Alcaloizii 

1. Introducere

Alcaloizii pirolizidici (PA) sunt compuși organici heterociclici sintetizați de

plante care sunt se crede că acționează ca compuși de apărareÎn special, membrii
Asteraceae, Boraginaceae, Heliotropiaceae, Apocynaceae, iar unele genuri de
Orchidaceae și Fabaceae sunt producători de PA [2]. Concentrații raportate variază
foarte mult, de la urme până la 19% greutate uscată și sunt considerate a fi
dependente pe o serie de factori, inclusiv stadiul de dezvoltare, tipul de țesut,
condițiile de mediu, și procedurile de extracție  împotriva ierbivorelor [1]. PA constau
dintr-o bază necină esterificată cu un acid necic. Baza necină include de obicei
pirolizidină, o hidrocarbură alifatică biciclică constând din două inele condensate cu
cinci atomi cu un azot la capat. Estimările indică faptul că aproximativ 6.000 de
specii de plante la nivel mondial, reprezentând 3% din toate plantele cu flori, produc
acest tip de metaboliți. 
Cu toate acestea, acestea au devenit o problemă de îngrijorare din cauza
toxicității lor asociate cu riscul ridicat de aport în preparatele din plante, de exemplu,
formulări fitofarmaceutice, ceaiuri medicinale sau alte produse medicamentoase
derivate din plante. În 1992, Ministerul Federal German al Sănătății a stabilit primele
limite ale conținutului de PA pentru paisprezece plante medicinale. Mai exact, au fost
vizate ierburi din genurile Symphytum, Borago, Brachyglottis, Cineraria, Alkanna,
Tussilago, Lithospermum, Cynoglossum, Senecio, Eupatorium, Anchusa, Petasites,
Heliotropium și Erechthites. Din cauza efectelor toxice ale PA, Institutul Federal de
Evaluare a Riscurilor  a stabilit limite mai stricte în 2011, prin care a fost
recomandată o doză zilnică <0,007 µg/kg greutate corporală și valabilă până în
2018. Pentru a aborda siguranța consumatorilor, este nevoie de proceduri de
extracție mai eficiente, împreună cu metode analitice robuste, selective și sensibile
pentru a aborda aceste preocupări. În cadrul combinației dintre un set de baze de
necină și un număr considerabil de acizii necici, se poate obține o diversitate
structurală enormă de PA. Acest lucru este amplificat și mai mult prin modificări,
inclusiv N-oxidarea azotului terțiar al bazei necină, hidroxilarea bazei necină și/sau
acidul necic și acetilarea grupărilor hidroxil ale fragmentului acid. Astfel, nu este
surprinzător că câteva sute de AP-uri diferite au fost deja identificate și în fiecare an
noi sunt descoperite noi variante.

