LUCRARE LABORATOR 7

Evidențierea activității metabolice a unor microorganisme de interes industrial

DROJDIILE

EVIDENŢIEREA PRODUŞILOR FINALI AI FERMENTAŢIEI ALCOOLICE

Generalităţi
Aplicaţii practice ale fermentaţiei alcoolice: biotehnologia drojdiei de bere, a pâinii, a
băuturilor alcoolice.
Procesul fermentaţiei alcoolice decurge după următoarea reacţie generală:

C6H12O6 → 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 24 calorii

Acest proces de catabolism incomplet stă la baza metabolismului drojdiilor (Saccharomyces)

microorganisme reprezentative implicate în acest proces.

Principiul metodei: Descompunerea glucidelor şi transformarea lor în alcool, de către specii

de Saccharomyces şi anume de Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere) şi S. ellipsoideus (drojdia
de vin), precum şi de către unele Phycomycete (Mucor, Rhisopus), sau unele Ascomycete
(Penicillium, Aspergillus). Unele specii de bacterii cum ar fi Pseudomonas lindneri, Bacillus
macerans, B. granulobacter pectinovorum, Escherichia coli etc. pot fermenta pentoze, hexoze şi
diglucide şi pot produce echipamentul enzimatic necesar fermentaţiei alcoolice. Aceste fermentaţii
sunt mixte, pe lângă alcoolul etilic şi CO2, formându-se şi acetonă (fermentaţie acetono-alcoolică),
acid lactic (fermentaţie lactică atipică) şi acid acetic.

Materiale, soluţii şi aparatură: vas Erlenmeyer cu dop de cauciuc perforat, soluţie 10%
zaharoză, drojdie, tub de sticlă îndoit, eprubetă cu apă, vas de 1000 ml cu apă, stativ de biurete, sursă
de încălzire, baie de apă, hidroxid de bariu, chibrituri, K2Cr2O7, H2SO4.

Mod de lucru: Se introduc 50 ml soluţie 10% de zaharoză într-un vas Erlenmeyer. Se adaugă
10 ml dintr-o suspensie de drojdie de bere diluată cu aceeaşi soluţie de zaharoză (1 gram de drojdie de
bere în 10 ml soluţie de zaharoză). Gura recipientului se închide ermetic cu un dop de cauciuc perforat,
prin care trece un tub de sticlă îndoit de patru ori în unghi drept (sau un tub de plastic), astfel încât
acesta să aibă forma a doua litere „U”. Capătul extern al tubului se introduce într-o eprubetă plină cu
apă, dispusă cu gura în jos, într-un vas cu apă. Se menţine temperatura vasului Erlenmeyer la 30-35oC
utilizând o baie de termostatată. După 15-20 minute, CO2 degajat prin fermentaţie înlocuieşte toată apa
din eprubetă, iar la capătul tubului începe să iasă un şir uniform de bule de gaz.
a) Pentru a dovedi că acest gaz este bioxid de carbon, se introduce în eprubetă o soluţie de hidroxid
de bariu, care se tulbură în urma formării de BaCO3 sau se ţine eprubeta în continuare cu gura în jos,
se introduce în interiorul acesteia un chibrit aprins (fără să se atingă marginile eprubetei), a cărui
flacără se stinge din cauza lipsei oxigenului.
b) Alcoolul se poate pune în evidenţă prin reacţia cu K2Cr2O7 astfel: în soluţia fermentată (din
paharul Erlemneyer) se introduc câteva cristale de K2Cr2O7 şi se adaugă câteva picături de H2SO4
 conc. Apare o culoare verde, ca urmare a reducerii cromului, formându-se şi anhidrida acetică,
decelabilă după miros, conform reacţiei:

K2Cr2O7 + 4 H2SO4+ 3 CH3CH2OH→ K2Cr2(SO4)4 + 3 CH3CHO + 7 H2O

Interpretarea rezultatelor:
În baza datelor experimentale se formulează concluzii referitoare la produsii finali ai fermentatiei
alcoolice rezultaţi ca urmare a acţiunii drojdiilor analizate.

