Sinteza acidului ursolic, derivat dipeptid

cu activitate biologic potenial

DORIN MANCIULA
CARMEN ROBA
IOAN OPREAN
RADU MISCA-BARBU

Ki Denisa,
Ingineria mediului, an IV

1. Abstract
Acidul ursolic este un compus natural , un triterpenic pentaciclic ,
gsit din abunden n multe specii native ale florei salbatice. Studiul
experimental a fost menit s extrag acidul ursolic din Calluna vulgaris,
L. Hull, ( Ericaceae ) i derivatizarea acestuia pentru a obine compui
dipeptidici cu activitate biologic potenial. n acest scop, s-au folosit
trei dipeptide : alanil-glicin, glicil-leucin i leucil glicin. Activitatea
biologic a uroligico-leucin a fost testat pe mai multe linii de celule
cancerigene: A2780 , A431 , HeLa i MCF -7.
Acidul ursolic, ( C30H48O3 ) este un hidroxi-pentaciclic triterpenic
care prezint o protecie bun a activitii chimice a organismului
uman, fiind larg rspndit n natur i poate fi extras din mai multe
specii de plante.
Acidul ursolic a fost gsit astfel n multe plante, incluznd acelea care
sunt utilizate demult n medicina tradiional, n mod special frunzele de
Calluna vulgaris L. (Hull), (Ericaceae), Coacz Spiculifolia, Salisb.,

(Ericaceae ), Salvia officinalis, ( Lamiaceae ), Staphylea holocarpa,

( Rosaceae ), Rosa woodsii, ( Rosaceae ), Prosopis glandulosa,
( Leguminosae ), Phoradendron juniperinum, ( Loranthaceae ),
Syzygium claviflorum, ( Myrtaceae ), Hyptis capitata, ( Lamiaceae )
i Ternstromia gymnanthera, (Theaceae ), i, de asemenea , n coaj
de Olearia paniculata, ( Asteraceae ) i Australis Polylepis, ( Fam.
Rosaceae ).

2. Introducere
Acidul ursolic exercit proprieti farmaceutice remarcabile.
Dintre aceasta sunt incluse mai multe efecte: efecte antihiperlipidemice, anti-inflamator, hepatoprotector, antitumoral, analgezic,
efecte cardiace, sedative, anxiolitice tonice i modulatorii, efecte
colagen i la fel de bine antiaterosclerotice, anticariogenice i
antiherpetice, mpreun cu alte aciuni biologice, cum ar fi
stimularea sistemului imunitar mpotriva propriet iilor anti-HIV.
Acidul ursolic are trei pozitii: C3, C20 i C28 n care schimbarile
chimice pot fi determinate spre scopul ob inerii unui numr mare de
derivai cu proprieti biologice semnificative, n mod particular
aceea de a inhiba creterea celulelor tumorale.

3.Partea experimental
Acidul ursolic a fost extras dintr-un amestec uscat de frunze, flori i
tulpini tinere de Calluna vulgaris, L. Hull, ( Ericaceae ), prin macerare,
timp de 6 zile, la 22 C, folosind ca solvent o soluie de etanol-ap.
Toate materialele conin plante care au fost culese de la Bi oara i
Cucea, judetul Cluj, sortate i uscate la cuptor la o temperatur de 65 C
timp de 3 zile. Materialul vegetal astfel uscal a fost apoi mcinat, iar
materialul granular heterogen a fost separat n clase granulometrice.
Evoluia de extracie a fost realizat cu ajutorul studiilor de
refrefractometrie i influena diferiilor parametrii asupra extragerii
acidului ursolic din analiza masei vegetale. n timpul studiului au fost
utilizate variate concentraii de soluie ap-ethanol 20, 50, 60, 70, 80 i
95%, diverse fraciuni granulometrice + 1250, - 1250, + 125, + 90 i - 90
m precum i diferite aciuni lichid-solid, 10 : 1; 20 : 1; 30 : 1 i 40 : 1,
(mL/g).