2. Materiale si metode

O prima modalitate este o metodă care combină ultrasunetele cu agenți

tensioactivi, în care proprietățile de umectare, dispersie, solubilizare și emulsionare
reduc solventul și timpul necesar pentru extracția alcaloizilor din produsele naturale.
Dar inainte de prezentarea noii metode,o sa va prezint 2 metode descoperite inainte
pentru care avem nevoie de aceeasi plante. Plantele selectate pentru acest studiu
sunt Hyoscyamus muticus, Datura stramonium și Ruta graveolens. Hyoscyamus
muticus a fost recoltat în sudul îndepărtat al Algeriei, Datura stramonium și Ruta
graveolens au fost recoltate în nord-estul Algeriei. Părțile aeriene ale plantelor au
fost uscate la aer la umbră timp de câteva zile la temperatura camerei, măcinate și
depozitate în baloane de sticlă pentru a le proteja de umiditate și lumină.
Pentru extractia cu solvent: materialul vegetal sub formă de pulbere (10 g)
a fost umezit cu 15 mL de NH4OH (25%, m/m) și extracția cu solvent la temperatura
camerei a fost efectuată cu 300 mL de acetat de etil timp de 72 de ore. Extractul a
fost filtrat și solventul a fost evaporat într-un evaporator rotativ sub presiune redusă
la 40 °C. Reziduul, dizolvat în H20 şi acidulat cu H2S04 la pH 3-4, a fost extras cu
eter de petrol şi dietil eter pentru a îndepărta materialul lipofil, acid şi neutru. După
alcalinizarea soluției apoase la pH 9-10 cu NH4OH (25%, m/m), aceasta a fost
extrasă cu cloroform, extractul a fost spălat cu apă distilată până la pH neutru, uscat
cu Na2SO4 și concentrat sub presiune redusă pentru a obține alcaloizi. 
Metoda Soxhlet: extractele alcaloidale din plante au fost obținute după
metoda Harborne cu ușoare modificări. Pe scurt, materialele vegetale uscate sub
formă de pulbere (100 g) au fost degresate folosind un aparat Soxhlet(imaginea 1),
urmat de un proces de extracție cu acid acetic 10 % (200 ml) în etanol timp de 24 de
ore în aparatul Soxhlet. Extractul a fost concentrat folosind un evaporator
rotativ(imaginea 2) până la o masă concentrată. pH-ul a fost ajustat la 9 prin
adăugarea de soluţie concentrată de hidroxid de amoniu. A fost apoi extras cu
cloroform (50 ml) de trei ori. În timpul extracției, conținutul a fost supus la agitare
puternică. Stratul de cloroform a fost separat folosind o pâlnie de separare.
Porţiunea de cloroform a fost concentrată utilizând un evaporator rotativ. Prezența
alcaloizilor a fost confirmată cu reactiv Dragendorff, Mayer sau acid picric. Alcaloizii
au fost depozitați într-un flacon de sticlă chihlimbar curat la 4 °C.

 
Imaginea 1: aparat Soxhlet Imaginea 2: evaporator rotativ

Principiul noii metode: O probă de 10 g de material vegetal sub formă de

pulbere a fost suspendată în 400 ml de soluție de surfactant într-un pahar de sticlă și
sonicată timp de 2,5 ore într-o baie cu ultrasunete la o temperatură constantă de  25
°C. Extractul a fost separat prin filtrare simplă și materialul  rezidual a fost spălat cu
20 ml de apă pură. Soluția de filtrare  combinata a fost acidulată cu soluție de acid
sulfuric  (2%, m/m)   la pH 3-4 și alcaloizii au fost precipitați cu 15 ml de reactiv
Mayer. Precipitatul a fost dizolvat într-o soluție alcalină de carbonat de sodiu (5 %,
m/m) şi extras cu CHCI3. Stratul organic a fost spălat cu apă până la pH neutru,
uscat cu Na2S04 şi concentrat la sec sub presiune redusă pentru a obţine alcaloizi.
O alta metoda de extragere a alcaloiziilor este din soc folosind
ultrasunetele. Fructele de soc au fost recoltate la maturitatea de consum în
Compostela, Nayarit, Mexic. Au fost decojite manual pentru a obține pulpa și
subprodusele (coaja, semințe, și columela). Materiile prime au fost liofilizate la -50 ◦C
sub presiune de 0,12 mbar apoi la sol și cernut. O cutie Behnken a fost folosita
pentru extracția asistată cu ultrasunete. Efectele și interacțiunile individuale ale
sonificarii de amplitudine (XSA, %) la 40%, 70% și 100%, timpul de extracție (XET,
5, 10 și 15 min) și cicluri de puls (XPC, 0,4, 0,7 și 1 s) asupra conținutului total de
alcaloizi au fost evaluate în experiment. Pentru a reduce efectul de variabilitate
inexplicabilă a variabilelor de răspuns, a fost utilizată o ordine experimentală
randomizată. Extracția alcaloiziilor din produse secundare și celuloză a fost
efectuată de un sistem ultrasonic UP400S la frecvență de 24 kHz și 400 W. Sonda
cu ultrasunete are o amplitudine maximă de 100% sau 175 µm și putere acustică
densitate de 300 W/cm2. Acest dispozitiv a fost scufundat în soluția extractantă (2
cm). Liofilizat probele (2 g) au fost plasate într-un tub de extracție cu metanol (15 ml)
și tratate sub extracția asistată cu ultrasunete, in condiții controlate (conform
proiectării cutii Behnken) la 25 ± 2◦C. O baie de recirculare a apei a fost folosita
pentru a menține temperatura. Mostrele au fost apoi centrifugate la 8000 × g, 4 ◦C și
10 min.

