'/

RE,ACTII DE IDENTIFICARE PENTRU GLUCIDE (1)

Giucidele se clasificd in funcfie de complexitatea lor in oze qi ozide, qi anume:

I. Oze: - glucide simplecumoleculdnehidrolizabild'
2. Ozide: - glucide complexe care la hidrolizd elibereaz[ ozele componente. Ozidele dup6 tipul

ozelor eliberate sunt:

a) otigozide(oligoglucide) - elibereaz[ un numdr mic de oze, identice sau diferite;

b) poliozide(poliglucide) - elibereaz[ un num[r mare de oze , idsntice sau diferite.

Identificarea diferitelor tipuri de glucide se face in funclie de complexitatea 1or.

A. Identilicarea ozelor
Deoarecs sunt compuqi cu func{iuni mixte ozele vor prczettaproprietdfi chimice caracteristice

grupdrii atdehid sau cetond pi proprietd{i caracteristice grupdrli alcool. Aceste propritfigi permit
identi{icarea qi diferentierea diferitelor oze prin reacfii de culoare (a), oxido-reducere (b) Si condensare

@.

a. Reac{ii de culoare
1. Reacfia Molisch (cu ct - naftol)
Reaclia Moliscir este o reaclie comundpentozelor Si hexozelor, este reaclia azelar cu fl - naftol
in prezenla acizilor minerali concentrafi. Pentozele tratate cu H:SO+ conc. se transformd in furfural iar

hexozele in hidroximetil-furfural, care prin condensare cu cr - naftol duc la formarea unor compuqi
'colorati in rosu-t'io let.

HO-HC-CH_OH
lt "n-["
,,J t*,-.ro
HrSOa
-3HzO "tort-t'o
/"
":
arabinozI furfural

HO.H G_c H-OH

Ir HzSO+ _> ,Q
"n-r
H TT H-CHO 3 L12O
no-cf, \o/
,c-cHo

rio- cHz
"\/"
glucozI HM-furfural
 OH OH OH

)dD
\
"n-[
HCC
\o/
:r".'ed) HZSO+
- }lzo
(
CH

il t
):,
o--.--l

*Hro
@eDv
\z C
v

):,
o----l
compus roqu-violet

2. Reacfia Thomas (cu p-naftol)

Reac{ia Thomas este o reac{ie de diferealiere a peatozelor de hexoze,este reac{ia lor cu B-naftol
in prezenta acizilor minerali concentra{i. Pontozele tratate cu H2SOa conc. se transformfi in furfural iar

hexozele in hidroximetil-furfural, care prin condensare cu B-naftol duc la formarea unui compus
colorat in albastru (pentru pentoze) respectiv tn verdeQtentrahexoze).

Pentore r-{zSO{c - Furfirral B-naftol r. corrpus albastru

HZSO4o
Hexore _ HM_Furfin4 B-naftol _ conpus verde

3. Reac{ia Seliwanoff (cu rezorcinf,)

Reac{ia Seliwanoff este o reaclie de diferen{iere a cetozelor de aldoze,este reacfia cetozelor cu

rezorcind, tn prezenfa acizilor minerali concentra{i, la temperafur[. Se formeazi un compus colorat in

rosu intens.tn conditiile de reactie aldozele nu reaction eazd .

,/oH
HC-CH ()
ltll + -\H
,r'c,
HO-CH2 \ O'
/c-cHo H

\oH

2
 4. Reacfia Bial (cu orcinol)
Reac{ia Bial este o reac{ie de diferenliere a pentozelor de hexoze;in cazul pentozelor se
formeazd un compus colorat in verde, iar in cazul hexozelor compusul format este incolor qi nu
prezinti importanf6 analiticX.

T-["
rr c-cHo +2 -LtzO
tC
H:C
\o/ -_->
H

pentozi compus verde

HC-CH
ltll BiaL t C
HCOOH + H3C-CO -CIL.-CH2-COOH
,/c,
HO-CHz \O'
/c-cHo acll levulic
irpolor

hexozi
b. Reacfii de oxido-reducere
1. Reacfia Fehling
Reacfia Fehling este reacfia ozelor cu oxidul cupric pe caro il reduc in mediu alcalin si la cald la
oxid cupros, precipitat roSu-cdrdmiziu.

CuSOa + 2NaOH ----) Cu(OH)2J + NazSO+

tarhat de sodiu
Cu(oH)2 J CuO + H2O
sl potasu

R-CHO +2CuO tC, R-COOH +Cu:OJ

Reacfia Fehling este folositd qi in determinarea cantitativd a glucidelor.

2. Reacfia Tollens

. Reac{ia Tollens este reac{ia ozelor cu hidroxidul de.argint amoniacal, in mediubazic, la

temperatur[, ducdnd la formarea argintului metalic. Deoarece argintul se depune pe perefii epmbetei ca
o peliculfl, reacfia este cunoscut6 sub denumirea d e '?eac{ia oglinzii de argint".
AgNO3 + NaOH ---------) AgOH + NaNO:

2 AgOH AgzO J + UrO

-=-r
 \
\
AgzO { + qNH3 + H2O 2 [Ag(].{H3)zlOH (reactivToltens)
-----+
R-CHO+ 2[Ag(NH:)z]OH tC , ZAg+4NH3 +H2O+R-COOH

3. Reac{ia cu acidul picric

Reacfia cu acidul picric, in mediu bazic,este o reacfie de oxidare a azelor
picric se reduce la acid picramic culoarea celui din urmr fiind rosie.

ozN NOZ u'

ozN NHz
,7O C
3R-C- + + 3 NaOH
t -zzO
R-Ct' +
\s 3
\oN*
+ 2H2O

Noz

ac. picric (galben) ac. picramic (roqu)

c. Reacfii de condensare
1. Formarea osazonelor
Ozele reacfioneazd cu fenilhidrazina in mediu de acid acetic Ai la cald eu formare de osazone.

Osazonele sunt substante gal benecristalizate caracteristic.

