Efectele ghee-ului de vacă ( unt clarificat ) și uleiului de soia

asupra enzimelor care metabolizează cancerigen la șobolani

Context și obiective:

Studiul nostru anterior a arătat că ghee-ul de vacă în comparație cu uleiul de soia a avut
un efect protector împotriva cancerului mamar indus de cancerigen la șobolani.
Obiectivul acestui studiu a fost elucidarea mecanismului biochimic al acestuia.

Metode:

Două grupuri de șobolani în vârstă de 21 de zile (20 fiecare) au fost hrăniți pentru o dietă
de 44 săptămâni care conținea ghee de vacă sau ulei de soia (10%). Cinci animale din
fiecare grup au fost sacrificate la 0 zi și la 5, 21 și 44 săptămâni pentru analiza enzimelor
căilor de fază I și faza II ale metabolismului carcinogen.

Rezultate:

Ghee-ul de vacă alimentar în comparație cu uleiul de soia a scăzut activitățile enzimelor

citocromului P450 (CYP), CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 și CYP2B1, responsabile de
activarea cancerigenului în ficat. Activitățile de detoxifiere cancerigenă ale uridindifosfo-
glucuronozil transferazei (UDPGT) și chinona reductazei (QR) în ficat și γ-
glutamiltranspeptidază (GGTP) și QR în țesutul mamar au fost semnificativ mai mari la
șobolanii hrăniți cu ghee de vacă decât la șobolanii hrăniți cu ulei de soia. Activitatea
hepatică a GGTP a scăzut în dieta cu ulei de soia; în timp ce în grupul de ghee de vaci a
rămas neafectat.

Interpretare și concluzii:

Descoperirile noastre arată că gheeul de vacă alimentar , în comparație cu uleiul de soia,

reglează în jos activitățile enzimatice responsabile de activarea carcinogenului în ficat și
reglează activitățile de detoxifiere a carcinogenului în ficat și țesuturile mamare.

Cuvinte cheie: enzime de detoxifiere cancerigene, ghee de vacă , enzime citocrom P450,
ulei de soia

Modularea cancerului de către variabile nutriționale a fost un subiect de interes și

controversă. Grăsimea alimentară a primit o atenție considerabilă ca posibil factor de risc
în etiologia cancerului de sân și de colon. Al doilea raport al Fondului Mondial de
Cercetare a Cancerului și al Institutului American de Cercetare a Cancerului indică faptul
că alimentele și nutriția pot afecta starea hormonilor care pot modifica riscul de cancer de
sân 1 . Atât cantitatea, cât și calitatea grăsimilor din dietă influențează dezvoltarea
neoplasmului spontan și indus chimic la animalele de laborator 2 , 3 . Studiile noastre
anterioare au arătat că ghee-ul de vacă (ulei de unt clarificat), în comparație cu uleiul de
soia, a avut un efect protector împotriva cancerului mamar indus de cancerigen.4 , iar
expresiile scăzute ale ciclinelor A și D1, Bcl-2 și PKC-α mediază mecanismul efectului
protector al ghee-ului de vacă 5. Carcinogeneza este un proces complex și prelungit în
mai multe etape care poate fi inițiat din cauza deteriorării macromoleculei celulare de
către un agent endogen sau exogen. Este în general acceptat că cancerul este indus de
anumiți agenți chimici care există în natură ca pro-carcinogeni inactivi, al căror
metabolism implică două etape. În prima etapă, agenții cancerigeni sunt metabolizați în
molecule reactive de către enzimele de fază I. Reacțiile majore din faza I sunt
hidroxilarea sau formarea epoxidului catalizată de clasa de enzime hepatice denumite
citocrom P450s (CYP). În faza II, moleculele active sunt detoxificate atât în ficat, cât și
în țesutul țintă prin conjugarea lor cu glutation, acid glucuronic, sulfat, acetat sau anumiți
aminoacizi de către enzime precum glutation-S-transferaza, chinin reductaza, y-
glutamiltranspeptidaza sau UDP-glucuronozil transferaza. Strategiile pentru protejarea
celulelor de aceste evenimente inițiale includ scăderea enzimelor metabolice responsabile
de generarea speciilor reactive prin enzimele de fază I și creșterea activităților enzimelor
de fază II care dezactivează radicalii liberi și electrofilii.

