Paula Alexandra Postu, Dragos Lucian Gorgan, Oana Cioanca, Manuela Russ, Stefan

Mikkat, Michael Otto Glocker and Lucian Hritcu, Memory-Enhancing Effects of Origanum
majorana Essential Oil in an Alzheimer’s Amyloid beta 1-42 Rat Model: A Molecular and
Behavioral Study, in Antioxidants. Special Issue Oxidative Stress and Inflammation in the
Nervous System Edited by Dr. Soraya L. Valles
Received: 27 August 2020; Accepted: 24 September 2020; Published: 26 September 2020
Antioxidants 2020, 9, 919; doi:10.3390/antiox9100919

Paula Alexandra Postu, Dragos Lucian Gorgan, Oana Cioanca, Manuela Russ, Stefan Mikkat,
Michael Otto Glocker and Lucian Hritcu, Efectele uleiului esențial de Origanum majorana de
îmbunătățire a memoriei în cazul unui model de șobolan cu amiloid beta 1-42 al bolii
Alzheimer: un studiu molecular și comportamental

Aromaterapia este definită ca fiind utilizarea controlată a uleiurilor esențiale concentrate

extrase din plante, flori și alte părți ale plantelor în scopuri terapeutice sau preventive.
Principalele căi de administrare a uleiurilor esențiale sunt administrarea pe cale orală, cutanată
(masaj de aromaterapie) și olfactivă (aromaterapie prin inhalare directă și indirectă). Uleiurile
esențiale sunt cunoscute în principal pentru proprietățile farmacologice, cum ar fi activitatea
antifungică, antivirală, antimicrobiană și antioxidantă. În ultimii ani, mai mulți autori au
evidențiat faptul că aromaterapia poate contribui la ameliorarea durerii, reducerea stresului și
refacerea echilibrului emoțional și, de asemenea, la ameliorarea anxietății și a depresiei.
Origanum majorana L. (Lamiaceae), cunoscută sub numele de măghiran, este o plantă originară
din regiunea mediteraneană și cultivată în multe țări din Asia, Africa de Nord și Europa.
Măghiranul prezintă un parfum puternic și plăcut și este utilizat pe scară largă ca și condiment.
În medicina populară, această plan[tă a fost folosită ca remediu împotriva diferitelor afecțiuni,
precum astmul, indigestia, durerile de cap și reumatismul. Unii autori au raportat proprietățile
antibacteriene și antivirale ale măghiranului, activitățile antioxidante și antiacetilcolinesterazice
(AChE), precum și efectele împotriva tumorilor și metastazelor.
Recent, un grup de cercetători a demonstrat că uleiul esențial de Origanum majorana
(OmEO) a exercitat efecte de tip antidepresiv prin modularea sistemelor noradrenergic,
dopaminergic și serotonergic. Un alt grup de cercetători a arătat că OmEO ameliorează
anxietatea la pacienții cu bruxită și a susținut că acest ulei esențial ar putea reprezenta o
alternativă sigură pentru tratamentul cu benzodiazepine. În plus, O. majorana posedă proprietăți
antiinflamatorii. Un studiu in vitro realizat de Arranz et al. a arătat că OmEO exercită o activitate
antiinflamatorie prin inhibarea secreției de citokine proinflamatorii, cum ar fi factorul de necroză
tumorală alfa (TNF-α), interleukina 1β (IL-1β) și interleukina 6 (IL-6) în macrofagele activate.
Amiloidoza este o afecțiune caracterizată prin depunerea de proteine insolubile în spațiul
extracelular al diferitelor țesuturi. Cele mai frecvente tipuri de amiloidoză sunt legate de
depunerea de amiloid β (Aβ), care este caracteristică afecțiunilor neurologice, cum ar fi
îmbătrânirea, leziunile cerebrale traumatice sau Alzheimmer. Peptida Aβ este un produs de
procesare internă generat prin scindarea proteolitică în serie a proteinei precursoare amiloide
(APP). La om, forma solubilă a acestei peptide este produsă și eliberată în cantități mici în timpul
activității celulare normale și s-a demonstrat că este benefică pentru activitatea sinaptică
cerebrală normală în absența neurotoxicității. Cu toate acestea, concentrațiile de Aβ1-42 în
interval nanomolar par a fi neurotoxice, implicând efecte dăunătoare precum afectarea
transmisiei sinaptice. Mecanismul care stă la baza disfuncțiilor sinaptice mediate de Aβ este încă
neclar, dar poate fi legat de reducerea nivelului proteinei 95 a densității postsinaptice (PSD95) și
de reglarea negativă a receptorilor glutamatergici AMPA și NMDA. Aβ contribuie, de asemenea,
la perturbarea semnalizării factorului neurotrofic derivat din creier, afectând plasticitatea
neuronală și prin urmare procesele de învățare și de memorie. În plus, Aβ mediază generarea de
specii reactive de oxigen care reacționează rapid cu lipidele, proteinele sau acizii
dezoxiribonucleici (ADN) determinând peroxidarea lipidelor, oxidarea proteinelor și a ADN-
ului. În plus, peptida Aβ induce răspunsuri inflamatorii prin activarea celulelor microgliale care
conduc la eliberarea de citokine proinflamatorii, ceea ce poate crește degenerarea neuronală și
pierderea sinapselor neuronale. În acest studiu, a fost utilizat un model de șobolan cu amiloidoză
în încercarea de a demonstra efectele de îmbunătățire a memoriei ale OmEO, care, din cauza
perturbării legate de Aβ1-42, pot fi mai clar de determinat, spre deosebire de studierea unor
animale care nu au fost afectate.