HCl:O Hf:N-NH-coHs HC:N-NH-CoHs

H[ -oH HC-OH
I

C:O
H2N-NH-C6H5
no_Js HzN-NH-coHs_
I
I
HO-C H HO-CH
-IDO
I

)H
C H-Ol
I -NH: I

-NH2-G6H5 CH-OH
I

f,H
C H-Ot
?H-oH I

CH-OH CH-OH
I
I
C Hzo
OH I
CH2OH CH2OH

HC=N-NH-COHs
I

C,:N-n-H-C6H5
I

H2N-NH-Cl6H5 HO-CH
- Hzo I

CH.OH
I

CH.OH
I

CH2OH

osazono (cristale galbene)

Ozele epimere (glucoza, fructoza,manoza) formeazl,osazono cristalizate identic.
 Reacţii de identificare ale ozelor

Partea experimentală

Reacţiile de culoare
Unele dintre reacţiile de culoare prezentate sunt comune pentozelor şi hexozelor, sau
aldozelor şi cetozelor, iar altele permit diferenţierea lor. Aceste aspecte sunt importante în
utilizarea reacţiilor de culoare pentru determinările cantitative ale glucidelor.

Astfel:
1. reacţia Molisch (cu -naftol în prezenţa acidului sulfuric concentrat) duce la apariţia
unui inel roşu-violet; reacţia este comună pentozelor şi hexozelor;

2. reacţia Thomas (cu β-naftol în prezenţa acidului sulfuric concentrat) duce la apariţia unui
inel albastru dacă pornim de la pentoze şi la apariţia unui inel verde dacă pornim de la
hexoze; reacţia permite diferenţierea pentozelor de hexoze;

1
3. reacţia Seliwanoff (cu rezorcină în prezenţa acidului clorhidric concentrat) duce la
apariţia unui precipitat roşu intens; reacţia permite diferenţierea cetozelor de aldoze fiind
pozitivă doar în cazul cetozelor;
4. reacţia Bial (cu orcinol în prezenţa acidului clorhidric concentrat) duce la apariţia unui
compus solubil colorat în verde; reacţia permite diferenţierea pentozelor de hexoze fiind
pozitivă doar în cazul pentozelor.

Reacţii de oxido-reducere
Reacţiile de oxido-reducere date de glucide au utilitate practică atât în determinările calitative
cât şi în cele cantitative ale acestor compuşi.

Astfel:
1. reacţia Fehling (cu sulfat de cupru, în mediu bazic şi în prezenţa tartratului de sodiu şi
potasiu) duce la apariţia unui precipitat roşu-cărămiziu; reacţia este foarte utilizată în
determinările cantitative ale glucidelor;
2. reacţia Tollens (cu hidroxidul de argin amoniacal) duce la depunerea argintului metalic
pe pereţii eprubetei;
3. reacţia cu acidul picric (în mediu bazic) duce la apariţia unui compus solubil colorat în
roşu; reacţia poate fi utilizată în determinările cantitative ale glucidelor prin metodă
spectrofotometrică.

2
Reacţii de condensare
Reacţiile de condensare sunt utilizate mai ales în determinările calitative ale glucidelor.

Exemplu:
1. reacţia cu fenilhidrazină (în mediu de acid acetic) duce la apariţia unor precipitate de
culoare galbenă; cristalizarea este diferită în funcţie de oza prezentă în mediu de reacţie.

Cristale de glucosazonă

3
 RE,ACTTI DE IDENTIFICARE PENTRU GLUCIDE (2)

Identfficarea ozidelor
Cele mai simple ozide sunt diglucidele care so formeazd"prin eliminarea unei molecule de apd

intre doufl oze identice sau diferite. Diglucidelepotft reducdtoaresaa nereducdtoare.

Diglucidele reducdtoare - se formeazd" prin eliminarea unei molecule de ap[ inhe hidroxilu]
semiacetalic al unei oze qi un hidroxil de tip alcool a celei de a doua oze.

Exemple:Maltoza,Izomaltoza,Lactoza,Celobioza.
Diglucidele nereducdtoare - se forrneazd, prin eliminarea unei molecule de ap[ intre cei doi
hidroxili semiacetalici ai ozelor componente.
Exemp le : Zahar o za, T r ehaloza.

Diglucidele reducdtoare dau reacfiile specifice ozelor deoarece preztntd, un hidroxil

semiacetalic liber. Diglucidele nereducltoare pot da qi ele reac{iile specifice ozelor doar dupd o
prealabilShidroliz[.

l.Reacfie de diferenfiere a monoglucidelor de diglucidele reducfitoare (testul

Barfoed ).
in urma reacfiei ozelor reducdtoare cu acetatul de cupru se formeazd acizi onici qi oxid
cupros de culoare roqu-cdrdmiziu.Diglucidele reducdtoare nu reactioneazdat acetafirl de cupru.

R-CHO + 2(CH3-COO)2Cu +2H2O ---------+ R-COOH + 4CH3-COOH + Cu2OJ,

(ro;u-cdrdmiziu)

maltoza + 2(CH3-COO)2Cu
+--
2. Invertir ea zahar ozei
Zaharozanu prezint[ propriet5{i reduc[toare, ?ns[ prin.hidrolizb acidd.,bazicd sau enzimaticd

trece intr-un amestec de u - glucozd;i p - fructozdcu propriet[{i reducdtoare. Prin hidrolizd se modificd
sensul activit[{ii optice (zaharoza este dextrogir[ iar amestecul de oze rezultatare caracter levogir)
motiv pentru care reaclia se mai numeqte invertirea zaharozei iar produsul obfinut se numeqte zahdr
invertit.
 cH2oH fc
HrO (H*)
Ilrrr€fil-REt->

[o]'oo:66,5" luf2oo:52,5" [,t]'or: - 93o

[o]2oo: -40,5"
Din categoria ozidelor importante sunt qi poliglucidele. Specifice regnului vegetal sunt
poliglucidele: ami don qi ce lulozd.
in amidonmoleculele de cr -glucoz[ suntlegate o-glicozidic.

n CoHrzOo ---------) (CoHroOs)n xH2O + (n - 1)H2O

Granula de amidon este format[ din dou[ componente: ami]ozd qi amilopectind. Amlloza
prezintd, o structurd liniar[ deoarece moleculele de oc -glucozb sunt legate doar a - 1,4 glicozidic.
Amilopectinaprezintd"o structurlramificatd deoarece moleculele de cr -glucozd sunt legate atdt u - 1,4
glicozidic cdt ;i a - I, 6.