Majoritatea enzimelor care metabolizează substanțele cancerigene sunt legate de

membrană și necesită o membrană lipidică pentru activitatea lor. Prin urmare,
metabolismul oxidativ al agenților cancerigeni din reticulul endoplasmatic hepatic
depinde în mod semnificativ de compoziția lipidelor alimentare 6 , 7 .. Cantitatea și
calitatea grăsimilor alimentare afectează compoziția lipidelor și caracteristicile fizice ale
membranelor biologice și activitatea enzimatică a mai multor componente ale sistemului
enzimatic de metabolizare a medicamentelor. Aceste modificări ale activităților
enzimelor au fost asociate cu modificări ale mutagenității și carcinogenității pro-
carcinogenilor. Ținând cont de acest lucru și de raportul nostru anterior privind efectele
diferențiale ale grăsimii din lapte și uleiului de soia asupra carcinogenezei induse
chimice, studiul de față a fost conceput pentru a compara efectul acestor două
grăsimi/uleiuri asupra diferitelor enzime de metabolizare a carcinogenului de fază I și II
în ficatul de șobolan. și țesutul mamar.

Mergi la:

Material și metode
Substanțe chimice : benzoxiresorufină, etoxiresorufină, metoxiresorufină,
pentoxiresorufină, sare de sodiu de resorufină, dicumarol, acid uridindifosfoglucuronic
(UDPGA), γ-glutamil-p-nitroanilid, glicilglicină și clorură de calciu au fost procurate din
MO (S.U.A.). Toate celelalte substanțe chimice utilizate în acest studiu au fost de calitate
analitică și achiziționate de la furnizori locali.

Animale și diete : Femele de șobolani Wistar (21 de zile) obținute de la Small Animal
House a Institutului Național de Cercetare a Produselor de Lactate (NDRI), Karnal,
Haryana, au fost găzduite în cuști metalice într-o cameră bine ventilată și au primit apă și
dietă ad libitum . Studiul a fost realizat în Divizia de Biochimie Animală, NDRI, Karnal.
Comitetul de Etică Animală al Institutului a aprobat toate protocoalele. Dieta
experimentală a cuprins năut, 56,4 la sută; grâu, 15 la sută; prăjitură cu arahide, 10 la
sută; ghee de vacăsau ulei de soia, 10 la sută; lapte praf degresat, 6 la sută; amestec
mineral, 2,16 la sută; amestec de vitamine, 0,2 la sută și clorură de colină, 0,2 la sută.
Compoziția amestecurilor de minerale și vitamine a fost concepută astfel încât să
furnizeze acești nutrienți (inclusiv cei derivati din ingredientele furajere de mai sus) în
dietele în conformitate cu AIN-93 8 . În total, au fost incluși 35 de șobolani, dintre care
cinci au fost sacrificați pentru a înregistra observații de 0 zile. Animalele rămase au fost
tabulate în funcție de greutatea lor corporală și împărțite aleatoriu în două grupuri de câte
15 fiecare cu greutatea corporală medie de 22 g și au fost hrănite cu ghee de vacă.și,
respectiv, dieta cu ulei de soia. Cinci animale din fiecare grup au fost sacrificate la 5, 21
și 44 săptămâni prin dislocare cervicală, iar țesuturile hepatice și mamare au fost
colectate pentru analiza enzimatică. Greutățile corporale au fost înregistrate la două
săptămâni. Enzimele de faza I de activare a carcinogenului au fost determinate la 0 zi și
la 5 și 44 săptămâni. Activitățile de faza II de detoxifiere a carcinogenului au fost
determinate la 0 zi și la 5, 21 și 44 săptămâni.

Prepararea microzomilor hepatici : Ficatul excizat imediat după sacrificare a fost spălat
cu 0,9% NaCl, iar microzomii au fost preparați prin centrifugare diferențială 9 . O
porțiune de ficat a fost omogenizată în volum de 3 greutate de zaharoză 0,25 M rece cu
gheață în tampon fosfat de potasiu 0,01 M ( p H 7,5) și centrifugată (12.000 × g la 4°C)
timp de 20 de minute. Supernatantul a fost amestecat cu CaCI2 ( 8 mM) și centrifugat
(27.000 x g la 4°C) timp de 15 min. Peletul rezultat a fost spălat cu volum egal de 0,15 M
KCI și recentrifugat (27.000 x g la 4°C) timp de 15 min.