2.Materiale și metode

2.1. Materialul vegetal.

Părțile aeriene înflorite de Origanum majorana L. (Lamiaceae) au fost colectate în luna
august 2019 din culturile verzi din cadrul Unității de Cercetare-Dezvoltare Agricolă Secuieni,
județul Neamț, România. Un exemplar martor a fost autentificat din punct de vedere botanic și
conservat pentru referință rapidă la Departamentul de Farmacognozie, Facultatea de Farmacie,
Universitatea de Medicină și Farmacie "Gr. T. Popa", Iași, România. Uleiul esențial a fost
obținut prin hidrodistilarea timp de 3 h a materialului vegetal proaspăt, folosind un echipament
de tip Clevenger. Sulfatul de sodiu anhidru a fost utilizat pentru a elimina apa din distilat. Acesta
a fost apoi depozitat în flacoane la o temperatură de 4 ◦C, în vederea examinării ulterioare.
Randamentul de extracție a uleiului esențial a fost de 0,34 %.

2.2. Analiza prin cromatografie în fază gazoasă-spectrometrie de masă (GC-MS)

Analiza uleiului esențial a fost efectuată cu ajutorul unui gazcromatograf (Agilent 6890N,
Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) cu detector selectiv de masă 5975 inert XL
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA) și detector de ionizare a flăcării (GC-FID)
echipat cu un detector de 30 m × 0. 25 mm × 0,25 µm coloană de (5%-fenil)-metilpolisiloxan
(HP 5MS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SUA); temperatura injectorului a fost de 250-
280 ◦C; creșterea 4 grade/min; ca fază mobilă s-a utilizat heliu 1mL/min; raportul de divizare
1:100; volumul probei 0,2 µL. Indicii de retenție (RI) au fost calculați în raport cu standardele de
hidrocarburi (C4-C40). Identificarea compușilor esențiali a fost realizată prin compararea
timpilor de retenție (RT), a indicilor de retenție (RI) și a spectrelor de masă cu cele obținute din
bibliotecile Wiley

2.3. Animalele
 Au fost achiziționați 28 de șobolani Wistar masculi adulți de la Institutul Cantacuzino
(București, România), cu o greutate medie de 250 g (±80 g) și o vârstă de 3 luni. Animalele au
fost adăpostite în cuști de polisulfona 1500 U (480 × 325 × 210 mm) (Tecniplast, Buguggiate,
Italia) în condiții standard de laborator (temperatura camerei de 22 ◦C, ciclu de 12 h lumină/12 h
întuneric) cu acces ad libitum la apă și hrană. Toate experimentele pe animale au fost efectuate în
conformitate cu Directiva Consiliului Comunităților Europene (Directiva 2010/63/UE), precum
și cu "Principiile de îngrijire a animalelor de laborator" (publicația NIH nr. 85-23) privind
protecția animalelor utilizate în scopuri științifice și experimentale, cu aprobarea a Comitetului
de etică (nr. 15309/22.07.2019).

2.4. Protocol experimental pentru generarea modelului de șobolan cu Boala Alzheimer (BA)

Șobolanii au fost anesteziați prin injectare intraperitoneală (i.p.) a soluției de

pentobarbital de sodiu (50 mg/kg, greutate corporală, i.p., Sigma Aldrich, Darmstadt, Germania)
și au fost montați într-un dispozitiv stereotaxic.
O soluție de iod (10%, Hach, Loveland, CO, SUA) a fost utilizată pentru a spăla scalpul
animalelor înainte de incizia pe linia mediană, iar apoi a fost practicată o gaură subțire (0,75 mm
diametru) (Parkside Microdrill, Germania) în craniu la 1,5 mm unilateral dreapta de punctul
craniometric bregma. Pentru a induce modelul de șobolan BA așa cum a fost descris anterior,
soluția care conține Aβ1-42 (1 mM, Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania, dizolvată în soluție
salină sterilă 0,9%) a fost incubată la 37 ◦C timp de 4 zile. Ulterior, un volum de 4 µL de soluție
de Aβ1-42 a fost administrat intracerebroventricular (i.c.v.) timp de 4 min (debit 1 µL/min) cu o
microseringă Hamilton la 7,4 mm ventral de suprafața cortexului, în conformitate cu atlasul
stereotaxic. Acul de seringă a fost lăsat în poziție timp de încă 5 min înainte de a fi îndepărtat
încet. Animalele de control (șobolani operați în mod simulat) au primit 4 µL de soluție salină
sterilă 0,9% în locul soluției Aβ1-42. În cele din urmă, inciziile au fost suturate, iar animalele au
primit un antibiotic cu spectru larg (sub formă de pulbere care a fost răspândită de-a lungul
suturii) înainte de a fi returnate în cuștile lor de acasă pentru a se recupera. Postoperator,
animalele au fost adăpostite individual în cuști timp de 3 zile pentru vindecarea inciziei, având
acces liber la apă și hrană.