1. Reac{ia amidonului cu iodul

Iodul este absorbit in re{eaua de structur[ a amidonului formind compugi de incluziune colorali
in albastru. Colorajia dispare la cald Ei reapare la rece.

2. Hidroliza amidonului
inprezentp acizllor minerali amidonul este hidrolizattreptatp6nd la a -glucozd,. Pe parcursul

hidrolizei apar compuqi intermediari numili dextrine. Dextrinele cu iodul dau compuqi colora{i
caracteristic. Amidonul nu are caractqreducfltor. Prin hidrol izdtotalilse formeaz d, a -glucoza care are
caracter reduc[tor. La sf6rqitul reacliei caracterul reducitor al glucozei formate este pus in eviden![
prin reacfia cu reactir,ul Fehling.
lq
Amidon albastru

*Iiooextrine ,", violet

.r{lllu*o ine --L--+ ropu
u,Ll,L..oine l' > satben
lt
*lflJa*oine > incotor
or}f,lra l. , ineoror
o -lj,l"ora FqHLtN& > cuzo I (ropu-cdrdmizit)

2
 in celulozdmoleculele de p - glucozd sunt legate doar p - 1,4 glicozidic. Caurmare celuloza

are o structurl liniar[, ceea co determin[ insolubilitatea sa in ap[.

1. Solubilizarea celulozei

Celuloza se dizolvd in hidroxid tetraamoniacocuprie numitqi reactiv Schweitzer.

CuSO+ + 2NaOH ---------) Cu(OH)2.1, + NazSO+

cu(oH)2J + +ttrtt+oH ---------) [cu0{H3)a](oH)z + 4HzO

reactiv Schweitzer
Fiecare rest de glucoz[ din molecula celulozei confine trei grupe hidroxil libere. Atomii de
cupru din reactivul Schweitzer se leag6 de resturile de glucozil prin dou[ grupe HO- iar a treia grupa
HO- se rorizeazd. Compusul astfel rezultat devine solubil.
 Reacţii de identificare ale ozidelor

Partea experimentală

Reacţiile diglucidelor
Reacţiile diglucidelor se bazează pe caracterul lor reducător sau nereducător.

Exemple:
1. testul Barfoed (cu acetat de cupru în mediu de acid acetic) permite diferenţierea
monoglucidelor de diglucide reducătoare; doar în cazul monoglucidelor reacţia este
pozitivă ducând la formarea unui precipitat roşu-cărămiziu de oxid cupros;
2. invertirea zaharozei, diglucid nereducător duce la obţinerea unui amestec de -glucoză
şi β-fructoză, numit zahăr invertit, cu proprietăţi reducătoare.

Reacţiile poliglucidelor
Poliglucidele nu au caracter reducător, dar prin hidroliză totală se descompun în ozele
componente, ce prezintă caracter reducător.

Exemple:
1. reacţia amidonului cu iodul duce la apariţia unui compus de incluziune al iodului în
reţeaua structurală a amidonului, colorat în albastru;
2. hidroliza amidonului (în prezenţa acizilor minerali concentraţi) se face treptat, cu
apariţia unor intermediari numiţi dextrine; în reacţie cu iodul dextrinele formează
compuşi de incluziune, coloraţi diferit, ceea ce permite identificarea dextrinelor şi
urmărirea gradului de hidroliză; glucoza formată prin hidroliză totală poate fi
identificată prin reacţia Fehling;

1
3. solubilizarea celulozei se poate face doar în prezenţa reactivului Schweitzer.

2
{

REACTII DE IDENTIFICARE ALE PROTIDELOR

Protideledin punct de vedere al compozi{iei sunt substanle cuatemare care con{in: C,

H, O qi N. Unitatea structurald debazil a lor este aminoacidul. Prin policondensarea a-amino-

acizllor (eliminarea unei molecule de ap[ intre gruparea carboxil a unui aminoacid qi gruparea
amino a altui aminoacid) se formeazd diferite tipuri de protide. Legdtura dintre doi aminoacizi
se numeEte legdturd peptidicd.

H,N-?H-CooH+H2N-fH-CooH----------)H,N-F@.?H-CooH+Hzo
Rr Rz Rr R2

aminoacid aminoacid dipeptid6

Protidele pot fi clasificate astfel:

- a-aminoacizi;

- peptide -+ oligopeptide(numilrmic de aminoacizi;2-10);

--> polipeptide(rumdr mare de aminoacizi; de ordinul sutelor);

- proteide -+ holoproteide (proterne);

-+ heteroproteide.
Aminoacizii qi peptidele se pot identifica doar prin reaclii de culoare iar proteinele

at0t prin reactii de culoare c0t qi prin reac{ii de precipitare.

Reac{ii de identificare a proteinelor

A. ReacJii de culoare
Reactiile de culoare folosite la identificarea proteinelor sunt date de prezen[a
diferililor aminoacizi constituenfi, respectiv de prezenla anumitor gupdri funclioaale in
skuctura aminoac izilor.
 1. Reaclia biuretului
(cu cel pu{in
irprezenlasulfatului de cupru, in mediu alcalin proteinele qi peptidele
culoare albastrd'
dou[ leg[turi peptidice in molecull) fotmeazhcompuqi numi\i chela{i,de
compus (de
Reaclia se numeqte a biuretului deoarece biuretul este cel mai simplu
neproteicd) care poate da aceastd reacfie intnrc6t con]ine in molecul[
doud 1eg6turi
natur[
peptidice. Aceast[ reaclie pune in eviden!fl structura peptidic[ a proteinelor'

2. Reaclianinhidrinei
in prezenla ninhidrinei ,la caldu-aminoacizii din proteine formeazd compugi colorali

it albastru-violet.

