148

Int roduc ere n l abor a torul d e bioc hi mi e

6.1.2. Determinarea activit ii catalazei. Influen a pH-ului, temperaturii i a t riei ionice asupra vitezei de reac ie Peroxidul de hidrogen (H2O2) este un agent oxidant nociv, produs de corpul uman n urma oxid rii acizilor gra i sau n cazul n care celulele albe sangvine atac bacteriile care pot avea efecte negative asupra metabolismului celular. Catalaza este prezent ntr-o varietate de surse: plante (fructe), carne sau ficat. De asemenea catalaza poate fi utilizat la identificarea bacteriilor. Dat fiind faptul c aceast enzim nu este prezent n streptococi, dar este prezent n stafilococi, aceast enzim poate fi utilizat la diferen ierea dintre aceste specii. Catalaza se afl n concentra ie foarte mare n organitele celulare (ale plantelor sau animalelor) numite peroxizomi i protejeaz astfel celula fa de peroxidul de hidrogen, compus care poate fi convertit n radicali hidroxil i implicit s creeze muta ii genetice. Catalaza utilizeaz de asemenea apa oxigenat n scopul de a oxida o serie de compu i toxici, incluznd fenoli, acidul formic, formaldehida sau alcoolii. M surarea vitezei reac iei enzimatice se poate face direct (cu ajutorul unui electrod de oxigen) sau indirect. n acest experiment, viteza de reac ie este m surat indirect. Pentru determinarea vitezei de reac ie se utilizeaz o hrtie de filtru care este acoperit cu enzima i apoi imersat ntr-o solu ie de substrat (ap oxigenat ). Enzima (catalizatorul biochimic) m re te viteza de descompunere a apei oxigenate n ap i oxigen, iar moleculele de gaz formate constituie for a motrice de deplasare a hrtiei de filtru de la baza tubului la suprafa . Timpul necesar hrtiei de filtru pentru a parcurge aceast distan (de la baz la suprafa ) este un indicator al vitezei reac iei enzimatice.
Viteza de reac ie = n l imea lichidului din vas (mm) / timp (s)

Aparatura i materialele necesare: - aparat cu ultrasunete; - pH-metru; - tuburi din plastic cilindrice; - penset ; - cronometru de laborator; - un cartof, m r sau de preferat cantitate mic de ficat;

Ac t iv it a te a e nz i ma ti c

149

- plnie i hrtie de filtru; - centrifug . Reactivi: - acetat de sodiu 20 mM pH=5 - fosfat de sodiu 20 mM pH=7 - borat de sodiu 20 mM pH=9 - glicin 20 mM pH=11 Aten ie catalaza este stabil la temperatura redus (dup ob inere extractul se p streaz pe ghea ) i la pH 7! Modul de lucru ntr-un pahar Berzelius sau un tub de plastic de 50 ml se cnt resc 2 g de ficat. Se taie m runt ficatul i se resuspend n 10 ml solu ie tampon fosfat 20 mM pH 7. Se p streaz amestecul omogen pe ghea i se supune ultrasonic rii timp de 30 de secunde. Se repet procedeul de 3-5 ori cu pauze de un minut. Dup sonicare se pipeteaz cte 1 ml n dou tuburi Eppendorf i se centrifugheaz amestecul 5 min la 10000 rota ii pe minut (rpm). Se pipeteaz supernatantul (partea superioar din tub) i se folose te extractul (se p streaz pe ghea !) pentru experimentele ulterioare. Dilu ia enzimei se va face n trei serii (1:100, 1:200, 1:500). Se va m sura viteza reac iei enzimatice pentru fiecare dilu ie. Cu ajutorul unui perforator se ob in rondele de hrtie de filtru. Se va imersa una dintre rondele n solu ia care con ine enzima diluat . n paralel se prepar ntr-un tub solu ia cu ap oxigenat 1% n tamponul pH 7 (n l imea solu iei va fi de 40 mm). Se imerseaz hrtia de filtru, care a fost mbibat n solu ia enzimei, n tubul cu substrat (apa oxigenat ) i se m soar timpul parcurs de rondeaua de hrtie de la baz pn la suprafa a lichidului. Se repet fiecare determinare de 5 ori. O solu ie de catalaz (100 l) se nc lze te la fierbere 10 min. n paralel se incubeaz la temperatura camerei o solu ie cu acela i volum. Se repet experimentul de mai sus utiliznd o solu ie diluat (1:100) i se compar viteza de reac ie ob inut n cele trei experimente.