DETERMINAREA SCHIMBULUI DE GAZE ÎN PROCESUL FERMENTAŢIEI, LA

DROJDII

Generalităţi:
Fermentaţia, este un proces catabolic care se desfăşoară în condiţii de anaerobioză, în timpul
căruia un substrat organic fermentabil este scindat în produşi finali (de regulă doi) cu moleculă mică.
Dintre produşii finali, unul este mai oxidat decât substratul fermentabil, iar celălalt este mai redus. Cu
alte cuvinte, unul serveşte ca donor, celălalt ca acceptor de electroni. În cazul fermentaţiei glucozei de
către drojdii, se obţin ca produşi finali etanolul şi dioxidul de carbon. Etanolul este produsul final mai
redus decât glucoza, deoarece molecula sa are mai mulţi atomi de hidrogen şi electroni, raportaţi la
numărul atomilor de carbon, iar dioxidul de carbon este produsul mai oxidat decât substratul. În
procesele fermentative se menţine întotdeauna un echilibru oxidoreducător, astfel că nivelul mediu de
oxidare al produşilor finali este identic cu cel al substratului. În fermentaţii, se eliberează doar o parte
a energiei substratului, restul fiind conservată în produşi finali.
Gama substraturilor fermentabile, ca şi cea a produşilor finali, este extrem de diversificată.
Procesul cel mai cunoscut este fermentaţia glucozei. Acesta este iniţiat printr-o fosforilare cu
producere de glucozo-6-fosfat, care ulterior este convertit în acid piruvic, intermediarul în
catabolismul fermentativ al tuturor glucidelor. În celulele animalelor, piruvatul este oxidat la dioxid de
carbon şi apă. La microorganisme, în absenţa oxigenului are loc o oxidare incompletă, însoţită de
acumularea produşilor de fermentaţie. Reacţiile de metabolizare a piruvatului diferă foarte mult: în
cazul fermentaţiei alcoolice, care este cea mai veche fermentaţie cunoscută, are loc decarboxilarea
piruvatului de către piruvatdecarboxilază; se formează acetaldehidă, care este redusă la metanol de
către alcool dehidrogenază.
Cel mai cunoscut organism capabil de degradare fermentativă a glucozei este Saccharomyces
cerevisiae; pe lângă glucoză, această drojdie mai poate prelua şi fermenta o mare varietate de zaharuri,
cum sunt: zaharoza, fructoza, galactoza, maltoza şi maltotrioza; alte specii înrudite sunt capabile să
utilizeze şi alte specii moleculare.
Cu toate că este considerat un organism fermentativ, S. cerevisiae posedă şi un pronunţat
metabolism respirator, adică, în prezenţa oxigenului are capacitatea de a oxida glucoza la CO2 şi H2O,
furnizând celulei cantitatea maximă de energie. Absenţa oxigenului nu este singura condiţie care duce
la apariţia fermentaţiei: o concentraţie mare de zahăr, în prezenţa oxigenului, induce de asemenea
fermentaţia, inhibând aproape total sinteza enzimelor respiratorii şi formarea mitocondriilor cu aspect
morfologic normal.
Capacitatea oxigenului de a interfera cu procesele anaerobe, inhibând prin prezenţa sa
fermentaţia şi stimulând concomitent respiraţia, este cunoscută sub denumirea de efect Pasteur.
Într-una din variantele experimentale ale lucrării de faţă, se utilizează ionul uranil (UO22+) ca
inhibitor al procesului fermentativ. De fapt, ionul uranil nu este un inhibitor specific al fermentaţiei
alcoolice, deoarece nu acţionează la nivelul alcool dehidrogenazei. Ionii uranil sunt inhibitori ai
absorbţiei celulare a glucozei, prin legarea lor la nivelul grupelor anionice de la suprafaţa celulelor.
Absorbţia glucozei este inhibată (reversibil), însă, fără a fi inhibată şi respiraţia celulară.
Măsurarea variaţiilor manometrice are loc în acelaşi mod în care s-a efectuat şi în celelalte
experienţe de manometrie Warburg; în efectuarea calculelor, în formula de calculare a constantei k, se
va utiliza α CO2 = 0,665, la temperatura de 30°C; la aceeaşi temperatură, α O2 = 0,0262; în rest, modul
de calcul rămâne neschimbat (vezi tabelele).