,a)x:x+ R-CH-COOH
I

NHz
t oc
- R-cHo + co z *3Hro +

o
\--)[
--ll

PurPura lui Ruhemann

Aceast[ reac{ie ne dovedegte faptul c6 proteinele qi peptidele sunt formate din

cr- aminoacizi.
3. Reac li a xantoProtei c d

in prezenla acidului azotic,la cald o-aminoacizii aromrtici conlinuli in proteine

formeazd nitroderivali aromatici de culoare gatbend. in mediu alcalin nitroderiva{ii se

transformd in ch in o ne tar culo atea se intensifi cd la po rto c al i u.

OH

* NaoH
,
- Hzo

b*,
I

CH-NH ^ CH-NH ^
l' l'
COOH
cooH
galben portocaliu

2
 Aceastd reactie este dat[ doar de proteinele gi peptidele ce conlin aminoacizi
aromatici.
4. ReacliaMillon
in prezentra acidului azotos,la cald ttozina din strucfura proteinelor formeaz[ un
nitrozoderivat. Acesta printr-un proces de tautomerie se transform6 intr-o chinonoximd, rn
precipitat ro ; u -cdrdmizi u.

OH o

il
tt ,,A-N-oH
Ut"
-\ + HONO>
-Hp ilt
\/
tu
t-
CH.NF
t-
CH-NH
t-
I
COOH
t'
COOH
CH-NFt,
l'
COOH
Nitrozoderivat Chinonoxima

5. Reac,ti a Adamkievics
Proteinele qi peptidele ce conlin triptofan reac lianeazdcu acidul glioxilic, in mediu de
acid sulfuric concentrat. Se formeazd un compus ropu-violet dispus sub forma unui inel la
suprafala de separare dintre acidul sulfuric concentrat si restul solutiei.
cooH COOH COOH
I tt
CH-NH" CH-NH.

' 'i(=]
cH-NH2
l'l'
CH^z cH,
,[\A,/]l
9H,
ri
ll
\r/V
H + Hz9O+
-.................._ =---*./
-HD \,/
CHO CH
+l I

COOH COOH

6. Reaclia sulfului
in mediu alcalin, laincillzire aminoacizli cu sulf din structura proteinelor ellbereazd
sulful ca ion sulfhidric care cu s[rurile de plumb formeazL su]fura deplumbde culoare neagrd.

Protein[ + 2NaOH t'C, Na2S + protein[denaturatl

(cisteinl, metionin[)
 NazS + Pb(CH3COO), PbS J + 2CH:COONa
--=- negru

B. Reaclii de precipitare
Reac{iile de precipitare a proteinelor au loc in prezenlaunor agenfi fizicisau chimici.
Prin simpl[ incdlzir.e sau cu ajutorul unor reactivi specifici proteinele trec din solufii coloidale,
in stare de gel. Precipitareapoate fi reversibildsau ireversibild.
1. Pre c ip i tare a re versi biI d (deshidratare sau salifiere)
Acest tip de precipitare afecteazildoar starea fizicitamoleculei proteice. Prin tratare cu

sdruri neutre (sulfat de amoniu, sulfat de potasiu, clorurd de sodiu etc.) aflate in solulie
saturat[ sau in stare solid[, substan]ele proteice trec din soluJiile 1or coloidale, unde se g[sesc
in stare de sol,in stare de gel.Are loc deshidratarea pa(iald qi reversibild a proteinei. ln urma

deshidrat[rii se realizeazd o aglomerare pafiiald a moleculelor, iar prin introducerea in mediu

de apd, prin hidratare deci, moleculele revin la forma inifial[, respectiv iqi reiau proprietd{ile
frzice qi chimice.

2. Precipi tarea ire versi bil d(denaturare)

Prin tratare cu sdruri ale metalelor grele (s[ruri de plumb, cupru, mercur) sau cu unii
acizi organici (acid picric, acid tricloracetic, acid sulfosalicilic) proteinele precipit[
ireversibil. in acest tip d.e precipitare au loc modificflri structurale profunde (schimburi de ioni

intre reactiv ,si proteind) firl nici o posibilitate de revenire la forma nativd. inllturarea
agentului de precipitare nu reface propriet[{ile frzice gi chimice iniliale ale proteinei, aceasta
rdm0ndnd in stare denaturatd.

2 R-CH-COOH + Pb(CH3COO)' (RrCH-COO)2Pb l' + ZCHTCOOH

I
------ I

NHz NHz
alb
cooH

; cl3c-cooH

acidpicric acid tricloracetic acid sulfosalicilic

Un caz particular al precipitlrii ireversibile este coagalarea care are loc la incillzire.
Sub acliunea c[ldurii, proteinele precipit[ datoritd procesului de denaturare ca urmare a
dezor ganizdrii structurii spa{iale inifiale.

4
 Reacţii de identificare ale proteinelor

Partea experimentală

Reacţiile de culoare
Unele dintre reacţiile de culoare prezentate pun în evidenţă structura peptidică a
proteinelor, altele sunt date de aminoacizii din structură, iar unele dintre ele sunt specifice unui
aminoacid anume. Aceste aspecte sunt importante în utilizarea reacţiilor prezentate şi în
determinările cantitative ale proteinelor.
Unele dintre reacţiile de culoare prezentate duc la formarea de precipitate iar altele la
formarea de compuşi solubili dar coloraţi. Aceste aspecte sunt importante pentru tipul de metodă
ce poate fi ales pentru determinările cantitative ale proteinelor.

Astfel:
1. reacţia biuretului (cu CuSO4 în prezenţă de NaOH) duce la formarea unei combinaţii
chimice complexe, solubile şi colorată în albastru; reacţia este folosită pentru realizarea
de metode spectrofotometrice de dozare a proteinelor;
2. reacţia ninhidrinei duce la obţinerea unui precipitat albastru-violet; deoarece
aminoacizii individuali dau nuanţe diferite, reacţia este folosită pentru separarea,
identificarea şi dozarea aminoacizilor prin cromatografie;
3. reacţia xantoproteică este dată doar de aminoacizii aromatici prezenţi în extractul
proteic analizat şi duce la formarea unui precipitat de culoare galbenă;
4. reacţia Millon este dată doar de prezenţa tirozinei;
5. reacţia Adamkievics este dată doar de prezenţa triptofanului;
6. reacţia sulfului este dată doar după eliberarea sulfului din proteinele ce conţin cisteină
sau metionină (aminoacizi cu sulf).