Prepararea omogenaților de țesut : Pentru activitatea glutation-S-transferazei (GST),

omogenatul de țesut (10%) preparat în tampon fosfat de potasiu 0,1 M ( p H 7,0) a fost
centrifugat (10.000 × g) timp de 30 de minute, iar supernatantul a fost filtrat prin hârtie de
filtru Whatman pentru a îndepărta grăsimea. Pentru toate celelalte activități enzimatice,
omogenatele tisulare (10%) au fost preparate în zaharoză 0,25 M în tampon fosfat de
potasiu (0,01 M, pH 7,4) și centrifugate (12.000 × g) timp de 20 de minute. Conținutul de
proteine microzomale și citosolice a fost determinat prin metoda lui Lowry et al 10 .

Teste enzimatice : etoxiresorufin-O-de-etilaza microzomală (CYP1A1), metoxiresorufin

O-dealchilaza (CYP1A2), benzoxiresorufin-O-dealchilaza (CYP1B1) și pentoxiresorufin-
O-dealchilaza (CYP2B1) au fost descrise conform procedurii Burke. et al 11 și modificat
de Teel și Huynh 12. Aceste reacții au o etapă finală comună, hidroxilarea inelului de
fenaxazonă, care generează hidroxifenaxazonă (resorufin), care a fost măsurată la
lungimea de undă de excitare 550 nm și lungimea de undă de emisie 585 nm folosind
spectrofotometrul de fluorescență (Cary1 Eclipse; Varian, California USA). Activitatea
enzimatică a fost exprimată ca pmol de rezorufină eliberată pe minut per mg de proteină
microzomală. Activitatea CYP2E1 în microzomii hepatici a fost măsurată
spectrofotometric conform metodei descrise de Reinke et al 13 . Activitatea glutation-S-
transferazei a fost determinată în ficat și omogenate de țesut mamar folosind 1-clor-2,4-
divitrobenzen (CDNB) ca substrat 14 . Activitatea UDP-glucuronozil transferazei a fost
determinată în microzomii hepatici conform metodei lui Bocket al 15 modificate de
Martin și Black 16 folosind acid UDP-glucuronic și p-nitrofenol ca substraturi. y-
glutamiltranspeptidaza a fost testată în microzomi hepatici și omogenat de țesut mamar
folosind metoda descrisă de Tate și Meister 17 . Activitatea chinona reductazei a fost
testată conform metodei lui Ernster 18 în ficat și omogenate de țesut mamar.

Analiză statistică : Valorile au fost exprimate ca medie ± SE. Analiza statistică a fost
realizată prin analiza varianței în două direcții (ANOVA), iar comparațiile dintre medii
au fost analizate prin testul de comparație multiplă Tukey folosind software-ul PRISM
3.0. P <0,05 a fost considerat semnificativ.

Mergi la:

Rezultate
Creșterea animalelor a fost similară la șobolanii hrăniți cu ghee de vacă sau ulei de soia
(Smochin.) timp de 44 săptămâni, iar diferența de greutate corporală nu a fost
semnificativă statistic. În plus, nu a fost observată nicio mortalitate în niciunul dintre
grupuri.

Smochin.

Greutatea corporală a șobolanilor hrăniți cu ulei de soia sau ghee de vacă . Valorile sunt
medii ± SE (n=5).

Activitățile citocromului P450 ale metabolismului carcinogen în microzomii hepatici

(Faza I) : Activitatea citocromului P4501A1 (CYP1A1) în ficat a crescut cu până la 5
săptămâni atât la șobolanii hrăniți cu ulei de soia, cât și cu ghee de vacă , iar amploarea
creșterii a fost mai mare la uleiul de soia (60% ) decât pe ghee de vacă (28%). Nivelul
activității hepatice CYP1A1 în grupul cu ghee de vaci a fost mai scăzut decât în grupul cu
ulei de soia cu 20,1 și 11,4% la 5 și, respectiv, 44 săptămâni de tratament alimentar
(Tabelul I).

Tabelul I

Efectul grăsimilor alimentare asupra enzimelor citocromului P450 din ficatul de șobolan

Activitatea citocromului P4501A2 (CYP1A2) în ficat nu a fost afectată în mod

semnificativ la șobolanii hrăniți cu ulei de soia, în timp ce a scăzut la dieta cu ghee de
vacă cu 42,1% la 5 săptămâni și după aceea nu s-a schimbat semnificativ în niciunul
dintre grupuri. În grupul cu ghee de vaci, magnitudinea activității hepatice CYP1A2 a
fost mai mică decât la șobolanii hrăniți cu ulei de soia cu 47,5 și 44,2% la 5 și, respectiv,
44 săptămâni de tratament alimentar (Tabelul I).