Imaginea 3: sistem ultrasonic UP400S Imaginea 4: proiectarea cutii Behnken

Conținut total de alcaloizi a fost determinat conform procedurii descrise de

Ontiveros-Rodriguez et al.[ studiul configurațional a unui alcaloid din Annona
purpurea] cu modificari. Extractele metanolice obţinute au fost diluate cu 10 ml de
metanol. Probele au fost agitate moderat timp de 4 ore la temperatura camerei (25 ±
5◦C) apoi lăsat să se odihnească la frigider (4 ◦C) peste noapte. Extractele au fost
filtrate, așezate pe gheață și pH-ul lor a fost ajustat la 10,0 cu 15% NaOH. În cele din
urmă, s-a adăugat CH2CI2 în raport 1:2 (extract: CH2CI2) probelor, iar stratul
organic a fost recuperat. Acest pas a fost efectuat de încă două ori pentru a aduce
împreună straturile organice obţinute. Extractele (100 µL) au fost amestecate cu
reactivul Dragendorff (1000 µL) și absorbanța a fost măsurată la 530 nm într-un
spectrofotometru. Conținut total de alcaloizi a fost calculat cu o curbă standard de
chinină, iar rezultatele au fost exprimate ca miligrame echivalente de chinină per

gram de greutate uscată (mg/g DW). Analiza metodologiei suprafeței de răspuns:

A fost aplicat datelor conținutului total de alcaloizi pentru a obține cele mai bune
condiții de extracție pentru fiecare materie primă. Pentru a calcula răspunsul prezis,
a fost utilizată o ecuație polinomială de ordinul doi unde Y este răspunsul prezis
(conținut total de alcaloizi), β0 este o constantă, βi este coeficientul de efect principal
pentru fiecare variabilă, Xi reprezintă valorile codificate sau necodificate pentru
factorii (XET, XPC și XSA), iar βij sunt coeficienții efectului de interacțiune. Pentru a
determina efectele principale, interacțiunile și adecvarea
modelul, a fost efectuată o analiză a varianței (ANOVA) și coeficienții de determinare
(R-pătrat și R-ajustat) au fost cuantificate; cu semnificaţie a fost folosit şi testul
neajustării
nivel reprezentat de 1%.
O alta modalitate este procesul Stas-Otto: constă în esență în tratarea sub
formă de pulbere și substanță medicamentoasă cernută cu 90–95% (v/v) etanol,
acidulată în prealabil cu acid tartric. Proporția de medicament brut față de solvent
trebuie menținută la 1 kg până la 1 l. Alcoolul este distilat sub vid, iar reziduul apos
rezultat este tratat cu eter de petrol (60-80°C) ca sa fie îndepărtate complet
componentele grase. Dacă orice alcaloid este îndepărtat de eterul de petrol, poate fi
recuperat prin tratarea acestuia cu acid mineral diluat. Astfel, extractul apos rezultat
este amestecat cu cea mai mare parte a extractului apos. Extractul apos combinat
este filtrat şi evaporat la uscăciunea de preferință într-un evaporator rotativ cu film
subțire sub vid. Reziduul se extrage cu etanol absolut dizolvând astfel alcaloizii totali.
O metoda asemanatoare cu cea de mai sus este procesul Kippenberger: În
procesul lui Kippenberger, substanța vegetală sub formă de pulbere și cernută este
în primul rând digerata cu soluție de tanin (100 g) în glicerol (500 g) la o temperatura
constantă de 40°C pentru o durata de 48 ore. Amestecul rezultat este încălzit în
continuare la 50°C pentru a ajuta la coagularea completă a substanțelor proteice,
răcite la temperatura ambiantă și în cele din urmă filtrate. Filtratul rezultat este agitat
bine cu eter de petrol pentru a scăpa de defecte materiale (uleiuri, grăsimi și ceară),
iar ultimele urme de eter de petrol sunt îndepărtate din extract prin încălzire fie pe o
baie de apă (electrică), fie prin expunere la lampă cu infraroșii. Extractul se
acidulează ulterior și se agită cu cloroform, succesiv pentru a îndepărta cea mai
mare parte a alcaloizi, și anume, atropină, codeină, colchicină, narcotină, nicotină,
papaverină, spartenină și tebaina.
Extractul rezidual rezultat mai poate conține narceină, curarină și morfină. In
orice caz, narceina și morfina pot fi izolate prin trecerea CO2 proaspăt generat direct
în extract pentru a transforma hidroxidul alcalin în carbonatul lor corespunzător, care
este apoi supus în cele din urmă la extracția cu solvent folosind un amestec de
alcool și cloroform. În cele din urmă, al treilea alcaloid, curarina, poate fi extras prin
agitare cu un amestec de volume egale de eter si cloroform. Cu toate acestea, o
combinație a procesului lui Kippenberger și a procesului Stas-Otto prin aplicarea
acestuia se constată că extractul alcoolic final obținut prin acest din urmă proces dă
o mai bună separare a alcaloizilor.
Ultima procedura pe care am ales-o este procedura experimentală SFE.
Execuțiile experimentale au fost efectuate folosind o unitate SFE care conține o
celulă de extracție din nailon (80 ochiuri) de aproximativ 274 × 10−6 m3 și presiune
maximă de 400 bari descrise
de Pasquel et al. Datele au fost luate la temperaturi de 35 și 45 ◦C, presiuni de 150,
200, 250 și 300 bari și debitul total de solvent de 3,7 ± 0,2 × 10−5 kg/s, folosind
etanol ca cosolvent (5,0%, v/v), 12,15 ± 0,01 × 10−3 kg de materie primă si
metodologia descrisă de Pereira și colab. [Extracția alcaloizilor indolici din
Tabernaemontana catharinensis folosind CO2 supercritic + etanol: o evaluare a
originii materiei prime și a variabilelor procesului]. Masa experimentele de cinetică de
transfer au fost efectuate în condiții care maximizează randamentul global folosind
un debit total de solvenți de 3,5 ± 0,2 × 10−5 kg/s. Masa de materie primă utilizată în
acestea experimentele au fost de 85,00 ± 0,01 × 10−3 kg.
 3. Rezultate si discutii

Scopul principal al fiecărei strategii de extracție este obținerea unei recuperări

de 100% a analitului din matricea respectivă. Pentru a evalua eficiența diferitelor
strategii de extracție a PA din diferite părți ale plantei, a fost revizuită literatura
despre treisprezece genuri de plante relevante cu privire la condițiile de extracție
selectate. Au fost aplicate o multitudine de procedee de extracție și solvenți. Părțile
de plante au fost folosite proaspete, liofilizate, uscate în cuptor sau congelate în azot
lichid. Ulterior, au fost zdrobite, apoi măcinate sau măcinate pentru a obține o
pulbere adecvată pentru o extracție eficientă. Macerarea materialului vegetal a fost
efectuată în solvenți organici, apoși, acizi sau bazici, sau chiar în amestecuri ale
acestora. Probele au fost extrase o dată sau de mai multe ori, cu sau fără tratarea
probelor la temperaturi ridicate și pentru perioade de timp cuprinse între 30 de
minute și câteva zile. Aceiași parametri (adică, solvent, temperatură și timp) au fost,
de asemenea, variați pentru toate celelalte proceduri de extracție raportate.
Extracția asistată cu ultrasunete a conținutului total de alcaloizi din probele de
soc: Designul experimental și rezultatele obținute la conținutul total de alcaloizi sunt