1
 Reacţiile de precipitare

Precipitarea reversibilă (în special cea cu (NH4)SO4) este utilizată pentru precipitarea
proteinelor uşor solubile (enzime), urmată de separare şi resolubilizare în scopul determinării
activităţii lor enzimatice.

Precipitarea ireversibilă este utilizată în scopul înlăturării proteinelor dintr-un extract

atunci când prezenţa acestora interferă în metoda de determinare ulterioară a altor compuşi (rol
de defecant).

Exemple:
1. precipitarea proteinelor cu acetat de plumb;
2. precipitarea proteinelor cu acid picric.

2
 DE,TERMINAREA PTJNCTULTI IZOE,LE CTRIC AL PROTEII\"ELOR

Proteinele, datoritf, structurii lor se comporti ca amfiioni macromoleculari. Ele

posed6 caracter amfoter, putdnd disocia atat la nivelul grupirilor carboxil cit si la nivelul
gruplrilor amino.

// COOH //COO-
Proteinn( --------------) Protein(
\- \
NHz -NHr*
Proteind nedisociatd Prote ind disociatd (amfiion)
, sarcina electrici neti a -
moleculei proteice depinde de pH-ul mediului.
in rnediu acid, molecula proteicl disociaztr ca o bazd:
COO' COOH
// //
Proteina( HrO* - ----------> proteind i + HzO
-NHr+ \NHl1
Cation
in acest caz proteina se comportd. ca un cation, sarcina electricd net6,a moleculei
fiind pozitivS.
a'' :
In mediu bazic,-molecula prbteic[ disociazd ca un acid:
Coo Coo
//
eroteina( ,/
+ HO- ---------------- protein[ /_ * UrO
.
\ NH,* \NH,.
Anion
in acest caz proteina se comporti ca un anion sarcina electricd netl a moleculei
fiind negativ[.
Fiecare proteind prezinti o valoare caracteristicd de pH, pentru care molecula
disociazl in proporfie egali ca acid qi cabazd, numdrul sarcinilor pozitive fiind acelagi cu
numlrul sarcinilor negative. Aceasti valoare de pH poarta denumirea de punct izoelectric
sau pH izoelectric qi se noteazd pH;. in consecinli :

- la valori de pH < pH1 proteinele se comportd drept cationi;

- la valori de pH > pHi proteinele se comportd drept anioni.
 Fiecare tip de proteinE are un punct izoelectric caracteristic ce , constituie o
constantr fizico-chimicr prin care se poate diferenfia de alte proteine.
Deoarece la punctul izoelectric sarcinile electrice se compenseazE, unele propriet[li
fizice ale proteinelor se modificd la pH1. Astfel Ia pHl:
- solubilitatea proteinelor este minimd (intre solubilitate gi pH-ul mediului exist6 o
corelafie direct6 pe care sebazeazLdeterminarea pHi) ;
- stabilitatea este minimd (deoarece propo(ia sarcinilor pozitive este ega15 cu cea a
sarcinilor negative, sarcina electricd global[ a proteinei devine nul6 gi in ,consecin{i
macromoleculele nu se mai resping tinzdnd spre aglomerare);
- mobilitatea tn cdmp electric a proteinelor se anuleazd (compensa{ia reciproci a
sarcinilor electrice de semn contrar face ca affac[iacelor doi poli electrici s6 devin[ egal6).

Determinarea pHl pentru cazeinl ,

' '' Cazeina este o fosfoproteid6 prezentd in lapte sub formi de sare de calciu solubili.
Pentru a determina punctul izoelectric al cazeinei, se va sfudia comportarea
acesteia in
solufii ce prezintd diferite valori de pH. pH-ul izoelectric se va regf,si la valoarea la care
cazeina prezint6 grad maxim de turbiditate (sau precipitare).

solu{iile tampon de diferite valori de pH se prepard din cH:cooNa 0,1 N qi

CH3COOH 0,1 N. Solulia de cazeinl utilizatd este 0,4 yo.

Eprubeta I 2 J 4 5 6 7
CII3COONa (ml) 2 2 2 2 0,75 0,5 0,25
CH3COOH (ml) 0,25 0,5 2 5,25 5,5 5,75
H2Od 3,75 3,5 3 2 0 0 0
pH 5,6 5? 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8
CAZEINA I I I 1 I
Turbiditate (sau pp)

- dupE addugarea cazeinei se agit6 pentru omogenizare

;
- dupl l0' repaos se examineazd turbiditatea (sau precipitarea) realizatd in fiecare
eprubetE;

- se noteazl pH-ul soluliei in care s-a observat turbiditate sau precipitare maxim[,
acesta
fiind pH-ul izoelectric pentru cazeind.
 Determinarea punctului izoelectric al proteinelor

Partea experimentală
Determinarea pHi pentru cazeină
Pentru deteminarea pHi al cazeinei se pregătesc conform referatului şapte soluţii tampon
de tip acid acetic/acetat de sodiu cu pH cuprins între 3,8 şi 5,6.

În fiecare eprubetă se adaugă câte 1 ml soluţie cazeină (0,4%).

Se omogenizează soluţiile prin agitare.

1
 După repaus 10 minute se identifică soluţia tampon în care s-a obţinut precipitarea
maximă. pH-ul acestei soluţii reprezintă pH-ul izoelectric al cazeinei.

Completaţi tabelul din referat după cum urmează:

 semnul “-” pentru soluţie limpede;
 semnul “+” pentru soluţie opalescentă;
 semnul “+ +” pentru soluţie opalescentă şi precipitat;
 semnul “+ + +” pentru soluţie limpede cu precipitat depus pe fundul eprubetei.

