Determinarea activitii catalazei.

Influena pH-ului, temperaturii i a triei ionice asupra vitezei de reacie Peroxidul de hidrogen (H2O2) este un agent oxidant nociv, produs de corpul uman n urma oxidrii acizilor grai sau n cazul n care celulele albe sangvine atac bacteriile care pot avea efecte negative aupra metabolismului celular. Catalaza este prezent ntr-o varietate de surse: plante, fructe, carne sau ficat. De asemenea catalaza poate fi utilizat la identificarea bacteriilor. Dat fiind faptul c aceasta enzim nu este prezent n streptococi, dar este prezent n stafilococi, aceasta enzim poate fi utilizat la diferenierea dintre aceste specii. Catalaza se afl n concentraie foarte mare n organitele celulare (ale plantelor sau animale) numite peroxizomi i protejeaz astfel celula de peroxidului de hidrogen, compus care poate fi convertit n radicali hidroxil i implicit sa creeze mutaii genetice. Catalaza utilizeaz de asemenea apa oxigenat n scopul de a oxida o serie de compui toxici, incluznd fenoli, acidul formic, formaldehida sau alcoolii. Msurarea vitezei reaciei enzimatice se poate face direct (cu ajutorul unui electrod de oxigen) sau indirect. n acest experiment, viteza de reacie este masurat indirect. Pentru determinarea vitezei de reacie se utilizeaz o hrtie de filtru care este acoperit cu enzima i apoi imersat ntr-o soluie de substrat (ap oxigenat). Enzima (catalizatorul biochimic) mreste viteza de descompunere a apei oxigenate n ap i oxigen, iar moleculele de gaz formate constituie fora motrice de deplasare a hrtiei de filtru de la baza tubului la suprafa. Timpul necesar hrtiei de fitru pentru a parcurge aceast distant (de la baz la suprafat) este un indicator al vitezei reaciei enzimatice. Viteza de reacie = naltimea lichidului din vas (mm) / timp (s) Aparatura i materialele necesare: -aparat cu ultrasunete; -pHmetru; -tuburi din plastic cilindrice; -penset; -cronometru de laborator; -un cartof, mr sau cantitate mic de ficat; -plnie i hrtie de filtru; -centrifug. Reactivi: -acetat de sodiu 20 mM pH=5 -fosfat de sodiu 20 mM pH=7 -borat de sodiu 20 mM pH=9 -glicin 20 mM pH=11 Atenie catalaza este stabil la temperatura redus (pe gheata) i la pH 7! Mod de lucru ntr-un pahar Berzelius sau un tub de plastic de 50 mL se cntaresc 2 g de ficat. Se taie mrunt ficatul i se resuspend n 10 mL soluie tampon fosfat 20 mM pH 7. Se pastreaz amestecul omogen pe ghea i se supune ultrasonicrii timp de 30 de secunde cu 1 minut pauz.

Se repet procedeul de 3-5 ori. Dup sonicare se pipeteaz cte 1 mL n dou tuburi Eppendorf i se centrifugheaz amestecul 5 min la 10000 rotaii pe minut (rpm). Se pipeteaz supernatantul (partea superioar din tub) i se folosete extractul (se pastreaz pe ghea!) pentru experimentele ulterioare. Diluia enzimei se va face n trei serii (1:100, 1:200, 1:500). Se va msura viteza reaciei enzimatice pentru fiecare diluie. Cu ajutorul unui perforator se obin rondele de hrtie de filtru. Se va imersa una dintre rondele n solutie de enzima diluat. n paralel se prepar ntr-un tub soluia cu ap oxigenat 1% n tamponul pH 7 (naltimea soluiei va fi de 40 mm). Se imerseaz hrtia de filtru, care a fost imbibat n soluia enzimei, n tubul cu substrat (apa oxigenat ) i se msoar timpul parcurs de enzim de la baz pn la suprafaa lichidului. Se repet fiecare determinare de 5 ori. O soluie de catalaz (100 L) se nclzete la fierbere 10 min. n paralel se incubeaz la temperatura camerei o soluie cu acelai volum. Se repet experimentul de mai sus utiliznd o soluie diluat (1:100) i se compar viteza de reacie obinut n cele trei experimente. Se efectueaz determinrile de activitate folosind o diluie 1:500 pentru enzim i concentraii diferite pentru ap oxigenat (0,5; 1 respectiv 2%). Se noteaz timpul de reacie. Se efectueaz determinrile de activitate folosind o diluie 1:500 pentru enzim i valori diferite de pH (5, 7, 9, 11). Se reprezint grafic viteza de reacie n funcie de pH. Se efectueaz determinri de activitate folosind o diluie 1:200, 1% ap oxigenat i concentraii diferite de clorur de sodiu (0, 2, 10% NaCl n aceeai soluie tampon). Se reprezint grafic viteza de reacie n funcie de concentraia de NaCl (tria ionic a soluiei). Opional se poate compara viteza reaciei (la pH 7 si dilutie 1:100) catalizat de enzima extras din diverse surse: drojdie uscat , cartof, ficat. Procedeul de extracie din toate sursele va fi identic. Intrebri: a) Care este rolul catalazei n organism? b) Ce efect are temperatura asupra activitii enzimatice? c) Cum variaz viteza reaciei enzimatice n funcie de diluie? d) Cum variaz viteza de reacie n funcie de concentraia substratului? e) Ce efect are pH-ul aupra activitii enzimatice? f) Ce efect are concentraia srii asupra activitii enzimatice?
Bibliografie: 1. Forbes, B. A., Sahm, D. F. i Weissfeld, A. S (2007) Bayley and Scotts Diagnostic Microbiology (Editia a 12-a), Weissfeld. 2. Cojocaru, D. C. (2009) Enzimologie practic, Editura Tehnopress, Iai. 3. Dogan, T. (2008) The e ffects of hydrogen peroxide, gallic acid and resveratrol on groth and catalase production of Aspergillus fumigatus, Master thesis, Middle East Technical University. 4. Eisenthal, R. i Danson, M. J.(2002) Enzyme assays: a practical approach (2nd ed), Oxford University Press Inc., New York, US. 5. Goldberg, D. T. (2007) Barron's AP Biology. (2nd ed), New York, NY:Barron's Educational series. 6. Cordts, M., Ridenour, N. i Hickey, M.K. (2008) The Properties of Enzymes: A study of catalase, Cornell University. 7. http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/catalase_lab.html 8. http://www.horton.ednet.ns.ca/staff/jfuller/selig/labs/bio12ap_adv/Catalase_paperdiscs.pdf. 9. http://www.explorebiology.com/documents/03LabEnzymeCatalysis2004.pdf 10. http://www.biologyjunction.com/ap_sample_lab_2_catalysis_2.htm