prezentate în Tabelul 1. Extracția asistată cu ultrasunete , tratamentele și materia

primă au avut efecte semnificative ca conținutul total de alcaloizi al pulpei și al
subproduselor (coaja, semințe,
și columela) a depins de condițiile experimentale din extracția asistată cu ultrasunete
(p < 0,05). Cel mai mare conținut total de alcaloizi (7,48, 2,31 și, respectiv, 0,60
mg/g) a fost găsit în coajă, semințe și columelă sub aceeași condiții de timp (5 min)
și amplitudine de sonicare (70%) cu ciclu de puls de 1 s pentru exfoliere și columela,
și ciclu de impuls de 0,4 s pentru semințe. De asemenea, s-a găsit cel mai mare
conținut total de alcaloizi din pulpă (1,16 mg/g).
5 minute de extracție, 0,7 s de cicluri de puls și 100% amplitudine. Aceste diferențe
în conținutul total de alcaloizi ar putea fi atribuite diferiților factori. În primul rând,
efectele condițiilor din extracția asistată cu ultrasunete și compoziția structurală a
materiilor prime
materiale. Extracția compușilor bioactivi prin ultrasunete se realizează prin vibrația
unde ultrasonice, care provoacă accelerarea particulelor și permit trecerea rapidă a
substanței dizolvate din solventul. Acest lucru îi crește difuzivitatea. Unii autori susțin
că extracția asistată cu ultrasunete produce efecte mecanice care modifică structura
peretelui celular și devine mai poros atunci când facilitează extracția

Tabelul 1. Efectul variabilelor procesului de extracție asistată cu ultrasunete asupra conținutului de

alcaloizi totali din coaja, sămânța, columela și pulpa de A. muricata.

1XET: timp de extracție (min). 2XSA: amplitudinea sonicării (%). 3XPC: impulsuri-cicluri. Datele sunt
exprimate ca medie ± SD (n = 3). Aceleași litere mari nu indică diferențe statistice semnificative între
materii prime
(p < 0,05) și aceleași litere mici nu indică diferențe statistice semnificative între tratamente (p < 0,05).

Procedura experimentală SFE: Tabelul 2 arată izotermele randamentului

global (X0) pentru 35 și 45 ◦C. Se verifica ca peste 870 kg/mc cresterea temperaturii
la presiune constantă a determinat o scădere a densității solventului; cu toate
acestea, randamentul global a crescut. Acest lucru indică faptul că efectul
predominant asupra solubilității, în această regiune, este presiunea de vapori. S-au
obținut randamente globale mai mari la 350 bari. Tabelul 3 prezintă OEC-urile la 35
și 45 ◦C, 350 bar, 5% etanol. Ultimele două puncte indică creșterea randamentului
obținut în timpul depresurizarea unității SFE. Curbele potrivite pentru modele ale lui
Crank, Goto et al.[ Extracția uleiului de mentă prin supercritică dioxid de carbon] și
Esquivel et al.[ Modele matematice pentru extracția supercritică a uleiului de coji de
măsline] sunt arătate pentru comparație. Parametrii adaptați diferitelor modele sunt
în Tabelul 2 Curbele de extracție generale au fost mai bine adaptate după modelul
lui Goto în ambele condiții.
 Tabelul 3: Comparație între OEC-urile experimentale
și adaptate pentru procesul SFE la 35 și 45 ◦C, 350
bar folosind 5% (v/v) etanol. Ultimele două puncte la
570 min reprezintă creşterea randamentului obţinut în
timpul depresurizării unitatii SFE.