Eprubeta 1 2 3 4 5 6 7
pH 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8
Turbiditate
(sau precipitare)

Notaţi sub tabel pHi al cazeinei. Explicaţi răspunsul ales.

2
 DOZAREA AZOTULAI TOTAL PRIN METODA KJELDHAL

Dozarea azotului total (Nt) dintr-un produs de origine vegetal[ sau animalS se poate
face doar dup[ mineralizarea acestuia pe cale umed5. Mtnerahzarea umed5, realizatd.prin
fierberea produsului in acid sulfuric concentrat gi ?n prezenla unui agent de oxidare (acid
percloric, ap5 oxigenatd sau catalizator solid) duce la eliberarea azotului din compuqii
organici prezenli in materialul supus anahzer gi fixarea lui sub form[ de sulfat de amoniu.
Astfel transformat, azot:ul poate fi determinat fie printr-o metodd volumetricd (metoda
Kjeldhal) fie printr-o metodd spectrofotometricd (folosind reaclraNessler).

Principiul metodei
Pentru determinarea Nt din sulfat de amoniu (produs de minerafizare) amoniacul
prezent este eliberat cu ajutorul hidroxidului de sodiu qi distilat. in distilatul oblinut,
azotttl este determinat volumetric, prin titrare cu o solulie de acid clorhidric (sau acid
sulfuric), de concentrafie cunoscutd qi factor cunoscut, in prezenla indicatorului Groack
(amestec de roqu de metil qi albastru de metilen ). Din cantitatea de acid clorhidric folositd
la titrare se calculeaz[ Nt din probd.
2 NH: + FIzSO+ ----------------+ Q.Gfu)2SO+

+ 2NaOH ---------------) 2NH: +

(NF{+)zSO+ Na2SO4 + 2HzO
NII4OH + HCI ----------------* NlI4Cl + I{2O

Pregitirea instala{iei de distilare

Instalalia de distilare este format[ ?n principal din:
- balon de distilare, deflegmator, refrigerent descendent cu manta de ricire cu apd;
- biuretS, pahar Berzelius;
- bec de gaz, trepied, sit[ de azbest.
in balonul de distilare, se introduc c0teva bucSlele de por.telan poros, pentru a asigura o

fierbere uniform[. Deflegmatorul are rolul de a impiedica piclturile de solufie, din balonul
de distilare sd ajungi la refrigenent, in timpul distil[rii; pic[turile sunt retumate in balonul
de distilare. Refrigerentul are rolul de a condensa vaporii de amoniac qi ap5, care ajung aici

trecAnd prin deflegmator. Hidroxidul de amoniu format este colectat in paharul Berzelius"

Biureta se umple cu HCl 0,1 n, cu factor cunoscut. Pentru a nu se pierde din amoniacul
pe care trebuie s[-1 titrim, in paharul Berzelius se pune api distilatd gi se coboard qpijul
refrigerentului sub nivelul lichidului din pahar. Se adaug[ cdteva picdturi de indicator
Groack (rogu-violet in mediu acid, incolor in mediu neutru qi verde in mediu bazic) gi pulin
acid clorhidric, din biuret[, pentru ca prima qarjn de amoniac distilat si fie netrtrahzat1

imediat.

Prelucrarea probelor
Mineralizatul umed se trece cantitativ din balonul Kjeldhal in balonul de distilare, prin
spilarea repetatd,, cu ap5 distilat[ a balonului Kjeldhal (5-6 ori). Se considerf, ci trecerea a
fost cantitatll, dacd o picdturd de indicator Groack nu indic[ reacfie acid[ (roqu-violet).
Volumul total al lichidului din balonul de distilare trebuie s[ ocupe aproximativ jum[tate
din capacitatea balonului"
ln balon se adaug5 50 ml hidroxid de sodiu 30 yo, prelins pe peretele balonului, frr[
agitare. Se inchide balonul repede, cu dopul deflegmatorului, pentru a nu se pierde
amoniac.

Se porneqte incdlzirea cu flac[r[ potrivitd. CAnd lichidul din balon atinge punctul de
fierbere incepe practic Ai distilarea azotului. Aparilia amoniacului in paharul Berzelius este
obserryatd datorit6 virajului culorii de la roqu-violet (mediu acid) la verde (mediu bazic).
Pe mdsurl ce lichidul din pahar este alcalinizat, se face neutralizarca lui cu acid clorhidric
(prin titrare) pentru a nu pierde din amoniac (se poate degaja in atmosferd). Se evitd gi
addugarea unei cantitdli prea mari de acid clorhidric, pentru a nu depiqi punctul de

echivalenfd. Spunem cd realizdm titrarea permanentd a amoniacului, pe mdsurd ce

distilarea are loc. Amoniacul va fi distilat masiv tn primele 5-6 minute. Distilarea gi titrarea

se considerS terminate, cAnd lichidul din pahar r[mAne incolor sau slab roz timp de 3-4
minute.
Pentru oprirea instalafiei se scoate int6i qpiful refrigerentului din lichid gi apoi se stinge
becul de gaz. Nu se procedeazd in ordine invers[ pentru a evita aspirarea lichidului din
pahar in refrigerent.

Odatd titrarea incheiati se noteazd volumul aproximativ (Va) de acid clorhidric folosit

la titrare qi se calculeazd azotul din prob[.

 Calcul
Pentru a calcula Nt din probd folosim formula generalE din volumetrie:

X g substanp do dozat: (Va . F . n) reactiv de titrare . mEg substanld de dozat =

X g Nt = (Va ' F'n) nct'mEgN unde F qi n se cunosc, rnEgNr:0,014 iar Va este
oblinut prin titrare.
Pentru a raporta la 100 grilme de material vegetal se fine cont de cantitatea de probd
inifiaH supus[ mineralizirii (p e).
X gNt .."...p gmaterial vegetal sr4)us mineraliz6rii
Y s Nt ...... 100 s material vesetal
Y: (X I p) .100
=
NtTo = Nt in nrobi / robi) .1
 Dozarea azotului total prin metoda Kjeldhal

Partea experimentală

Pregătirea probelor

Pentru dozarea azotului total o cantitate exact cântărită de probă (p = 0,5 g) se supune
întâi mineralizării umede, în prezenţă de acid sulfuric (H2SO4) şi catalizator solid. În cursul
acestui proces azotul este fixat sub formă de sulfat de amoniu ((NH4)2SO4).

