Determinarea activitii fosfatazei alcaline folosind ca substrat

p-nitrofenilfosfatul

Noiuni teoretice:
p-Nitrofenil fosfatul este un substrat cromogenic pentru majoritatea fosfatazelor (alcalin i
acid). Principiul acestei lucrri se bazeaz pe faptul c sub aciunea fosfatazei alcaline p-
nitrofenil fostaful este hidrolizat n fosfat anorganic si p-nitrofenol.

p-Nitrofenil fosfatul d n mediul alcalin o coloraie galben uor msurabil la 405 nm la un

spectofotometru.

Fosfataza alcalin este o enzim care se gaseste n cantiti mari n ficat i oase dar poate fi
ntlnit i n placent i intestine.

Reactivi i materiale:
Ficat de pui (care conine fosfataza alcalin);

Tampon glicocol pH 10,51;

NaOH 0,5 M;

Substrat: p-Nitrofenil fosfat n soluie tampon glicocol pH 10,51

1. Stativ cu eprubete;
2. Pipete gradate;
3. Tuburi Falcon
4. Blender
5. Centrifug
6. Pahar berzelius
7. Agitator magnetic

Mod de lucru:
Se mrunete i se cntrete bucata de ficat astfel nct s aveam 5 g ficat de pui. Dup
ce am cntrit se pune n blender mpreun cu 50 ml tampon glicocol pH 10,51 i se
mixeaz cu grij s nu fac spum. Coninutul se pune ntr-un tub Falcon i se pun la
centrifugat timp de 15 minute la 5 500 rotaii pe minut. Coninutul (supernatantul) l-am
 pus ntr-un pahar Berzelius iar depunerea am aruncat-o. Apoi se prepar soluia substrat,
pentru aceasta se cntrete 0,04 g de p-nitrofenil fosfat, peste acesta se adaug 10 ml
tampon glicocol pH 10,51, apoi soluia se pstreaz ntr-un tub Falcon. n eprubeta pe
care am nontat ,, EPT ficat vom dilua de 50 x ept-ul din ficat care conine fosfataza alcain
astfel: - se pipeteaz 4,9 ml tampon glicocol pH 10,51 peste care se adaug o,1 ml ept ficat.
Proba din aceast eprubet se va citi la spectofolometru, martorul fiind acela i de la p-nitrofenil
fosfatul acid. n cuva de sticl vom pipeta 1,9 ml p-nitrofenil fosfat n tampon glicocol peste care
vom aduga 0,1 ml ept diluat de 50x astfel se formeaz p-nitrofenol fosfat. Dup ce am pipetat
se nchide repede capacul spectofotometrului i dm citire.
I. Prima dat dup 300 am observat c concentraia de enzim este foarte mic i viteza
cu care transform este foarte slab.
II. A doua oar am adugat o concentraie de enzim mai mare: 0,1 ept brut + 1,9 ml
substrat.

Calcularea rezultatelor:

Reactivi Proba Martor

Substrat 1,9 1,9
Solutie enzima
(EPT) 0,1 -
Interval de timp 0,08
Extinctia la 405
nm 1822
U 21101037500
 Determinarea activitii fosfatazei acide folosind ca substrat p-
nitrofenilfosfatul

Noiuni teoretice:
Fosfataza acid este o enzim care se gsete n prostat, intestin, eritrocite, sistemul osos, lapte.

Fosfatazele acide hidrolizeaz diferii esteri ortofosforici sau fosfoamide. Pirofosfaii de tipul
ATP i ADP nu sunt hidrolizai.

Enzima poate fi extras din esuturi vegetale sau animale, serul sanguin uman, etc.

Activitatea fosfatazei acide din prob este deterninat prin msurarea vitezei de hidroliz a p-
nitrofenilfosfatului.

Cantitatea de p-nitrofenol eliberat este dozat la 405 nm.

Reacia enzimatic este stopat prin adugarea de hidroxid de sodiu.