Tabelul 2: Randament global (X0) izoterme ale

T. catharinensis obținute la 35 ◦C () și 45 °C (),
350 bar folosind 5% (v/v) etanol.

Metoda Soxhlet, extractia cu solvent si noua metoda: Setul de experimente

preliminare au fost efectuate cu sonicarea frunzelor pulverizate de Datura
stramonium in soluție de surfactant de dodecilsulfat de sodiu 0,1% (m/v) la
temperatura camerei pentru a determina cel mai bun timp de extracție. Rezultatele
colectate au arătat că cel mai mare randament a fost atins prin această metodă după
2,5 ore fara o variatie semnificativa. Toate experimentele au fost duplicate și această
dată a fost selectată, ca standard. Următorul experiment a fost făcut pentru a alege
între un anionic (SDS: dodecilsulfat de sodiu, produs Aldrich) și un surfactant neionic
(Emulgen: Polietilenglicoldodecil eter, produs Aldrich) și pentru a determina efectele
concentrației de surfactant asupra extracţie. Rezultatele au arătat că prezența
surfactantului crește cantitatea totală alcaloizi extrași chiar și la concentrație scăzută
(0,01%, m/ v). În plus, nu a fost observată nicio diferență semnificativă între cele
două tipuri de surfactant. Se pare că mai mult alcaloidul total conținut în materialul
vegetal, cu atât este mai mare concentrația de surfactant necesar pentru extragerea
acestuia cu randament ridicat. A fost selectată o concentraţie de 0,2% (m/v) de
surfactant pentru a compara această nouă metodă cu cea clasică. Rezultatele
colectate privind comparația între extracțiile convenționale (soxhlet și extracția cu
solvent la temperatura camerei) și extracția dintre cele trei plante studiate în
prezența surfactantului, a arătat următoarele puncte: În toate cazurile, SDS sau
Emulgen duce la aceleași rezultate; în cazul Datura stramonium, nu există o variație
semnificativă între diferitele metode de extracție; în cazurile Rutei graveolens şi
Hyoscyamus muticus, utilizarea surfactantului are ca rezultat a o extracție mai bună
a alcaloizilor totali.

4. Concluzii

Industria fitofarmaceutică analizează de aproape 30 de ani alcaloizii de

pirolizidină din extractele de plante. Până în prezent, au fost dezvoltate și aplicate
metode analitice sensibile și selective pentru determinarea PA din extractele de
plante. În mod surprinzător, doar câteva grupuri de cercetare și-au dedicat eforturi
pentru dezvoltarea de strategii de extracție inovatoare, mai eficiente. Prin urmare,
până în prezent, de obicei sunt aplicate cele mai simple sau mai ușor stabilite tehnici
pentru instalația respectivă, deși pot fi disponibile metode mai eficiente. Doar patru
din treisprezece plante au fost investigate amănunțit în ceea ce privește condițiile
sau procedurile optime de extracție. S-a acordat și mai puțină atenție faptului că
veridicitatea valorilor raportate în timpul evaluării analitice a conținutului de PA
depinde, fără îndoială, de extragerea cantitativă a PA pentru a evita raportarea unor
niveluri eronate. În rezumat, această lucrare arată că extracția și evaluarea analitică
a PA din extractele de plante are o istorie lungă, dar ar beneficia de strategii în
continuare în evoluție atât privind schemele inovatoare de extracție eficiente, cât și
tehnicile avansate de cuantificare analitică selectivă molecular, care asigură
siguranța substanțelor pe bază de plante și a plantelor extractate.

5. Bibliografie

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6412926/#sec7-molecules-24-
00796title
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4906632/#Sec14title
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7290370/#sec7-toxins-12-00320title
https://repositorio.ufrn.br/bitstream/123456789/32548/1/
ExtractionAndIsolation_PEREIRA_2007.pdf
https://www.scielo.br/j/jbchs/a/YLqB4p6sfPmFFsSw9ywQWnD/?lang=en
Extraction of Alkaloids Using Ultrasound from Pulp and By-Products of Soursop Fruit aparut
pe 16 iulie 2020