Acest produs al mineralizării este supus distilării prin antrenare cu vapori, proces în care
azotul este eliberat sub formă de amoniac (NH3).

1
Dozarea azotului

Amoniacul (NH3) eliberat prin distilare se titrează cu acid clorhidric (HCl) de

concentraţie cunoscută (n = 0,1) şi factor cunoscut (F = 0,9900), până la neutralizare. Pentru
identificarea punctului de echivalenţă se utilizează indicator Groack (soluţie de roşu de metil cu
albastru de metilen). Indicatorul este roşu-violet în mediu acid, incolor la echivalenţă şi verde în
mediu bazic. Titrarea se va face până la slab roz. Se citeşte la biuretă volumul aproximativ (Va)
de acid clorhidric folosit la titrare.

Calcul

Azotul total din probă (Nt) se calculează astfel:

X g Nt = (Va  F  n)HCl  mEgN unde: mEgN = 0,014.

Valoarea obţinută se raportează la 100 grame probă.

X g Nt .......................p g probă
Y g Nt....................100 g probă
Y g Nt = (X g Nt / p g probă)  100

Seminţele a patru soiuri au fost analizate pentru determinarea conţinutului de azot total
prin metoda Kjeldhal. Volumele aproximative de acid clorhidric folosite la titrarea probelor (Va)
sunt prezentate în tabelul următor:

Probă Va Nt Proteină
(ml) (g%) brută (g%)
Grâu 5,9
Secară 7,5
Porumb 3,7
Soia 15,5

Să se calculeze concentraţia de azot total şi de proteină brută în probele analizate.

2
 DETERMINAREA CALITATIVA $I CANTITATIVA A GLUTENULII

Cele mai importante fracliuni proteice ce se gdsesc in bobul de gr6u sunt gliadinele
(prolaminele) qi glutelinele. in prezenla apei, aceste fracliuni proteice dau o mas6 elasticd

numitd gluten. Se considerd cd glutenul este r[spunzdtor de insuqirile speciale de panificalie

ale aluatului, adicS: elasticitate, plasticitate, grad de hidratare. Aceste insuqiri depind de

calitatea qi cantitatea glutenului format de fbina respectivd, de raportul cantitativ dintre

gliadine qi gluteline precum gi de alli factori. Pe lAngi gliadine qi gluteline glutenul mai
confine: albumine, globuline, mici cantit[li de glucide, lipide, slruri minerale.
Cerealele care pot forma gluten, ducdnd la o f6ind panificabilS confin gliadine: 40-45%

qi gluteline:35-40o/o. Este cazul fdinii de grAu qi de secari. Fdina de orz confine mai puline
gliadine qi este mai pulin panificabild. Fdina de ovdz nu este panificabil[, deoarece confine
80% globuline qi concentralii foarte mici din celelalte fracliuni proteice. Fdina de orez conline
cantitiLti prea mici de gliadine qi gluteline pentru a fi panificabilS. Nici porumbul nu formeazd
gluten, deoarece are un conlinut prea mare de gliadine. in concluzie, pentru ca o flind sd fie
panificabilS este important conjinutul in gliadine gi gluteline dar gi raportul dintre ele.
Glutenul se determind, atet cantitativ (un conlinut mare de gluten este un indiciu c[
frina respectivd are bune insugiri de panificalie) cdt qi calitativ.
Din punct de vedere cantitativ glutenul trebui s5 depdgeascd un procent de 25o/o pentru

a ayea o fEini panificabil[. O fdin[ este considerati de calitate superioard c6nd are conlinutul
de gluten, de 30-35%. Conlinutul de gluten al unei fdini depinde de condiliile climatice gi
tehnologice de culturd (in special administrarea ingriq[mintelor cu azot pe parcursul perioadei
de vegetafie) precum gi de gradul de extracfie al frinii. Un grad de extracfie mai ridicat
inseamn[ un conlinut mai mare de gluten, deoarece gliadinele qi glutelinele sunt localizate in
endosperm, iar prin extraclie se indep[rt eazd te gtmentele seminfelor.

Din punct de vedere calitativ glutenul trebuie si fie aglomerat, destul de rezistent Si

elastic. in nici rx7 caz nu trebuie sd se deformeze, s[ fie moale, filant sau licios. Calitatea
glutenului este determinatl genetic, putAnd fi insd afectatd de excesul de umiditate sau de
pr ezenla unor ddunltori (plo gnila cerealelor).
Sunt posibile urm[toarele calificative :

- filant;
 - moale qi lipicios;
- destul de tare, destul de elastic;
- tare qi elastic;

- foarte tare, foarte elastic.

in mod practic, se determind, cantitatea de gluten umed qi cantitate a de gluten uscat.

Determinarea glutenului umed

Metodele de determinare se bazeazd pe transformarea fbini in aluat urmati de sp[larea
aluatului in anumite condilii. Prin sp[larea aluatului se indep[rtezb, amidotul re]inut in masa
glutenului. Glutenul rdmas se c6nt[reqte qi se raportezd la 100 g f5ind.
Rezultatele oblinute depind de condiliile experimentale :

- timpul c6t aluatul este ldsat in repaus tnainte de a fi spalat;

- natura lichidului intrebuinlat la spdlare.
Pentru a obline rezultate reproductibile trebuie respectate urm[toarele condi]ii:
- consistenla aluatului sd fie maximS, adicl s5 avem un gluten complet dezvoltat;
- repausul aluatului inainte de spdlare sd nu fie mare pentru ca activitatea proteolitica sd
fie redus[ la minim.
Astfel s-a stabilit cd este bine ca durata total[ a preparlrii unui aluat sd fie de 9 minute: 3
minute pentru obfinerea aluatului qi 6 minute repaus inainte de spdlare, pentru dezvoltarea
glutenului.