La temperatură şi volum constant, toate variaţiile cantitative ale unui gaz dintr-o incintă închisă
au ca efect o variaţie a presiunii. Aparatul Warburg permite obţinerea condiţiilor constante menţionate,
precum şi măsurarea manometrică a variaţiilor de presiune datorate schimburilor de gaze ce însoţesc
un proces metabolic. Fotosinteza şi respiraţia sunt două procese metabolice importante, în timpul
cărora are loc un intens schimb de gaze, schimb care poate fi măsurat manometric cu aparatul
Warburg.
Dacă intensitatea respiraţiei unui eşantion dintr-un anumit anumit ţesut poate fi apreciată prin
cantitatea de oxigen consumată, intensitatea fotosintezei este evaluată prin măsurarea volumului de
oxigen produs.

APARATUL WARBURG
Aparatul Warburg se compune dintr-o serie de cupe (vase de reacţie), în fiecare dintre ele
efectuându-se reacţiile sau procesele metabolice studiate. Fiecare cupă este racordată la câte un
manometru, care permite măsurarea (cuantificarea) variaţiilor presiunii. În timpul experienţei, cupele
sunt imersate într-o baie de apă cu temperatură constantă. Ansamblurile cupă-manometru sunt fixate
într-un sistem mecanic de agitare.
Cupa (un recipient ce poate avea diferite capacităţi, între 5-50cm3) este prevăzută cu un
diverticul (braţ) lateral şi o celulă centrală în formă de păhărel. Diverticulul are un dop rodat, care
permite izolarea completă a cupei de exterior, sau dimpotrivă, o comunicare liberă când dopul este
scos. Prin urmare, acest vas de reacţie are trei compartimente: compartimentul principal, celula
centrală şi diverticulul lateral.
Manometrele, sunt constituite din două braţe capilare dispuse sub formă de U, cu ambele ramuri
gradate în mm, de la 0 la 300; desigur, cele două ramuri comunică liber între ele; ramura dreaptă este
deschisă, iar cea stângă comunică cu vasul de reacţie, printr-un braţ lateral în formă de L; extremitatea
braţului lateral este prevăzută cu un şlif conic ce poate închide perfect vasul de reacţie. Ataşarea
vasului de reacţie la braţul lateral al manometrului este favorizată prin existenţa unor cârlige, care
permit montarea unui inel subţire de cauciuc elastic. Pe ramura stângă, fiecare manometru este
prevăzut cu un robinet cu trei căi, care permite închiderea-deschiderea sistemului; în poziţia deschis,
manometrul (ramura stângă) comunică cu vasul de reacţie.
La mijlocul curburii inferioare, fiecare manometru este în legătură cu un rezervor care conţine
lichid Brodie. Acest rezervor este constituit, de cele mai multe ori, dintr-un tub scurt de cauciuc
racordat la acest nivel. Prin uşoara presare a tubului de cauciuc, care se face printr-o clemă metalică cu
şurub, se poate regla nivelul lichidului Brodie din manometru.
Înaintea experienţei propriu-zise, se determină cu precizie volumul cupei de reacţie, a braţului
lateral şi al segmentului din ramura stânga a manometrului, până la diviziunea 150. Această calibrare
se execută prin măsurarea cantităţii de mercur necesară umplerii perfecte a spaţiului închis, obţinut în
urma echilibrării manometrului (volumul capilarului manometric stâng, cuprins între diviziunea 150 şi
robinet + volumul tubului lateral + volumul cupei de reacţie în stare racordată la manometru).
Mercurul utilizat se cântăreşte şi se împarte la densitatea sa (l 3,6), obţinându-se volumul, care se
corectează pentru temperatura la care s-a efectuat determinarea. Calibrarea se efectuează separat
pentru fiecare ansamblu cupă de reacţie-manometru. Această modalitate de calibrare explică şi de ce
fiecare citire este precedată de fixarea lichidului manometric din braţul stâng la diviziunea 150.
Lichidul Brodie este o soluţie apoasă cu densitatea de 1,034, cu următoarea compoziţie
(greutate/volum): 4,6% NaCl, 1% taurocolat de Na; în plus, se adaugă eozină sau albastru de metil
pentru colorare; datorită densităţii sale, o coloană de lichid Brodie de 10m înălţime exercită o presiune
egală cu 760mm coloană de Hg.
Partea mecanică a aparatului asigură, pe de o parte o temperatură de lucru constantă şi reglabilă
în baia de apă în care sunt imersate vasele de reacţie ataşate la manometre şi pe de altă parte, agitarea
continuă a manometrelor.
La aparatul Warburg se ataşează o sursă de lumină rece (un tub de neon), necesară pentru
desfăşurarea procesului de fotosinteză. Lumina generată de această sursă se poate măsura cu ajutorul
unui luxmetru sau altui tip de aparat destinat exprimării intensităţii luminii.
În timpul experienţelor, se urmăresc variaţiile de presiune din manometre şi anume:
variaţia totală şi variaţia reală.
Variaţia totală: deoarece în procesul de fotosinteză, care are loc într-un interval de timp
cunoscut, are loc o degajare de oxigen de către suspensia celulară fotoasimilatoare, iar presiunea
aerului din ramura stângă a manometrului va creşte. Această creştere va determina scăderea nivelului
lichidului Brodie sub diviziunea 150 (nivelul iniţial); în momentul citirii, se opreşte agitarea mecanică
şi prin acţionarea clemei rezervorului, se readuce nivelul lichidului din ramura stângă la 150, (valoarea
iniţială); în ramura dreaptă apare o diferenţă de nivel, prin urcarea lichidului Brodie peste diviziunea
150; valoarea în mm a acestei diferenţe de nivel reprezintă variaţia totală a presiunii în vasul de
reacţie.
Variaţia reală: se obţine prin corectarea variaţiei totale prin valorile variaţiei termobarometrice.

