

(1992) Butterworth, Londra (1964)

13

PDF to WordX