Sunteți pe pagina 1din 2

Determinarea activităţii catalazei. Influenţa pH-ului, temperaturii şi a tăriei ionice asupra vitezei de reacţie

Peroxidul de hidrogen (H 2 O 2 ) este un agent oxidant nociv, produs de corpul uman în urma oxidării acizilor graşi sau în cazul în care celulele albe sangvine atacă bacteriile care pot avea efecte negative aupra metabolismului celular. Catalaza este prezentă într-o varietate de surse:

plante, fructe, carne sau ficat. De asemenea catalaza poate fi utilizată la identificarea bacteriilor. Dat fiind faptul că aceasta enzimă nu este prezentă în streptococi, dar este prezentă în stafilococi, aceasta enzimă poate fi utilizată la diferenţierea dintre aceste specii. Catalaza se află în concentraţie foarte mare în organitele celulare (ale plantelor sau animale) numite peroxizomi şi protejează astfel celula de peroxidului de hidrogen, compus care poate fi convertit în radicali hidroxil şi implicit sa creeze mutaţii genetice. Catalaza utilizează de asemenea apa oxigenată în scopul de a oxida o serie de compuşi toxici, incluzând fenoli, acidul formic, formaldehida sau alcoolii. Măsurarea vitezei reacţiei enzimatice se poate face direct (cu ajutorul unui electrod de oxigen) sau indirect. În acest experiment, viteza de reacţie este masurată indirect. Pentru determinarea vitezei de reacţie se utilizează o hârtie de filtru care este acoperită cu enzima şi apoi imersată într-o soluţie de substrat (apă oxigenată). Enzima (catalizatorul biochimic) măreste viteza de descompunere a apei oxigenate în apă şi oxigen, iar moleculele de gaz formate constituie forţa motrice de deplasare a hârtiei de filtru de la baza tubului la suprafaţă. Timpul necesar hârtiei de fitru pentru a parcurge această distantă (de la bază la suprafată) este un indicator al vitezei reacţiei enzimatice.

Viteza de reacţie = Înaltimea lichidului din vas (mm) / timp (s) Aparatura şi materialele necesare:

-aparat cu ultrasunete; -pHmetru; -tuburi din plastic cilindrice; -pensetă; -cronometru de laborator; -un cartof, măr sau cantitate mică de ficat; -pâlnie şi hârtie de filtru; -centrifugă. Reactivi:

-acetat de sodiu 20 mM pH=5 -fosfat de sodiu 20 mM pH=7 -borat de sodiu 20 mM pH=9 -glicină 20 mM pH=11 Atenţie catalaza este stabilă la temperatura redusă (pe gheata) şi la pH 7! Mod de lucru Într-un pahar Berzelius sau un tub de plastic de 50 mL se cântaresc 2 g de ficat. Se taie mărunt ficatul şi se resuspendă în 10 mL soluţie tampon fosfat 20 mM pH 7. Se pastrează amestecul omogen pe gheaţă şi se supune ultrasonicării timp de 30 de secunde cu 1 minut pauză.

Se repetă procedeul de 3-5 ori. După sonicare se pipetează câte 1 mL în două tuburi Eppendorf şi se centrifughează amestecul 5 min la 10000 rotaţii pe minut (rpm). Se pipetează supernatantul (partea superioară din tub) şi se foloseşte extractul (se pastrează pe gheaţă!) pentru experimentele ulterioare. Diluţia enzimei se va face în trei serii (1:100, 1:200, 1:500). Se va măsura viteza reacţiei enzimatice pentru fiecare diluţie. Cu ajutorul unui perforator se obţin rondele de hârtie de filtru. Se va imersa una dintre rondele în solutie de enzima diluată. În paralel se prepară într-un tub soluţia cu apă oxigenată 1% în tamponul pH 7 (înaltimea soluţiei va fi de 40 mm). Se imersează hârtia de filtru, care a fost imbibată în soluţia enzimei, în tubul cu substrat (apa oxigenată) şi se măsoară timpul parcurs de enzimă de la bază până la suprafaţa lichidului. Se repetă fiecare determinare de 5 ori. O soluţie de catalază (100 µL) se încălzeşte la fierbere 10 min. În paralel se incubează la temperatura camerei o soluţie cu acelaşi volum. Se repetă experimentul de mai sus utilizând o soluţie diluată (1:100) şi se compară viteza de reacţie obţinută în cele trei experimente. Se efectuează determinările de activitate folosind o diluţie 1:500 pentru enzimă şi concentraţii diferite pentru apă oxigenată (0,5; 1 respectiv 2%). Se notează timpul de reacţie. Se efectuează determinările de activitate folosind o diluţie 1:500 pentru enzimă şi valori diferite de pH (5, 7, 9, 11). Se reprezintă grafic viteza de reacţie în funcţie de pH. Se efectuează determinări de activitate folosind o diluţie 1:200, 1% apă oxigenată ăi concentraţii diferite de clorură de sodiu (0, 2, 10% NaCl în aceeaşi soluţie tampon). Se reprezintă grafic viteza de reacţie în funcţie de concentraţia de NaCl (tăria ionică a soluţiei). Opţional se poate compara viteza reacţiei (la pH 7 si dilutie 1:100) catalizată de enzima

extrasă din diverse surse: drojdie uscată, cartof, ficat. Procedeul de extracţie din toate sursele va fi identic. Intrebări:

a) Care este rolul catalazei în organism?

b) Ce efect are temperatura asupra activităţii enzimatice?

c) Cum variază viteza reacţiei enzimatice în funcţie de diluţie?

d) Cum variază viteza de reacţie în funcţie de concentraţia substratului?

e) Ce efect are pH-ul aupra activităţii enzimatice?

f) Ce efect are concentraţia sării asupra activităţii enzimatice?

Bibliografie:

1. Forbes, B. A., Sahm, D. F. şi Weissfeld, A. S (2007) Bayley and Scott’s Diagnostic Microbiology (Editia a 12-a), Weissfeld.

2. Cojocaru, D. C. (2009) Enzimologie practică, Editura Tehnopress, Iaşi.

3. Dogan, T. (2008) The e ffects of hydrogen peroxide, gallic acid and resveratrol on groth and catalase production of Aspergillus fumigatus, Master thesis, Middle East Technical University.

4. Eisenthal, R. şi Danson, M. J.(2002) Enzyme assays: a practical approach (2nd ed), Oxford University Press Inc., New York, US.

5. Goldberg, D. T. (2007) Barron's AP Biology. (2nd ed), New York, NY:Barron's Educational series.

6. Cordts, M., Ridenour, N. şi Hickey, M.K. (2008) The Properties of Enzymes: A study of catalase, Cornell University.

7. http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/catalase_lab.html

8. http://www.horton.ednet.ns.ca/staff/jfuller/selig/labs/bio12ap_adv/Catalase_paperdiscs.pdf.

9. http://www.explorebiology.com/documents/03LabEnzymeCatalysis2004.pdf

10. http://www.biologyjunction.com/ap_sample_lab_2_catalysis_2.htm