150

Int roduc ere n l abor a torul d e bioc hi mi e

Se efectueaz determin rile de activitate folosind o dilu ie 1:500 pentru enzim i concentra ii diferite pentru ap oxigenat (0,5; 1 respectiv 2%). Se noteaz timpul de reac ie. Se efectueaz determin rile de activitate folosind o dilu ie 1:500 pentru enzim i valori diferite de pH (5, 7, 9, 11). Se reprezint grafic viteza de reac ie n func ie de pH. Se efectueaz determin ri de activitate folosind o dilu ie 1:200, 1% ap oxigenat i concentra ii diferite de clorur de sodiu (0, 2, 10% NaCl n aceea i solu ie tampon). Se reprezint grafic viteza de reac ie n func ie de concentra ia de NaCl (t ria ionic a solu iei). Op ional se poate compara viteza reac iei (la pH 7 i dilu ie 1:100) catalizat de enzima extras din diverse surse: drojdie uscat , cartof, ficat. Procedeul de extrac ie din toate sursele va fi identic. ntreb ri: a) Care este rolul catalazei n organism? b) Ce efect are temperatura asupra activit ii enzimatice? c) Cum variaz viteza reac iei enzimatice n func ie de dilu ie? d) Cum variaz viteza de reac ie n func ie de concentra ia substratului? e) Ce efect are pH-ul asupra activit ii enzimatice? f) Ce efect are concentra ia s rii asupra activit ii enzimatice?
Bibliografie: 1. Forbes, B.A., Sahm, D.F. i Weissfeld, A.S. (2007) Bayley and Scotts Diagnostic Microbiology (Editia a 12-a), Weissfeld. 2. Cojocaru, D.C. (2009) Enzimologie practic , Editura Tehnopress, Ia i. 3. Dogan, T. (2008) The effects of hydrogen peroxide, gallic acid and resveratrol on growth and catalase production of Aspergillus fumigatus, Master thesis, Middle East Technical University. 4. Eisenthal, R. i Danson, M.J. (2002) Enzyme assays: a practical approach (2nd ed), Oxford University Press Inc., New York, US. 5. Goldberg, D.T. (2007) Barron's AP Biology. (2nd ed), New York, NY:Barron's Educational series. 6. Cordts, M., Ridenour, N. i Hickey, M.K. (2008) The Properties of Enzymes: A study of catalase, Cornell University.

Ac t iv it a te a e nz i ma ti c 7. 8.

151

http://kvhs.nbed.nb.ca/gallant/biology/catalase_lab.html http://www.horton.ednet.ns.ca/staff/jfuller/selig/labs/bio12ap_adv/Ca talase_paperdiscs.pdf. 9. http://www.explorebiology.com/documents/03LabEnzymeCatalysis2 004.pdf 10. http://www.biologyjunction.com/ap_sample_lab_2_catalysis_2.htm

6.1.3. Caracterizarea polifenoloxidazei din banane Polifenoloxidazele sunt enzime responsabile pentru modificarea enzimatic a culorii (nchiderea culorii) fructelor i vegetalelor care sunt distruse / por ionate. Polifenoloxidaza din banan catalizeaz oxidarea diver ilor orto-difenoli la chinonele corespunz toare. Chinonele reactive formeaz la rndul lor n urma unor reac ii neenzimatice pigmen ii numi i melanine. Melaninele care apar n plante sunt rezultatul condens rii o-chinonelor cu aminoacizi, peptide sau proteine. Partea experimental Extrac ia enzimei Enzima activ poate fi extras din pulpa bananei cu ajutorul unui tampon care con ine un agent care are rolul de a proteja enzima de precipitare n prezen a taninurilor. Toate opera iile se desf oar pe ghea ! 4 g de fruct (banan ) se taie cu ajutorul unui cu it n buc i de dimensiuni reduse i se introduc n 36 ml de tampon (fosfat 0,1 M pH 7; r cit n prealabil pe ghea ) care con ine 1% Triton X-100 (detergent neionic). Omogenizarea se realizeaz cu ajutorul unui aparat de ultrasunete (3 ori, 2 min, amplitudinea 50%, 1 s sonicare, 1 s pauz ), dup care se centrifugheaz timp de 10 min la 5000 rpm. Supernatantul se folose te pentru determinarea activit ii enzimatice ulterioare. Determinarea activit ii enzimatice Activitatea enzimei se poate determina prin m surarea producerii chinonelor corespunz toare. Astfel, dac pentru dopamin (10 mM) se urm re te formarea 2,3-dihidroindol-5,6-chinonei, un produs de culoare ro ie (470 nm), pentru orto-difenol (10 mM) nesubstituit activitatea se m soar la 412 nm (colora ie galben -portocalie). Activitatea catalitic se nregistreaz timp de 2-3 min la 25 C. n general, dilu ia enzimei este de 1:20. n cazul m sur torilor de activitate este necesar