LUCRAREA PRACTICA NR.

Separarea peroxidazei dintr-un EPT din hrean prin

termoprecipitare
Acest procedeu permite izolarea doar a enzimelor/proteinelor termostabile (care
rezista la temperaturi peste 500C), în condițiile în care restul proteinor denaturate precipită.
Majorittatea proteinelor/enzimelor peste temperatura de 400C devin instabile și se
termodenaturează (sunt termolabile). Pe baza temperaturii diferite de precipitare, putem
separa dintr-un maestec o proteină care ne interesează, cu condiția ca proteina să fie
termostabilă.
Peroxidaza este o enzimă termostabila care are temperatura optimă cuprinsă între
T o = 600C- 800C.

Principiul metodei
Se pun în 3 eprubete câte 3 mL de EPT din hrean, care vor fi supuse incubării la temperaturile
de 50 0C, 60 0C și 700C, timp de 10 min. Dupa terminarea incubării, amestecul din cele trei
eprubete se supune centrigugării 15 min la 6000 rpm. Precipitatul rezultat se aruncă deoarece
reprezintă proteine termodenaturate, iar supernatantul reprezintă fracțiile: F500C, F600C și

F700C care vor fi supune analizei (se determină proteinele prin metoda Lowry și AE a
peroxidazei prin metoda lui Brad).

Reactivi și soluții
1. EPT din hrean, raport de extracție 1:10, în apă distilată
2. Reactivi de dozare a proteinelor prin metoda Lowry
3. Reactivi de determinare a AE a peroxidazei prin metoda lui Brad.
 MOD DE LUCRU

3 mL EPT 3 mL EPT 3 mL EPT

Încalzire 10 min Încalzire 10 min Încalzire 10 min

la 500C la 600C la 700C

răcire răcire răcire

Centrigugare Centrigugare 15 pp se Centrigugare 15 pp se

pp se
15 min la
aruncă
min la aruncă min la aruncă
6000 r.p.m 6000 r.p.m 6000 r.p.m

supernatant supernatant supernatant

LOWRY LOWRY LOWRY

F 500C BRAD F 600C BRAD F 700C BRAD
 Separarea peroxidazei dintr-un EPT din hrean prin
precipitare izoelectrică
La pH izoelectric suma sarcinilor pozitive ale unei proteine / enzime este egala cu suma
sarcinilor negative, dispar repulsiile electrostatice între moleculele vecine ale aceleiași specii
moleculare proteice, ele precipitând din soluție. La pH izoelectric proteinele nu migrează în
câmp electric.
Principiul metodei
Separarea peroxidazei dintr-un EPT din hrean prin precipitare izoelectrică se realizează
prin aducerea pH ului amestecului la valoarea de 7,2, care este pH ul izoelectric al peroxidazei.
Aceasta va precipita din soluție, centrifugăm amestecul, supernatantul se aruncă, iar
precipitatul este resolubilizat într-o soluție tampon acid acetic-acetat de Na 0.1 M, pH = 4,5 și
reprezintă fractia FpH izoelectric.
Reactivi și soluții
1. EPT din hrean, raport de extracție 1:10, în apă distilată
2. Soluție tampon acid acetic-acetat de Na 0,1 M, pH = 4,5.
3. Reactivi de dozare a proteinelor prin metoda Lowry
4. Reactivi de determinare a AE a peroxidazei prin metoda lui Brad
MOD DE LUCRU

10 mL EPT

Adăugare NaOH 0,1 M, sub agitare

până se ajunge în solutie la pH= 7,2

Centrigugare 15 min la supernatantul

6000 r.p.m se aruncă

pp reluat în vol de
3 mL sol.tampon ac.acetic- acetat de Na
0,1 M, pH =4,5

LOWRY

F pH izoelectric BRAD
 REZULTATE
Determinarea proteinelor prin metoda Lowry
V Dil DO Cp PT
(mL) Λ= 660nm (mg/mL) (mg)

EPT 3/10 1/50 0,215

F500C 3 1/10 0,38
F600C 3 1/10 0,201
F700C 3 1/10 0,168
FpH 3 1/10 0,590
izoelectric

Concentrația proteică (mg/mL) = [ DO λ660 nm – 0,0472 / 0,0034 ] x diluția x 10-3

PT = Cp x V

PT F500C + PT F600C + PT F700C

ŋ termoprecipitare = x 100 =
PT EPT inițial

PT pHi
ŋprecipitare izoelectrică = x 100 =
PT EPT inițial
 REZULTATE
Determinarea AE a POX prin metoda lui Brad
V AE AES AET Fp
(mL) (µmoli/mL/min) (µmoli /mg) (µmoli)

EPT 3/10 20

F500C 3 0,12

F600C 3 1,1

F700C 3 2

FpH 3 18
izoelectric

AES = AE/ Cp
AET = AE x V
Fp = AES F cu valoarea cea mai mare/ AES EPT inițial
AET F500C + AET F600C + AET F700C
ŋAE termoprecipitare = x 100 =
AET EPT inițial

AET
pH izoelectric
ŋAE precipitare izoelectrică = x 100 =
AET EPT inițial