2.5. Tratamentul medicamentos și designul experimental

Șobolanii au fost împărțiți în 4 grupe (n = 7 animale/grup): grupul de control (operație

simulată) (I), grupul Aβ1-42 (1 mM, Sigma Aldrich, Darmstadt, Germania), administrat singur
(II) și grupurile Aβ1-42 care au primit OmEO prin inhalare (Aβ1-42+ 1%OmEO (III) și Aβ1-
42+ 3%OmEO (IV)). Pachetele statistice bazate pe InVivoStat și R au fost utilizate pentru a
confirma că n = 7 animale pe grup este adecvat. Mai mult, luând în considerare un nivel de
semnificație de 0,05, puterea de a detecta o schimbare relevantă din punct de vedere biologic de
20% față de control este de 93%. Grupurile Simulat și Aβ1-42 au primit soluție de Tween 80 1%
prin inhalare. OmEO a fost diluat cu 1% Tween 80 (v/v). Expunerea la OmEO (200 µL, fie 1%,
fie 3%) s-a făcut prin intermediul unui vaporizator electronic (KBAYBO, China). Șobolanii au
fost tratați prin inhalare cu OmEO (1% și 3%), care a început în ziua 5 post-chirurgie și a durat
până la sfârșitul testelor comportamentale (21 de zile), timp de 15 min în fiecare zi. În ceea ce
privește concentrațiile indicate în testele farmacologice, pentru a crește efectele, s-a folosit 1%
ulei esențial, utilizat în mod obișnuit în aromaterapie, și o concentrație de 3%, așa cum am
afirmat anterior. În ziua 27, toți șobolanii au fost eutanasiați cu supradoze de pentobarbital de
sodiu (150 mg/kg, greutate corporală, i.p., Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania), iar regiunile
creierului au fost excizate la gheață. De la trei șobolani selectați la întâmplare pentru fiecare
grup, hipocampii excizați au fost colectați în soluție ARN Save (Biological Industries, Beit-
Haemek, Israel) și depozitați la -80 ◦C pentru izolarea ulterioară a ARN și analiza qRT-PCR. De
la ceilalți trei șobolani selectați aleatoriu per grup, hipocampiile excizate au fost imediat
depozitați la -20 ◦C pentru evaluări suplimentare ale parametrilor biochimici. De la restul de un
șobolan per grup, hipocampii și cortexurile cerebrale înconjurătoare au fost extirpate și
depozitate imediat la -80 ◦C pentru analiza proteomului.

2.8. Izolarea ARN-ului și PCR cantitativă în timp real (qRT-PCR) la nivelul hipocampului

HipocampiI depozitați în soluție de păstrare a ARN-ului în stare congelată au fost lăsați

să se decongeleze timp de 2 min la temperatura camerei și s-au colectat 45 mg din fiecare
hipocampus. Pentru țesuturile hipocampale colectate, s-a aplicat kitul SV Total RNA Isolation
System (Promega, Madison, WI, SUA) pentru a izola și purifica acidul ribonucleic (ARN) total,
în conformitate cu instrucțiunile producătorului și cu protocolul descris anterior. Pentru
cuantificarea expresiei genelor de interes, s-au efectuat transcrierea inversă și amplificarea prin
PCR cantitativă în timp real (RT-qPCR) cu ajutorul unui sistem GoTaq® 1-Step RT-qPCR
System (Promega, Madison, WI, SUA) pe un PCR în timp real 5 plex HRM Rotor-Gene 6000
(Corbett, CA, SUA). Amestecul de reacție a conținut 10 µL de GoTaq® Probe qPCR Master Mix
(1X) (Promega, Madison, WI, SUA), 0,4 µL de GoScript™ RT Mix for 1-Step RT-qPCR (50×),
2µL de primer înainte, 2µL de primer invers, 4 µL de soluție de ARN și 1,6 µL de apă fără
nuclează.
Pentru cuantificarea absolută a doi transcripți, BDNF și IL1β, s-au utilizat amorse cu următoarele
secvențe: primerul BDNF înainte și invers (F: 5′- ATT ACC TGG ATG CCG CCG CAA AC-3′;
R: 5′ -TGA CCC ACT CGC TAA TAC TGT-3′, dimensiune produsă de 101 bp) (M98820. 1);
amorsă IL1β înainte și inversă (F: 5′ - AGC ACC TTC TTT TTT TCC TTC ATC TT-3′ , R: 5′ -
CAG ACA GCA GGC ATT TT-3′, 144 bp dimensiune produs) (M61178.1). Profilul termic al
reacției a constat din etapa de transcriere inversă-15 min (37 ◦C); inactivare RT/activare Hot-
Start-10 min (95 ◦C); 40 de cicluri de qPCR în 3 etape: 10 s (95 ◦C) -denaturare, 30 s (60 ◦C -
aliniere și colectare de date (canal verde-BRYT Green® și etapa de disociere (de la 60-95 ◦C).
Software-ul de detecție Rotor-Gene Q-Pure v. 2.2.3. (Qiagen, CA, SUA) a fost utilizat pentru
cuantificarea absolută a BDNF și a nivelurilor de expresie a IL1β.