În cursul experienţei pot să apară variaţii ale presiunii atmosferice sau modificări ale
temperaturii, care, chiar dacă sunt mici, pot introduce erori în determinare. Corectarea variaţiilor de
presiune şi de temperatură se face cu ajutorul termobarometrului, care nu este altceva decât un
ansamblu cupă de reacţie-manometru, care este pregătit la fel ca şi celelalte, dar de care se deosebeşte
prin faptul că nu conţine suspensia de celule fotosintetizante. Dacă în timpul determinării are loc o
creştere a temperaturii băii termostatate şi o scădere a presiunii atmosferice, nivelul lichidului
barometric se va deplasa în jos în braţul stâng al manometrului şi în sus în ramura sa deschisă. Dacă
are loc o descreştere a temperaturii, însoţită de o creştere a presiunii atmosferice, lichidul manometric
se deplasează ascendent în ramura închisă şi descendent în ramura deschisă. În cazul în care în timpul
experienţei nu au loc modificări de temperatură şi presiune, nivelul lichidului Brodie nu se modifică în
termobarometru.
Corecţia: dacă în intervalul de timp în care s-a efectuat determinarea, nivelul lichidului
Brodie din termobarometru a crescut faţă de nivelul iniţial, valoarea numerică a acestei denivelări se
scade din fiecare valoare a denivelărilor citite la manometrele cu suspensii celulare. Dacă nivelul
lichidului manometric a scăzut sub valoarea iniţială (în termobarometru), se procedează invers, adică
valoarea numerică a denivelării se adaugă la valorile citite la manometrele cu probe vii, fotosintetic
active.
 nivel nivel
mm/ml mm/ml

Fotosintezã
Biosinteza Respiratie

Principiul lucrării:
Lucrarea constă în determinarea volumelor de CO2, produse ca urmare a fermentaţiei alcoolice,
prin metoda manometrică Warburg. Se utilizează o suspensie de drojdie de bere, efectul substratului
normal glucoza, fiind comparat cu efectele produse de un inhibitor (ionul uranil), sau cu acela datorat
absenţei substratului. De notat faptul că, deoarece experienţa se desfăşoară în condiţii de aerobioză,
sunt eliminate interferenţele dintre fermentaţie şi respiraţie. În cazul drojdiei de bere, în prezenţa unui
substrat adecvat (glucoza), producerea de CO2 este totuşi net mai mare decât consumul de oxigen în
respiraţie, chiar şi în condiţii de aerobioză.