n timpul acestui studiu experimental, att analiza cantitativ ct i

cea calitativ a acidului ursolic din extract au fost fcute prin
intermediul cromatografiei de nalt performan, (RP=HPLC).
Separarea cromatografic a fost efectuat pe o coloana C18, (250 4.6
mm, 5 m), faza mobil folosit fiind reprezentat de un mix de
acetonitril i ap ultrapura la o raie de 90 : 10 (v : v) i un debit de
curgere de 0.8 ml/min. Detecia a ajuns la o lungime de unda de 210
nm.
Derivaii dipeptide au fost obinui prin condensarea acidului ursolic
cu alanil-glicin, glicil-leucin i leucil-glicin a a cum se vede n
figura 2.
Sinteza derivaiilor acidului ursolic a avut loc ntr-o serie de reac ii
dezvoltate prin patru etape succesive, printre care primele dou,
corespund obinerii produselor intermediare ( 1a ) i ( 2a ), fiind
similare cu metoda de cercetare corespunztoare obinerii deriva iilor
acidului ursolic ( 4 ), ( 6 ) i ( 8 ).

Prima reacie a fost tratamentul acidului ursolic cu anhidrid

acetic rezultnd acid ursolic monoacetil, ( 1a ),la care, n etapa a
doua, a fost adgat clorura de tionil i clorura monoacetil acid
ursolic i s-a obinut ( 2a ).
O cantitate de acid ursolic 50 mg a fost dizolvat n diclormetan i
apoi s-a agitat cu 0,15 ml anhidrid acetic timp de 6-8 ore la
temperatura camerei, pentru ob inerea acidului monoacetil ursolic
( 1a) La acest compus, se adaug 1 ml de clorur de tionil i dup 12
ore la temperatura camerei, redundan a clorurii de tionil a fost
ndeprtat prin distilare la presiune joas, la 75 C, reziduul fiind
apoi recristalizat din hexan sub nclzire, pn la un punct constant
de topire. Dup o sesiune n care a fost uscat timp de 2 ore la
temperatura de 110 C, a fost ob inut acetil ursolic clorur acid ( 2a
). Prin condensarea compusului ( 2a ) cu alanil-glicin n a treia
faz,s-a obinut produsul intermediar 3-acetoxi -ursoloil-alanil
glicin,( 3 ), apoi, dup ndeprtarea gruprii acetoxi prin tratament
cu NaOH n a patra faz, s-a ob inut sinteza final ursoloil-alanilglicin,( 4 ).

O cantitate de 0,89 mmol de alanil-glicin dizolvat n diclormetan a

fost utilizat n procesul de sintez, care a fost apoi amestecat cu 0,1 ml
de trietilamin rezultnd o soluie care a fost turnat prin agitare peste
monoacetil clorur de acid ursolic, ( 2a ), pstrat peste noapte la
temperatura camerei, apoi fiind diluat cu diclormetan i se spal cu ap
i soluie salin concentrat. Dup uscare i filtrare cu sulfat de sodiu
anhidru ( Na2SO4 ), reziduul a fost apoi concentrat sub vid ntr-un
vaporizator rotativ i astfel a fost obinut 3-acetoxi-ursoloil-alani-glicina
( 3 ).Compusul ( 3 ) este apoi dizolvat n interiorul unui amestec de
tetrahidrofuran ( THF )/ metanol 50 , 2 ml, i tratat cu un amestec de
0,160 g hidroxid de sodiu ( 1 ml, 4 M ) i 1 ml de ap sub un raport de
NaOH : H2O = 1 : 1. Dup agitarea soluiei timp de 5 ore la temperatura
camerei, produsul s-a neutralizat cu 1 ml acid clorhidric 1 N pn la
precipitare; apoi precipitatul obinut se spal cu ap i se usuc sub vid,
rezultnd o cantitate de 38.06 mg ursoloil-alanil-glicin,( 4 ), cu un
randament de 7,32 %.ntr -un mod similar s-a obinut i 151.52 mg de
ursoloil-glicil-leucina,( 6 ), cu un randament de 35 % i 54,15 mg de
ursoloil-glicin,( 8 ), cu un randament de 12,51 %.