2.9. Experiment pilot de proteomică

2.9.1. Generarea de soluții peptidice pentru analiza proteomului. Trei bucăți de țesut
cerebral congelat conținând hipocampi (între 238 mg și 321 mg) au fost utilizate pentru a
produce extracte proteice brute. Fiecare bucată a provenit de la un singur specimen reprezentant
al grupurile experimentale Aβ (1-42) (II), Aβ (1-42) + 1%OmEO (III) și Aβ (1-42) + 3%OmEO
(IV). Fiecare bucată de țesut cerebral congelat a fost dezghețată timp de 2 minute la temperatura
camerei, cântărită și umezită cu tampon de liză format din 1% deoxicolat de sodiu (SDC), 20
mM ditiotreitol (DTT) în 50 mM bicarbonat de amoniu (ABC) și cocktail de inhibitori de
protează CompleteTM (Roche, Mannheim, Germania). Volumul adăugat de tampon de liză (în
µL) în raport cu greutatea țesutului cerebral (în mg) a fost în raportul 9:1, așa cum este descris.
Bucățile de țesut cerebral și amestecurile de tampon de liză au fost transferate într-un
omogenizator dounce (Kontes Glass Co, Vineland, NJ, SUA), iar țesuturile au fost dezintegrate
în 10 treceri. Pentru a finaliza omogenizarea, suspensiile au fost transferate în noi tuburi Falcon
de 15 ml, încălzite la 95 ◦C timp de 5 min într-o baie de apă, urmate de o dublă ultra-sonicare
(Sonorex Super RK 31H, BANDELIN, Berlin, Germania), fiecare timp de 15 s, întreruptă timp
de 2 min. Apoi, în fiecare suspensie s-a adăugat 50 mM ABC în același volum ca și volumul
tamponului de liză respectiv, pentru a se ajunge la o concentrație finală de 0,5% SDC. Apoi,
extractele au fost agitate timp de 10 min la temperatura camerei și centrifugate la 16.000× g timp
de 10 min la 20 ◦C. După centrifugare, supernatantele (extracte proteice brute; volumele au fost
cuprinse între 4 ml și 6 ml) au fost alipite în porții de 0,5 ml și transferate în noi tuburi
Eppendorf de 1,5 ml. Pentru determinarea concentrației de proteine, s-a utilizat testul Bradford,
așa cum a fost descris, datorită compatibilității sale cu agenții reducători, cum ar fi DTT.
Preluând alicote din extractele de proteine brute (300 µL până la 400 µL), proteinele reduse (1
mg, fiecare) au fost alchilate la temperatura camerei, la întuneric, timp de 20 min, prin adăugarea
a 9 µL până la 12 µL de soluție de iodoacetamidă 0,5 M, dizolvată în 50 mM ABC. Digestia
proteinelor reduse și alchilate a fost apoi efectuată peste noapte la 37 ◦C prin adăugarea a 100 µL
de soluție de tripsină (Promega, Madison, WI, SUA; dizolvată în 50 mM ABC) cu un raport
enzimă/substrat de 1:100 (g/g). După digestie, amestecurile de peptide au fost centrifugate,
supernatanții (300 µL până la 400 µL) au fost colectați în tuburi Eppendorf separate de 2 mL, iar
eliminarea SDC asistată de transfer de fază a fost efectuată așa cum a fost descrisă anterior. S-a
adăugat acetat de etil (în același volum ca și volumul amestecului peptidic respectiv) și acid
trifluoroacetic 25% (1/50 din volumul de acetat de etil respectiv). Amestecurile de peptide au
fost agitate riguros timp de 2 min și ulterior au fost centrifugate la 12.000× g timp de 10 min
pentru a obține fazele apoasă și organică. Faza apoasă a fiecărui amestec peptidic a fost colectată
cu ajutorul unui vârf de încărcare a gelului și redusă în volum până la un volum final de
aproximativ 100 µL, fiecare folosind un evaporator centrifugal (Speedvac RVC 2-25 CD plus,
Martin Christ GmbH, Osterode am Harz, Germania). Concentrațiile de peptide au fost măsurate
cu ajutorul testului Qubit, așa cum este descris, urmat de desalinizare cu cartușe OASIS.
Concentrațiile de peptide din soluțiile de peptide desalinizate au fost măsurate cu ajutorul testului
Qubit.

2.9.2. Analiza proteomului prin spectrometrie de masă

Analiza spectrometrică de masă a amestecurilor de peptide a fost efectuată în dublu

exemplar pe un spectrometru de masă Synapt G2S (Waters, Manchester, UK) utilizând Masslynx
versiunea 4.1, cuplat la un sistem UPLC nanoAcquity (Waters, Manchester, UK) prin
intermediul unei surse de ioni NanoLockSpray cu ajutorul unui emițător PicoTip (New
Objective, Woburn, MA, SUA), așa cum a fost descris. Faza mobilă A conținea 0,1 % acid
formic în apă, iar faza mobilă B conținea 0,1 % acid formic în acetonitril. Soluțiile de peptide
care conțineau aproximativ 70 ng de peptide au fost suplimentate cu 40 fmol de standard Hi3
ClpB_ECOLI (Waters, Manchester, Regatul Unit) pentru cuantificare absolută. Peptidele au fost
captate și desalinizate cu ajutorul unei precolone (nanoACQUITY UPLC Symmetry C18, 5 µm,
180 µm × 20 mm) (Waters, Manchester, Regatul Unit) la un debit de 10 µL/min timp de 4 min
cu 99,9 % A. Peptidele au fost separate pe o coloană analitică (ACQUITY UPLC HSS T3, 1,8
µm, 75 µm × 200 mm) (Waters, Manchester, Regatul Unit) la un debit de 300 nL/min folosind
un gradient de la 3 % la 35 % B pe parcursul a 120 min. Ca și compus de referință, 100 fmol/µL
[Glu1]-fibrinopeptidă B a fost administrat la 500 nL/min în pulverizatorul de referință al sursei
NanoLockSpray. Instrumentul SYNAPT G2S a fost operat într-un mod independent de date,
caracterizat prin fragmentarea paralelă a mai multor ioni precursori în combinație cu separarea
mobilității ionice ca dimensiune suplimentară de separare (denumită HDMSE). Prin executarea
de scanări alternative la energie de coliziune (CE) scăzută și ridicată de fiecare 0,5 s, au fost
dobândite informații despre ionii precursori și, respectiv, despre ionii de fragment. În modul MS
cu energie scăzută, achizițiile au fost efectuate la o CE constantă de 4 eV, în timp ce în modul
MS cu energie ridicată s-au aplicat setări CE dependente de timpul de derivă. Valorile setărilor
CE dependente de timpul de derivă au fost utilizate conform descrierii. Spray-ul de blocare a fost
achiziționat o dată la fiecare 30 s pentru o perioadă de 1 s. Datele spectrometrice de masă au fost
stocate ca fișiere de date brute.

