LUCRAREA PRACTICA NR.

Fracționarea proteinelor dintr-un EPT prin

precipitări cu solvenți organici (acetona)
În extractele proteice apoase, coexista împreună cu enzima pe care vrem să o separăm
și să o analizăm și alte enzime, proteine cu mase moleculare și încărcări electrice diferite,
acizi nucleici, nucleotide, poliglucide, electroliți etc. Aceste substanțe care coexista împreună
cu enzima de separat, pot fi îndepărtate treptat din EPT prin diverse procedee:
- Precipitarea cu solvenți organici
- Precipitarea cu săruri neutre
- Dializa
- Termoprecipitare
- Precipitarea la pH izoelectric etc.
Adăugarea solvenților organici, miscibili cu apa, într-un EPT afectează puternic
solubilitatea speciilor moleculare proteice.
Acțiunea precipitantă a solvenților organici (ex: acetona, etanol, metanol,
coloroform) se datorează scăderii constantei dielectrice a mediului (D). respectiv creșterii
forțelor de atracție electrostatică ( F) dintre moleculele proteice polare, încărcate cu sarcini
de semn contrar aflate la distanța r, precipitându-le din soluție.
Ecuația lui Coulomb:
Q1 x Q2
F=
D x r2
Moleculele proteice sunt polielectroliți, care in amestecul apă-solvent D= 80.
Condițiile pe care trebuie să le îndeplinească un solvent organic pentru a putea fi utilizat in
precipitarea proteinelor:
1. Să fie miscibil cu apa
2. Să aibă D cât mai mică pentru a scădea D a mediului
3. Acțiune denaturantă cât mai mică.
În cazul unui amestec de proteine cu o încărcătură electrică și o distribuție a sarcinilor la
suprafața structurilor tridimensionale diferită, precipitarea lor se va realiza diferențiat la
diferite constante dielectrice ale mediului, respectiv la concentrații diferite ale soventului
organic.
Principiul metodei
Într-un EPT din hrean ținut pe baie de gheața se adaugă în picatură, sub agitare, acetonă până
se ajunge la o concentrație în solventul organic de 30% (V/V), când va precipita o primă
fracție de proteine, amestecul este supus centrifugării (10 min la 6000 r.p.m); precipitatul se
reia în volum minim de apă distilată sau NaCl 0,9% și reprezintă fracția F1, iar la restul de
supernatant se adaugă o nouă cantitate de acetonă în aceleași condiții, până se ajunge la o
concentrație în solventul organic de 60% (V/V), când va precipita o a doua fracție de
proteine; amestecul este supus centrifugării (10 min la 6000 r.p.m); precipitatul se reia în
volum minim de apă distilată sau NaCl 0,9% și reprezintă fracția F2, iar la restul de
supernatant se adaugă o nouă cantitate de acetonă în aceleași condiții, până se ajunge la o
concentrație în solventul organic de 90% (V/V), când va precipita cea de-a treia și ultima
fracție de proteine; amestecul este supus centrifugării (10 min la 6000 r.p.m); precipitatul este
reluat în volum minim de apă distilată sau NaCl 0,9% reprezintă fracția F3.
Ultimul supernatant nu ne mai interesează d.p.d.v. al lucrării dar ii vom recupera acetona.
La fracțiile rezultate li se determină proteinele prin metoda Lowry și AE a peroxidazei prin
metoda lui Brad.
Reactivi și soluții
1. EPT din hrean, raport de extracție 1:10, în apă distilată
2. Acetona
3. Reactivi de dozare a proteinelor prin metoda Lowry
4. Reactivi de determinare a AE a peroxidazei prin metoda lui Brad.
 Fracționarea proteinelor dintr-un EPT prin precipitări cu
săruri neutre (NH4)2 SO4
Precipitarea proteinelor cu ajutorul concentrațiilor mari de sare se datorează faptului că
ionii sării îndepărtează mare parte din moleculele de apă care în mod obișnuit hidratează
suprafața proteinelor, fenomen ce conduce în final la precipitarea acestora din soluție.
În cazul unei proteine/enzime pe care vrem să o separăm, solubilitatea ei crește
proporțional cu concentrația de sare adăugată (fenomen numit salting – in), atinge o valoare
maximă, după care scade treptat pănă când precipită din soluție (fenomen numit salting – out).
Între solubilitatea unei proteine/ enzime (S) și tăria ionică (µ) a unei soluții saline
există următoarea relație matematică :

Log S = β – KS x µ

Condițiile pe care trebuie sa le îndeplinească o sare neutră pentru a fi utilizată în precipitarea

proteinelor/ enzimelor:
1. Să prezinte o mare solubilitate în apaă pentru a permite obținerea unei game într-un
domeniu larg de concentrații la care să precipite diferențiat proteinele/ enzimele din
amestec.
2. Prin dizolvarea sării neutre în mediul apos sa nu aibă loc procese exoterme.
3. Sarea neutră să nu interacționeze chimic cu proteinele/ enzimele de separat fracționat.
Cele mai utilizate săruri neutre sunt: (NH4)2 SO4 , Mg SO4, Na2 SO4 etc.

(NH4)2 SO4 este cel mai preferat deoarece:

1. Are cea mai mare solubilitate 70,6 g se pot dizolva în 100 mL H2 O la 0 grade
Celsius.
2. Prezintă un efect protector al enzimelor.
Principiul metodei
Într-un EPT din hrean se adaugă (NH4)2 SO4, sub agitare, până se ajunge la o concentrație în
sarea neutră de 30%, când va precipita o primă fracție de proteine, amestecul este supus
centrifugării (10 min la 6000 r.p.m); precipitatul se reia în volum minim de apă distilată sau
NaCl 0,9% și reprezintă fracția F I, iar la restul de supernatant se adaugă o nouă cantitate de
(NH4)2 SO4, în aceleași condiții, până se ajunge la o concentrație în sarea neutră de 60%,
când va precipita o a doua fracție de proteine; amestecul este supus centrifugării (10 min la
6000 r.p.m); precipitatul se reia în volum minim de apă distilată sau NaCl 0,9% și reprezintă
fracția F II, iar la restul de supernatant se adaugă o nouă cantitate de (NH4)2 SO4 în aceleași
condiții, până se ajunge la o concentrație în sarea neutră de 90%, când va precipita cea de-a
treia și ultima fracție de proteine; amestecul este supus centrifugării (10 min la 6000 r.p.m);
precipitatul este reluat în volum minim de apă distilată sau NaCl 0,9% reprezintă fracția F III.
Ultimul supernatant nu ne mai interesează d.p.d.v. al lucrării și îl aruncăm.
La fracțiile rezultate li se determină proteinele prin metoda Lowry și AE a peroxidazei prin
metoda lui Brad.
Reactivi și soluții
1. EPT din hrean, raport de extracție 1:10, în apă distilată
2. (NH4)2 SO4.
3. Reactivi de dozare a proteinelor prin metoda Lowry
4. Reactivi de determinare a AE a peroxidazei prin metoda lui Brad.