Materiale, soluţii şi aparatură:

Materiale: suspensie de drojdie de bere, eprubete, eprubete de centrifugă, pipete de 1 ml şi 5
ml, hârtie de filtru.
Soluţii: fosfat disodic 0,1M; fosfat monopotasic 0,1M; soluţie 30mM glucoză; acetat de uranil
1% în tampon fosfat.
Aparatură: balanţă; aparat Warburg; centrifugă.

Tehnica de lucru:
1. - Se verifică dacă sunt întrunite condiţiile materiale pentru efectuarea lucrării: aparatură,
soluţii, materiale etc.
2. - Se verifică temperatura băii de apă a aparatului Warburg (30°C).
3. - Se amestecă 0,6ml soluţie de fosfat disodic cu 9,4ml soluţie fosfat monopotasic, pentru a se
obţine o soluţie tampon cu pH = 5.
4. - Se pipetează 1ml de suspensie densă de drojdie într-o eprubetă de centrifugă şi se adaugă
5ml soluţie nutritivă BBM, iar după echilibrare, se centrifughează 15min. la 3000rpm.
5. -După centrifugare, se înlătură supernatantul, iar peste depozit se pipetează 4ml soluţie
tampon fosfat.
6. - Se pipetează câte 1ml de suspensie celulară spălată în 3 cupe Warburg, în compartimentele
principale, iar în a 4-a cupă (termobarometrul), se pipetează 3ml de tampon fosfat.
7. – În primele 3 cupe Warburg, în compartimentele principale, se mai adaugă:
-cupa nr.1: lml tampon fosfat + 1ml apă distilată;
-cupa nr.2: 1ml soluţie glucoză +1ml tampon fosfat;
 -cupa nr.3: 1ml acetat de uranil + 1 ml soluţie glucoza (acetatul de uranil se pipetează
primul).
8. - Se ataşează cupele la manometrele corespunzătoare pe panoul aparatului şi se fixează în stare
deschisă; se porneşte agitarea şi se aşteaptă 10min. pentru a se realiza echilibrarea termică.
9. - După 10min. se opreşte agitarea, se fixează lichidul manometric la diviziunea 150 la toate
garniturile cupă-manometru şi se închid robinetele.
10. - La intervale de 10min. se efectuează citirile. Dacă într-unul din manometre variaţia totală
are o amplitudine prea mare pentru a se efectua măsurători pe durata de 60min., se va deschide
robinetul şi se va echilibra din nou la gradaţia de 150. Variaţiile citite din acest moment vor fi
adăugate la valoarea anterioară reechilibrării.
11. - Se efectuează calculele utilizându-se tabelele
Tabelul nr.1
Tabel cu valorile variaţiilor totale
Nr. Variaţia totală (mm)
cupă Proba 10 min 20 min 30 min 40 min
drojdie
drojdie + glucoză
drojdie + glucoză + uranil
Termobarometru

Tabelul nr.2
Tabel cu valorile variaţiilor reale
Nr. Variaţia totală (mm)
cupă Proba 10 min 20 min 30 min 40 min
drojdie
drojdie + glucoză
drojdie + glucoză + uranil

Tabelul nr.3
Tabelul de calcul al volumelor de gaz
VCO2 (μl)
Proba Vt Vl Vg k 10 min 20 min 30 min 40 min
drojdie
drojdie + glucoză
drojdie + glucoză + uranil

Tabelul nr. 4
Tabel final
Proba μmol CO2 / min
drojdie
drojdie + glucoză
drojdie + glucoză + uranil