2.9.3. Construirea bazei de date și analiza datelor privind proteomul

Pentru căutarea în baza de date, a fost utilizată o bază de date care conține 29 944 de
secvențe de proteine din proteomul Rattus norvegicus (http://www.uniprot.org/; UniProt release
2020_06), la care s-au adăugat secvențele ClpB_ECOLI (P63284) și tripsina porcină. Prelucrarea
fișierelor de date brute de spectrometrie de masă, identificarea proteinelor și cuantificarea fără
etichetă a proteinelor identificate au fost efectuate cu ajutorul pachetului software Progenesis QI
for Proteomics, versiunea 4.1 (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, Regatul Unit), așa
cum a fost descris anterior. Au fost setați următorii parametri de căutare: tripsină ca reactiv de
digestie, au fost permise două situsuri de clivaj lipsă, carbamidometilarea cisteinelor ca
modificare fixă și oxidarea reziduurilor de metionină ca modificare variabilă. Rata de
descoperire falsă a fost stabilită la 1 %. Pentru identificarea peptidelor au fost necesari cel puțin
trei ioni de fragment și pentru identificarea proteinelor au fost necesari cel puțin șase ioni de
fragment corespunzând la cel puțin două peptide. Mai mult, pentru identificările peptidelor, au
fost acceptate doar peptidele cu două, trei și patru sarcini pozitive, dacă au fost identificate în cel
puțin două dintre cele șase serii de măsurători. În plus, au fost excluse peptidele cu un scor
peptidic sub 5,7, cu o eroare de masă absolută de peste 13 ppm și cu o lungime mai mică de 6
reziduuri de aminoacizi. Datele proteomice de spectrometrie de masă au fost depuse la
ProteomeXchange Consortium prin intermediul depozitului partenerului PRIDE cu
identificatorul setului de date PXD021082.

2.10. Analiza comportamentală

2.10.1. Labirintul în Y
 Comportamentul de alternanță spontană și integritatea hipocampusului au fost evaluate
printr-o singură sesiune în labirintul în Y, așa cum a fost descrisă anterior. Labirintul în Y utilizat
în studiul de față a fost construit din plexiglas cu următoarele dimensiuni: 25 cm înălțime, 35 cm
lungime, 10 cm lățime a fiecărui braț și o zonă centrală triunghiulară echilaterală. Paisprezece
zile după operație (Figura 1) și 15 min de la sesiunea de inhalare a OmEO (1% și 3%), fiecare
animal a fost plasat la capătul unui braț și i s-a permis să exploreze labirintul timp de 8 min.
Intrarea succesivă în fiecare braț a fost interpretată ca alternanță comportamentală. Un observator
a înregistrat secvența de brațe vizitate corespunzătoare fiecărui animal. Procentul de alternanță
spontană a fost calculat ca fiind (numărul de alternanțe/total de intrări - 2) × 100. Între încercări,
labirintul a fost spălat cu o soluție de etanol 10%.

2.10.2. Labirintul cu brațe radiale

Performanța memoriei spațiale a fost evaluată prin labirintul cu brațe radiale (RAM), așa
cum a fost descris anterior. Înainte de începerea testului, animalele au fost supuse unui regim de
scădere în greutate, până când greutatea corporală a animalelor a reprezentat 85% din greutatea
inițială. Restricția alimentară reprezintă un factor esențial pentru o alegere eficientă a brațului în
cadrul RAM și s-a demonstrat că șobolanii lipsiți de hrană au efectuat RAM mai eficient decât
șobolanii cu hrană nerestricționată. În ciuda accesului restrictiv la hrană, animalele au avut acces
liber la apă. Labirintul care cuprindea opt brațe marcate de la 1 la 8 (48 cm × 12 cm), cu o
extensie radială de 32 cm în diametru din zona centrală, avea 50 mg de peleți de hrană la capătul
brațelor 1, 2, 4, 5 și 7. RAM a început în ziua 16 și a fost efectuată în două etape: o etapă de
antrenament (4 zile consecutive) care a avut ca scop obișnuirea și o etapă de testare (7 zile
succesive). Fiecare sesiune de antrenament a durat 5 minute, fiind testate grupuri de 3 sau 4
animale. Deși în zilele de antrenament, momelile alimentare au fost răspândite pe tot labirintul,
în zilele de testare, doar 5 brațe conțineau momeli plasate la capătul fiecărui braț. Pentru a
efectua testul, fiecare animal a fost poziționat central în labirint, permițându-i să exploreze
labirintul și să consume momelile din cele 5 brațe. Evaluarea comportamentală a fost finalizată
atunci când animalul a consumat toate cele 5 momeli sau după 5 minute. S-a considerat că un
animal a intrat într-un braț atunci când toți cei patru membri ai săi se aflau în acel braț. Pentru
sarcinile de memorie de lucru și de memorie de referință, fiecare șobolan a fost plasat individual
în centrul labirintului la 15 min după ce a inhalat OmEO (1% și 3%). Determinările au fost
efectuate prin (i) evaluarea numărului de erori de memorie de lucru (intrarea într-un braț care
conține pelete de alimente, în care s-a intrat anterior) și (ii) calcularea numărului de erori de
memorie de referință (intrarea animalului într-un braț fără pelete de alimente). Memoria de lucru
spațială reprezintă capacitatea de a reține pentru o perioadă de timp informații specifice unui
proces, astfel încât răspunsurile spațiale să poată fi efectuate în mod flexibil de la un proces la
altul. Acest tip de memorie stă la baza comportamentului alimentar; astfel, subiectul care își
amintește brațul tocmai vizitat poate adopta o strategie de căutare eficientă. Memoria de referință
spațială este reprezentată de capacitatea de a învăța un răspuns consistent și fix la un stimul
spațial, fiind reflectată de o asociere constantă între locația spațială respectivă și un rezultat.
Astfel, animalul va trebui să învețe poziția celor trei brațe care nu sunt întărite cu momeli,
acestea rămânând constante. Între încercări, labirintul cu brațe radiale a fost spălat cu o soluție de
etanol 10%.
2.11. Analiza statistică
Toate datele sunt exprimate ca medie ± eroarea standard a mediei (S.E.M.). GraphPad
Prism 8.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, SUA) a fost utilizat pentru a efectua analize
statistice prin intermediul unei analize variate (ANOVA) cu o singură cale, urmată de testul de
comparație multiplă post-hoc Tukey, considerând tratamentul ca factor. O valoare p de < 0,05 a
fost considerată semnificativă. Pentru analiza proteinelor, au fost utilizate metodele de calcul
Origin Pro 2016 (Originlab Co, MA, SUA) și Excel.