Activitatea citocromului P4501B1 (CYP1B1) în ficat a rămas neafectată în dieta cu ulei

de soia pe parcursul perioadei experimentale, în timp ce pe ghee de vacă a scăzut cu 55
și 37% la 5 și, respectiv, 44 săptămâni. Nivelul activității hepatice CYP1B1 a fost mai
scăzut la grupul cu ghee de vacă decât la șobolanii hrăniți cu ulei de soia cu 55 și 37% la
5 și, respectiv, 44 săptămâni de tratament alimentar (Tabelul I). Activitatea citocromului
P4502B1 (CYP2B1) în ficat nu a fost afectată în dieta cu ulei de soia, în timp ce pe ghee
de vacă a scăzut cu 44% la 5 săptămâni. Amploarea activității hepatice CYP2B1 a fost
mai mică la șobolanii hrăniți cu ghee de vacă decât în grupul cu ulei de soia cu 46 și 37%
la 5 și, respectiv, 44 săptămâni de tratament alimentar (Tabelul I).

Activitatea citocromului P4502E1 în microzomii hepatici nu a fost afectată de hrănirea cu

ghee de vacă sau ulei de soia și nu s-a observat nicio diferență între cele două tratamente
alimentare pe parcursul perioadei experimentale (Tabelul I).

Activități de detoxifiere cancerigenă în ficat și țesuturi mamare (Faza II) : Activitatea

glutation-S-transferazei (GST) în ficat a crescut în mod egal în grupele de ulei de soia și
ghee de vacă în primele 5 săptămâni. După aceea, creșterea activității hepatice GST nu a
fost semnificativă în grupul uleiului de soia, în timp ce în grupul cu ghee de vaci , a
crescut semnificativ la 44 săptămâni (Tabelul II). În țesutul mamar, diferența în
activitatea GST între două grupuri alimentare nu a fost semnificativă statistic în niciun
stadiu (Tabelul III).

Tabelul II

Efectul grăsimilor din dietă asupra activităților de detoxifiere a carcinogenului în ficatul

de șobolan
Tabelul III

Efectul grăsimilor alimentare asupra activităților de detoxifiere a cancerigenei (unități

*
/mg proteine citosolice) în țesutul mamar de șobolan

Activitatea UDP-glucuronozil transferazei (UDPGT) în ficat nu a fost afectată

semnificativ în dieta cu ulei de soia, în timp ce în dieta cu ghee de vacă , aceasta a crescut
cu aproximativ 75% la 5 săptămâni, iar ulterior a rămas stabilă. Activitatea UDPGT în
grupul cu ghee a fost cu 63-69% mai mare decât în grupul cu ulei de soia pe parcursul a 5
până la 44 săptămâni de tratament alimentar (Tabelul II). Activitatea γ-glutamil
transpeptidază (GGTP) în ficat nu a fost afectată de tratamentul alimentar cu ghee de
vacă , în timp ce a scăzut semnificativ ( P <0,01) în dieta cu ulei de soia. Activitatea
hepatică a GGTP la șobolanii hrăniți cu ulei de soia a fost scăzută cu 34, 27 și 22% la 5,
21 și, respectiv, 44 săptămâni, în comparație cu șobolanii hrăniți cu ghee de vacă de
vârstă (Tabelul II).

În țesutul mamar, activitatea GGTP a crescut atât la șobolanii hrăniți cu ulei de soia, cât
și cu ghee de vacă , amploarea creșterii nu a fost semnificativă statistic în grupul cu ulei
de soia. Activitatea chinona reductazei (QR) din ficat nu a fost afectată până la 21
săptămâni și a crescut cu 63% la 44 săptămâni în grupul uleiului de soia, în timp ce în
grupul cu ghee de vaci a crescut cu 59, 127 și 161% la 5, 21 de săptămâni. și, respectiv,
44 săptămâni (Tabelul II), raportat la valoarea 0 zi. Activitatea QR în grupul de ghee de
vaci , comparativ cu grupul de ulei de soia, a crescut cu 48, 110 și 61% la 5, 21 și,
respectiv, 44 de săptămâni (Tabelul II). Activitatea QR în țesutul mamar a crescut la
șobolanii hrăniți cu ghee de vacă cu peste 50%, în comparație cu șobolanii hrăniți cu ulei
de soia de vârstă egală (Tabelul III).