Reactivi i materiale:
Extract proteic total (EPT) din cartof

Tampon acetat pH 5,64

NaOH 0,5 M

Substrat: p-Nitrofenil fosfat n soluie tampon acetat pH 5,64

1. Stativ cu eprubete;
2. Pipete gradate;
3. Tuburi Falcon
4. Blender
5. Centrifug
6. Pahar berzelius
7. Agitator magnetic

Mod de lucru:
 Se mrunete cartoful deja decojit n fragmente ct mai mici. Se pune 5 grame de cartof
mrunit la mixat n blender peste care se adaug 50 ml de tampon acetat la pH 5,6
preparat astfel:
ntr-un pahar Berzelius se adaug 5,65 ml acid acetic 1 M i 0,26 ml NaOH 0,5
M, apoi se adaug ap distilat pn la semn (pn la 60 de ml) i se regleaz pH-ul.
Pornim pH-metrul, verificm pH-ul i observm c pH-ul nostru este 2,70. Pentru a urca
valoarea pH-ului se pipeteaz NaOH i se verific din nou valoarea pH-ului. Se repet
procedeul pn la obinerea pH-ului de 5,64. Dup ce am stabilit pH-ul vom completa cu
ap distilat pn la 100 ml.
Cartoful mpreun cu soluia tampon se mixeaz cu grij ca s nu fac spum.
Extractul obinut se pune ntr-un tub Falcon i urmeaz a fi centrifugat timp de 15 minute
la 5 500 de rpm.
ntre timp pregtim 5 eprubete. O eprubet va fi martor , iar pe celelalte le vom numerota
de la 1 la 4. n eprubeta martor vom pipeta 1 ml p-nitrofenil fosfat, adaugm 1,5 NaOH
0,5 M,pentru a mpiedica reacia enzimatic, apoi se adaug 0,1 ml EPT din cartof care
conine fosfataza acid.
Acum pentru fiecare din cele 4 eprubete vom varia timpul astfel nct s putem observa
activitatea enzimatic la diferite intervale de timp.
n epubeta P1 se pipeteaz 1 ml p-nitrofenil fosfat, peste care se adaug 0,1 ml
EPT din cartof i se agit. Se las s acioneze 1 minut pentru a vedea dac are loc
reacia. Dup 1 minut se pipeteaz 1,5 ml NaOH 0,5 M pentru a stopa reacia i agitm
din nou.
n eprubeta P2 vom pipeta 1 ml p-nitrofenil fosfat, adugm 0,1 ml EPT i
agitm. Se las s reacioneze 3 minute. Dup 3 minute se pipeteaz 1,5 ml NaOH 0,5 M
pentru a stopa reacia i agitm din nou.
n eprubetele P3 i P4 se repet acest procedeu doar c difer timpul de incubare.
Astfel, n eprubeta P3 se las sa reacioneze cele 2 soluii timp de 5 minute, iar in cazul
eprubetei P4, 7 minute, dup care se stopeaz reactia prin pipetarea a 1,5 ml NaOH0,5 M
n fiecare din cele 2 eprubete.
Dorim s aflm extincia probelor noastre, de aceea vom citi coninutul din
eprubete la spectofotometru. Vom lucra cu cuve de sticl. Acestea se cltesc pe rnd cu
ap distilat nainte i dup folosire. O cuv va fi martor, n aceasta vom turna proba din
eprubeta martor. n cealalt cuv vom turna proba din eprubeta P1. Se pun cuvele n
specofotometru i dm citire. La fel vom proceda i cu Eprubetele P2, P3 i P4, martorul
rmnnd acelai pentru fiecare din cele 4 probe.

Calculul rezultatelor:
 Reactivi
P1 P2 P3 P4 Martor
p-Nitrofenil fosfat
(mL) 1 1 1 1 1
EPT (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 -
Incubare(min) 1 3 5 7 -
NaOH 0,5 M (mL) 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5
Ept (fosfataza acid) 0,1
Extincia la 405 nm 1,006 1,088 1,188 0
Volum final (mL) 2,6 2,6 2,6 2,6
Activitatea
enzimatic(AE) 1,412 0,509 0,333 0
AE medie 0,563