3. Rezultate și discuții
3.1. Profilul fitochimic al uleiului esențial de Origanum Majorana
Cu ajutorul GC-FID și GC-MS, au fost identificați 37 de compuși chimici în OmEO
proaspăt preparat (în total, aproximativ 94,34% din substanțele volatile). Constituenții chimici
identificați au inclus monoterpene (90,42%), în timp ce sesquiterpenele (7,92%) au fost
componente minore. Analiza OmEO a arătat că terpinen-4-ol (23,52%), sabinen (12,59%),
terpinolen (8,72%), linalol (5,94%), β-thujene (4,60%), phellandrene (4,35%) și α-terpineol
(4,30%) sunt cei mai abundenți compuși volatili. Pe baza acestor constatări, uleiul nostru esențial
prezintă o compoziție chimică egală cu cele documentate de alți autori.

3.2. Analiza proteomului din creierul de șobolan care conține hipocampi

Pentru acest proiect, a fost urmată o abordare de cercetare bazată pe date, utilizând
proteomica pentru a genera o imagine de ansamblu cu privire la potențialele efecte moleculare
ale terapiei OmEO, în locul unei abordări de cercetare bazată exclusiv pe teorie sau pe ipoteze.
Inițial, au fost identificate 1224 de proteine în țesutul cerebral de șobolan care conține
hipocampi, care au fost clasificate în funcție de abundența lor relativă în grupul Aβ1-42 (II).
Apoi, au fost suprapuse profilele de abundență ale Aβ1-42 și 1%OmEO (III) și Aβ1-42 și
3%OmEO (IV) pentru a vizualiza diferențele de abundență. Diferențele de abundență au fost
clasificate prin linia de prag 2× și, respectiv, linia de prag 3×. Cele mai abundente 25 de proteine
și cele mai puțin abundente 25 de proteine au fost excluse din comparațiile de abundență.
Este tentant să considerăm proteinele aflate deasupra și sub liniile de prag 2× și 3× ca
fiind de interes potențial. Cu toate acestea, având în vedere numărul redus de animale per grup,
diferențele de abundență ale acestor proteine particulare nu ar trebui să fie supraevaluate,
deoarece nu se poate atinge semnificația statistică. În schimb, proteinele enumerate în total
păreau să indice căile/procesele biologice respective de interes, care au fost apoi testate pentru
rolurile lor potențiale în ceea ce privește efectele legate de OmEO prin aplicarea unor teste
funcționale bine stabilite.
Dintre cele 17 proteine a căror expresie părea influențată de administrarea de OmEO, 10
au fost considerate ca fiind reprezentante ale unor procese biologice, cum ar fi funcția cognitivă,
apoptoza, neuroinflamarea și, respectiv, stresul oxidativ. Aceste funcții biologice au fost vizate în
continuare, utilizând unul după altul teste biochimice/moleculare bine stabilite. Proteina cu
numărul de acces Q5XIU9 este implicată în dezvoltarea țesutului adipos și, deși extractul de
Origanum majorana s-a dovedit a fi eficient în modularea acumulării de lipide în ficat și rinichi,
nu am evaluat în continuare funcția acestei proteine, deoarece procesul biologic în care este
implicată nu a fost obiectivul acestui studiu. Celelalte șase proteine (Q08163, M0RBL8, P31232,
P84083, Q5M821 și P01835) au fost atribuite de Funrich unor procese biologice, cum ar fi
consumul de energie sau motilitatea celulară. Deși indicau o activitate celulară în general, de
exemplu, asociată cu procesele de vindecare și regenerare celulară, aceste funcții nu au fost
investigate în continuare.

3.3. Activități diferențiate ale proceselor biologice determinate prin teste funcționale
3.3.1. Neuroinflamarea
Deoarece factorul nuclear kappa-B (NF-κB) reglează transcrierea unei cohorte de gene
implicate în răspunsurile imune și inflamatorii și activarea sa implică trei căi de semnalizare
majore: (i)calea canonică, declanșată de TNFα sau IL-1; (ii) calea necanonică, declanșată de
ligandul CD40 sau de limfotoxina β; și (iii) căile de semnalizare atipice, inițiate de deteriorarea
ADN-ului, rolul său în procesele neuroinflamatorii a fost de interes. IL-1β este un mediator
crucial al răspunsurilor inflamatorii, iar cuantificarea sa prin RT-qPCR a fost considerată ca fiind
metoda de alegere. S-a constatat că numărul de copii ale ARNm IL-1β, care sunt legate de
procesele inflamatorii, a fost semnificativ supraexprimat în grupul pretratat cu Aβ1-42 (II) față
de grupul operat cu șampon (I) (p = 0,0032). Cu toate acestea, OmEO inhalat a atenuat doar
puțin răspunsul inflamator observat la șobolanii pretratați cu Aβ1-42, modificările minore induse
de ambele concentrații de OmEO fiind statistic nesemnificative (p = 0,1107 pentru 1%OmEO
(III) și, respectiv, p = 0,0635 pentru 3%OmEO (IV)).
Supraexprimarea IL-1β ca răspuns la stimuli neurotoxici induși experimental este bine
documentată; astfel, expresia crescută a IL-1β indusă de Aβ1-42 este în general în acord cu
rezultatele anterioare. În plus, proprietățile antiinflamatorii ale OmEO au fost deja menționate în
literatura de specialitate și susținute de studii in vitro. Cu toate acestea, studiul nostru in vivo a
constatat că potențialul OmEO de a reduce inflamația este îndoielnic, deoarece nu a fost atinsă
semnificația statistică.