Mergi la:

Discuţie
Metabolismul cancerigenului chimic presupune două etape; în prima etapă, cancerigenul
este metabolizat într-o moleculă reactivă de către enzimele de fază I, iar în a doua etapă,
metabolitul activ este detoxificat de mai multe enzime de fază II. Astfel, activitatea
relativă a enzimelor de fază I și faza II ar determina amploarea tumorigenezei. Enzimele
citocromului P450 de fază I sunt legate de membrană și activitățile lor sunt influențate de
mediul lipidic. Prin urmare, modificarea compoziției lipidelor membranei prin hrănirea
animalelor cu o sursă singulară de grăsime ar putea afecta metabolismul cancerigenului 7 .
Dieta bogată în acizi grași polinesaturați (pește și ulei de floarea soarelui) crește nivelul
de citocrom microzomal P-450 în ficatul de șobolan, în comparație cu cel bogat în acizi
grași saturați (ulei de pește parțial și foarte hidrogenat) 19. Saito et al 20 au observat, de
asemenea, niveluri scăzute de activitate citocromului P-450 și aminopirină N-demetilază
la șobolanii hrăniți cu untură în comparație cu cei hrăniți cu ulei de soia și au sugerat că o
proporție crescută de acizi grași saturați din fosfolipidele membranei microzomale ar fi
putut modifica membrana. conformaţia şi fluiditatea conducând la o activitate scăzută a
acestor enzime.

Ghee-ul de vaci , care conține o cantitate mare de acizi grași saturați și mononesaturați,
poate modifica gradul de nesaturare a lipidelor și, prin urmare, poate modifica mediul
fizico-chimic al membranelor microzomale, care poate fi responsabil pentru scăderea
activităților CYP1A1, CYP1A2 și CYP1B1 observate în gheeul de vaci . șobolani hrăniți.
Scăderea acestor enzime de fază I ar fi putut contribui la scăderea incidenței tumorilor
mamare la șobolanii hrăniți cu ghee de vacă , comparativ cu cei cu ulei de soia 4 .
Resveratrolul inhibă activitatea CYP1A1 şi, de asemenea, previne dezvoltarea tumorii la
şoarecii trataţi cu 7,12-dimetilbenz(a) antracen (DMBA) 21 , 22 .

Acidul linoleic conjugat (CLA), un agent anticancerigen bine documentat 23 prezent în

produsele lactate inhibă cancerul de colon indus de 2-amino-3-
metilimidazo[4,5f]chinolină (IQ) prin scăderea activității CYP1A1 și CYP1A2 24 . Într-un
studiu in vitro , sa raportat că CLA (0,5 μM) inhibă activitățile CYP1A1, CYP1A2 și
CYP1B1 în microzomul hepatic de hamster 12 . Ghee-ul de vaci utilizat în studiul nostru
conținea o cantitate bogată de CLA (5,47 mg/g), iar o creștere de 12 ori a conținutului de
CLA în țesutul mamar al șobolanului prin hrănirea cu ghee de vacă a fost raportată
anterior 25 .

Activitatea GST în ficat și țesutul mamar nu a variat între uleiul de soia și șobolanii
hrăniți cu ghee de vacă. γ-glutamiltranspeptidaza (GGTP) joacă un rol important în
detoxifierea compușilor precum agenții cancerigeni prin formarea derivaților lor de acid
mercapturic 26 . Activitatea crescută a GGTP, observată în studiul de față, în țesutul
hepatic și mamar al șobolanilor pe ghee de vacă în comparație cu dieta cu ulei de soia, ar
putea fi unul dintre factorii care contribuie la efectul protector al ghee-ului de vacă asupra
tumorigenezei 4 . Hrănirea șobolanilor cu ghee de vacă a crescut, de asemenea, activitatea
UDPGT în ficat, ceea ce ar fi putut cauza o rată crescută de glucuronidare a
dihidrodiolilor DMBA care duce la detoxifierea carcinogenului. Elegbedeet al 27 au
raportat că activitatea anticancerigenă a monotrepenei a fost mediată prin inducerea
enzimelor de detoxifiere hepatică GST și UDPGT.

În concluzie, ghee-ul de vacă, opus uleiului de soia, a reglat activitățile de detoxifiere

cancerigene ale GGTP, UDPGT și QR în ficat și GGTP și QR în țesutul mamar și a reglat
în jos activitățile de faza I de activare a carcinogenului, CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 și
CYP2B1 în ficat. Aceste modificări metabolice ar fi putut contribui la scăderea incidenței
induse de DMBA a tumorilor mamare observate la șobolanii hrăniți cu ghee de vacă ,
comparativ cu cei hrăniți cu ulei de soia 4 .