4.Rezultate i discuii
Studiul cu privire la extracia acidului ursolic din Calluna vulgaris,
L. Hull (Ericaceae), prin macerare a fost ntreprins sub influena a
numeroi parametrii n cadrul acestui proces. Au fost investigai
urmtorii: concentraia de solvent , raportul lichid-solid, precum i
dimensiunea masei vegetale n timpul procesului de separare. Influena
concentraiei de solvent asupra procesului de extracie a fost realizat
utiliznd diferite concentraii de soluii de etanol-ap, 30, 50, 60, 70, 80
i 95 %, meninnd n acelai timp un raport constant L : S 20) i
fracia granulometric 1250 m. Variaia indexului refractiv este
artat n figura 3. A fost constatat c extracia este detaat cu mare
eficien n conditiile folosire ethanol-apa solutie cu concentratie de
95%, n condiiile experimentale date, echilibrul fiind atins dup
aproximativ 4 zile.

Fig. 3

Fig. 4

Fig.5

Influena raportului lichid-solid n privina extraciei a fost

studiat folosind diferite raporturi de 10:1; 20:1; 30:1 si 40:1,
(mL/ g), o concentraie de solvent etanol-ap de 95%, iar
mrimea particulelor fraciunii-1250 m. Variaia indexului
refractiv este ilustrat n figura 4. Extracia a fost nregistrat la
vitez maxim n timpul utilizarii raportului L:S de 10:1, (mL/g)
i echilibrul a fost atins n condiiile experimentale date dup
aproximativ 5 zile.
Influena dimensiunii masei vegetale asupra extracieia fost
studiat prin utilizarea mai multor fraciuni granulometrice,
+1250 - 1250 + 125 + 90-90 pm . Solventul etanolap a fost
meninut la o concentraie de 95 %, iar raprtul L:S la 20:1 (ml/g).
Extracia a fost desfurat la viteza maxim folosind fracia
granulometric 1250 m, n condiiile experimentale date,
echilibrul fiind atins dup 6 zile. Variaia indicelui de refracie
este artat n figura 5 .

5. Concluzii
Experimental s-a obinut c, dup o perioad de aproximativ 6 zile, la
22C, extracia este finalizat i variaiile ale indicelui de refractie sunt
nesemnificative. Cea mai mare eficien de extracie a fost atins la
nivelul de solvent etanol-ap cu o concentraie de 95%, la un raport L:S
de 10:1, ( ml/g) i o fracie granulometric - 1250m . O cantitate de
22,35 mg acid ursolic a fost obinut ca rezultat al parametrului optim de
extracie , ntr-un randament de 2,32 %, suma determinat prin
analiza cromatografic lichid ( HPLC ).
Efectele antiproliferative au fost testate pentru compusul ( 6 ), iar
rezultatele arat c nu exist diferene majore dintre activitatea acidului
ursolic i derivaii lui substituii.

Bibliografie

1. LIU J., J. of Ethnopharmacol., 100, 2005, p. 92;

2. CORBET R., YOUNG H., WILSON R., Aust. J. Chem., 17, 1964,
p. 712;
3. DE-LAMPASONA M., CATALAN C., GEDRIS T., HERZ W.,
Phytochemistry, 49, no. 7, 1998, p. 2061;
4. BARICEVIC D., SOSA S., LOGGIA R., TUBARO A., SIMONOVSKA B.,.
KRASNA A., ZUPANCIC A., J. Ethnopharmacol., 75, 2001, p. 125;
5. QI S., DING L., TIAN K., CHEN X., HU Z., J. of Pharma. and Biomedical
Anal., 40, 2006, p. 35;
6. ZHOU C., ZHANG Y., SHENG Y., ZHAO D., SANSAN L., HU Y., TAO J.,
Int. J. Mol. Sci., 12, 2011, p. 655;
7. LI Y., KANG Z., LI S., KONG T., LIU X., SUN C., Mol. Nutr. Food Res.,
54, no. 11, 2010, p. 1609;
8. MICELI N., TAVIANO M., GIUFFRIDA D., TROVATO D., TZAKOU O.,
GALATI E., J. of Ethnopharmacol., 97, 2005, p. 261;
9. SARAVANAN R., VISWANATHAN P., VISWANATHAN K., PUGALENDI
K., Life Sci., 78, 2006, p. 713;