3.3.2. Apoptoză
NF-κB este în general considerat ca fiind anti-apoptotic. Cu toate acestea, în anumite
contexte, NF-κB poate la fel de bine să acționeze ca promotor al apoptozei, în special ca răspuns
la stresul celular. Pentru a testa dacă apoptoza a fost un proces biologic cu semnificație pentru
efectele legate de tratamentul cu OmEO, apoptoza a fost investigată cu ajutorul unui test ELISA
de detectare a morții celulare specifice, așa cum a fost demonstrat anterior.
Fragmentarea ADN-ului, asociată proceselor apoptotice, a fost găsită semnificativ
crescută în grupul pretratat cu Aβ1-42 (II) față de grupul cu operație simulată (I) (p = 0,0008)
(Figura 4). Cu toate acestea, inhalarea OmEO a determinat doar reduceri moderate ale
fragmentării ADN-ului (p = 0,0634 pentru 1%OmEO (III). Deteriorarea ADN-ului cerebral apare
în mod natural în timpul îmbătrânirii și se agravează în diferite patologii, cum ar fi boala
Alzheimer. După cum s-a arătat în acest studiu, Aβ1-42 administrat la șobolani a determinat o
fragmentare crescută a ADN-ului, ceea ce indică o apoptoză crescută. Cu toate acestea, căile
specifice de semnalizare intracelulară prin care Aβ declanșează procesele apoptotice sunt slab
definite, chiar dacă au fost deja propuse mai multe căi. Din rezultatele noastre, deducem că
OmEO a ameliorat doar într-o anumită măsură fragmentarea ADN-ului. Prin urmare,
proprietățile antiapoptotice ale OmEO nu pot fi afirmate cu semnificație statistică. Prin urmare,
am investigat în continuare eficiența OmEO în contracararea altor procese biologice, cum ar fi
stresul oxidativ, precum și funcția cognitivă.

3.3.3. Stresul oxidativ

Pentru a testa răspunsurile la stresul oxidativ, s-a urmărit evaluarea peroxidării lipidelor
și a carbonilării proteinelor. MDA, un produs secundar al peroxidării lipidelor, este implicat în
mai multe procese celulare și poate promova reticulația intramoleculară sau intermoleculară a
proteinelor/ADN, inducând astfel modificări profunde ale proprietăților biochimice ale unei
varietăți de biomolecule. Carbonificarea proteinelor, o deteriorare oxidativă ireversibilă, duce cel
mai adesea la pierderea funcției proteice, dar poate duce și la câștigarea funcției. În ambele
cazuri, chiar și mici modificări ale carbonilării pot determina modificări semnificative ale
funcției celulare, afectând căile majore de semnalizare.
Șobolanii pretratați cu Aβ1-42 (II) au prezentat un nivel semnificativ mai mare de MDA
și de carbonilii proteice (p = 0,0110 și p = 0,0283) (Figura 5A,B) în comparație cu șobolanii cu
operație simulată (I), dezvăluind potențialul administrării unice de Aβ1-42 de a induce stresul
oxidativ în întregul organ. În continuare, s-a observat că OmEO inhalat s-a dovedit a fi foarte
eficient în contracararea stresului oxidativ indus, reducând semnificativ nivelurile de MDA la
șobolanii pretratați cu Aβ1-42 (p = 0,0023 pentru 1%OmEO și, respectiv, p = 0,0015 pentru
3%OmEO). Eficiența OmEO în reducerea stresului oxidativ a fost susținută de rezultatele
obținute în urma analizei conținutului de carbonil al proteinelor, unde doar 1%OmEO (III) a
redus semnificativ procesul de carbonilare a proteinelor în creierul șobolanilor pretratați cu Aβ1-
42 (II) (p = 0,0224).
Rezultatele noastre sunt în concordanță cu cele din literatura de specialitate, unde diferite
linii de dovezi sugerează că Aβ acționează ca un prooxidant, provocând niveluri ridicate atât de
MDA, cât și de carbonilii proteici.
Studii anterioare au relevat proprietățile de reducere a stresului oxidativ ale OmEO in
vitro sau în contextul nefrotoxicității, care a fost indusă de diferiți agenți. De remarcat, acest
studiu in vivo este primul care demonstrează potențialul OmEO de a contracara stresul oxidativ
în creierul de șobolan (hipocampus), care a fost indus prin administrarea unui agent neurotoxic
agent neurotoxic: Aβ1-42.

3.3.4. Funcția cognitivă

RT-qPCR a fost utilizată pentru a analiza expresia BDNF, iar această neurotrofină
cerebrală larg răspândită a fost selectată pentru a fi analizată datorită implicării sale în rolurile de
reglementare critice ale căilor de semnalizare, care sunt implicate în procesele care determină
funcția cognitivă, cum ar fi procesele de dezvoltare, neuroprotecția și plasticitatea sinaptică,
inclusiv interacțiunile sinaptice de scurtă și lungă durată implicate în mecanismul memoriei și
cogniției. La investigarea reacțiilor specifice creierului la aromaterapie pe bază de OmEO, s-a
determinat un număr semnificativ mai mic de copii de ARNm BDNF la șobolanii pretratați cu
Aβ1-42 (II) în comparație cu șobolanii operați simulat (I) (p < 0,0001). În plus, s-a observat că
OmEO a atenuat leziunile induse de administrarea de Aβ1-42, după cum reiese din creșterea
semnificativă a expresiei BDNF care a fost detectată la șobolanii pretratați cu Aβ1-42 care au
inhalat concentrația de 1% din uleiul esențial (III) (p = 0,0023). Cu toate acestea, concentrația de
3 % a OMEO (IV) s-a dovedit a fi ceva mai puțin eficientă în contracararea efectelor nocive ale
Aβ1-42 (p = 0,08351) Impactul peptidei Aβ asupra expresiei BDNF a fost investigat anterior de
noi și de alții și, așa cum s-a arătat și în acest studiu, s-a constatat că expresia BDNF a fost
afectată în urma administrării intracerebroventriculare a Aβ1-42. Mai important, acest studiu
oferă dovezi directe ale efectului benefic al inhalării OmEO în ceea ce privește expresia BDNF
într-un model de șobolan cu BA.
În special, efectele pozitive ale OmEO asupra proceselor asociate funcției cognitive au
încurajat testele comportamentale cu animale care au primit aromaterapie după administrarea de
Aβ1-42.

3.4. Teste comportamentale

Sarcina labirintul în Y a fost utilizată pentru a evalua performanța memoriei pe termen
scurt a șobolanilor care au primit diferite tratamente, ANOVA univariată arătând efecte
semnificative ale acestora asupra comportamentului de alternanță spontană (F(3, 16) = 8.27, p =
0.0048). Administrarea intracerebroventriculară unică de Aβ1-42 (II) a provocat o scădere
semnificativă a comportamentului de alternanță spontană în comparație cu grupul de control
operat cu șampon (I) (p < 0,001). Cu toate acestea, inhalarea OmEO în ambele concentrații a
îmbunătățit performanța șobolanilor pretratați cu Aβ1-42 în testul labirintului Y, fiind observate
îmbunătățiri semnificative ale comportamentului de alternanță spontană pentru șobolanii
pretratați cu Aβ1-42 care au inhalat 1%OmEO (III) (p = 0,0018), dar nu și pentru cei care au
inhalat 3%OmEO (IV) (p = 0,0950). Modificările comportamentului de alternanță spontană nu
pot fi atribuite activității locomotorii, așa cum reiese din numărul de intrări în brațe în cadrul
sarcinii Y-maze.
În sarcina labirintului cu braț radial, analiza ANOVA bivariată a relevat schimbări majore
între grupuri atât pentru performanța memoriei de lucru (F(18, 112) = 43.98, p <0.0001), cât și
pentru performanța memoriei de referință (F(18, 112) = 9.29, p <0.0001). În comparație cu
grupul de control (I), evaluarea animalelor pretratate cu Aβ1-42 (II) a fost caracterizată de
creșteri semnificative în ceea ce privește numărul de erori de memorie de lucru (p < 0.0001),
precum și numărul de erori de memorie de referință (p < 0.0001), dovedind că administrarea
unică de Aβ1-42 a afectat memoria spațială. OmEO inhalat în ambele concentrații (III și IV) a
determinat o reducere semnificativă a erorilor de memorie de lucru la animalele pretratate cu
Aβ1-42 (p < 0,0001). Pe de altă parte, achiziția memoriei de referință a fost îmbunătățită numai
la animalele pretratate cu Aβ1-42 care au inhalat 1%OmEO (III) (p = 0,0142). Inhalarea de
3%OmEO (IV) nu a îmbunătățit performanța memoriei de referință la animalele pretratate cu
Aβ1-42 (p = 0,9717).
Aceste rezultate ale testelor comportamentale sunt în concordanță cu rapoartele
anterioare, care au demonstrat potențialele efecte anti-BA ale plantelor Lamiaceae selectate. În
ansamblu, studiul nostru oferă dovezi că OmEO ameliorează perturbațiile induse de Aβ, cum ar
fi deficitele de memorie, și oferă informații despre mecanismele celulare și moleculare implicate
în efectele protectoare ale acestui ulei esențial împotriva tulburărilor induse de Aβ - disfuncții
cognitive.
4. Concluzii
În acest studiu, am confirmat pentru prima dată compoziția chimică a OmEO, care a fost
aplicat pentru analiza proteomului șobolanilor model de BA, în căutarea diferențelor care ar
putea apărea la nivel molecular. Prin această abordare, patru procese biologice -
neuroinflamarea, apoptoza, stresul oxidativ și funcțiile cognitive modulate de neurotrofine - au
fost aduse în atenție ca fiind posibil să afecteze performanța creierului de șobolan (hipocamp) ca
o consecință probabilă a administrării OmEO.
Faptul dacă procesele biologice sugerate au fost sau nu semnificative a fost validat prin
testarea țintelor de potrivire, care sunt reprezentante acceptate ale proceselor biologice de interes.
În acest studiu, am constatat că OmEO promovează funcțiile cognitive și reduce stresul oxidativ
cerebral la șobolanii tratați cu Aβ1-42. În cele din urmă, am corelat rezultatele celulare și
moleculare cu datele comportamentale, dovedind că OmEOO îmbunătățește funcția de memorie
la șobolanii tratați cu Aβ1-42.