Determinarea glutenului uscat

Glutenul umed poate refine un conlinut variabil de apd. Proporlia de apd pe care o
reline glutenul umed este dat6 de raportul dintre conlinutul de gliadine qi gluteline. Pentru a

avea o imagine exactd a confinutului real in substan,td uscatd a glutenului qi a capacitdtii sale

de a reline apd se determin[ glutenul uscat qi gradul de hidratare al glutenului umed.

Glutenul uscat se determind prin uscarea glutenului umed, in anumite conditii, la

etuv5. Glutenul rimas se cdnt[reqte gi se raportezd" la 100 g frin6.
Gradul de hidratare se calculeazl astfel:
H% : G. Um. % - G. Us. % . 100 unde: H%: grad de hidratare;

G.Um. o/o G. Um. Yo: procent de gluten umed;

G. Us. Yo : procent de gluten uscat.

 Determinarea calitativă şi cantitativă a glutenului

Partea experimentală
Pentru determinarea calitativă şi cantitativă a glutenului umed:
- se cântăresc 33,330 g făină;

- se adaugă 17 ml soluţie NaCl 2%;

- se formează un aluat care se frământă timp de trei minute;
- se lasă aluatul în repaus 6 minute;

1
 - aluatul se spală sub jet de apă pentru îndepărtarea amidonului (la început apa să
picure şi apoi jetul să fie subţire pentru a nu pierde din gluten; practic trebuie să
stoarcem aluatul pentru a îndepărta soluţia de apă cu amidon);
- se consideră că nu mai avem amidonul atunci când soluţia îndepărtată din aluat nu
mai este opalescentă;

- se cântăreşte glutenul obţinut şi prin înmulţire cu 3 se află cantitatea de gluten umed

din proba de făină (determinare cantitativă);
- glutenului obţinut i se dă şi un calificativ (vezi referat pentru alegerea calificativului)
(determinare calitativă).

În exemplul prezentat glutenul a cântărit 10,385 g deci în proba noastră de făină avem
31,16 g% gluten umed. Această valoare ne permite să considerăm că avem o făină superioară.
În plus proba a primit calificativul: destul de tare, destul de elastic.

Pentru trei probe de făină s-au făcut următoarele cântăriri:

Probă Cântărire iniţială (g) Cântărire finală (g) Gluten umed (g%)
Făină de ţară 33,33 9,173
Făină tip 000 33,33 10,415
Făină tip 650 33,33 11,346

Să se calculeze cantitatea de gluten umed.

2
 DOZAREA GRASIMII BRUTE PRIN METODA SOXHLET

Lipidele sunt o clas[ de biomolecule inso]ubile in mediu apos qi solubile in solvenli

organici nepolari (eter,cloroform, benzetetc.). De aceastd proprietate trebuie s[ linem cont in
determinar ea calitativilgi cantitativ[ a 1or.

Din punct de vedere structural conlin acizi gra;i qi diferili alcooliunitri prin legflturi de
tip ester (majoritatea lipidelor) sau de tip amidd (sfingolipidele). ln func{ie de natura acizilor qi
alcoolilor din structurd se clasificilin lipide simpleqi lipide complexe. Lipidele simple con{in
C, H qi O iarcele complexe maipotconlineN, P sau S.

Dup[ nahtra alcoolului din structurd principaiele tipuri de lipide simple sunt:
gliceridele, ceridele, steridele pi etolidele. Tipurile de lipide complexe sunt mai numeroase
fiind clasificate tot dup[ natura alcoolului din structurd: lecitine, cefaline, serincefaline, acizi
fosfatidici etc.
Cele mai rSspindite lipide sunt gliceridele, esteri ai glicerolului cu acizii graqi:

cH2 - oH
I fr,-o-co-R +
CH-OH + 3 R-COOH cH-o-co-R 3Hzo
t I
CHz - OH cHz-o-co-R
Ceitreiradicaliacil(R-CO-)potfiidenticisaudiferi{i.Naturaradicalilor(satura}isau
nesatura{i) determin[ consisten{a gliceridei respective: gliceridele saturate sunt solide, iar
cele nesaturate sunt lichide (uleiuri).

Dozareagrlsimii brute dintr- un material biologic (vegetal, animal) se poate face prin

metoda Soxhlet.

Principiul metodei
Gr[simea brut5 este extrasddinlesut cu ajutorul unor solvenli organici (eter de petrol).
Dup[ evaporarea solventului grflsimea extras[ este dozatd gravimettic.
Deoarece solven{ii organici extrag odatd cu lipidele qi alte substanle liposolubile
(unele vitamine qi pigmen{i), produsul final de extraclie estenumit grdsime brutd.

P entru re al izar e a extr ac{i ei s e :utllize azd' o i n s ta I a li e d e di s ti I are.

 Pregltirea instalafiei de distilare
Instalalia de distilare este forrnat[ din urm[toarele componente:
- balon de extraclie- pentru colectateagrdsimii brute;

- corp extractor - prevdzut cu tub lateral penflu circula{ia vaporilor de solvent qi cu

sifon pentru culegerea gr[simii brute;

- refrigerent ascendent- prev[zut cu manta de rbcire cu ap6;
- baie de apd electricd- pentruincdlzireasolventului la temperatura potrivit[;
- cartup din material poros - pentru prob[.

Prelucrarea probelor
Realizlm urm[torii Paqi:
- setareazilcartuqul poros qi balonul de extraclie (aducere la masd constant[ qi cAntlrire);

- se cAnt[resc aprox. 20 gmaterial vegetal in cartuq;

- cartuqul cu prob[ este introdus in corpul extractor;

- se introduce por{elan poros in balonul de distilare;

- se ata;eazd corpul extractor la gAtui balonului iar refrigerentul in capdtul corpului extractor;

- se dd drumul la ap[ s[ circule prin mantauarefrigerentului;

- se incepe incillziea.
CAnd eterul de petrol ajunge la punctui de fierbere, vaporii formali trec prin tubul
lateral al corpului extractor gi ajung la refrigerent unde condenseazfl. Pic[turile formate cad in

corpul extractor, in cartuqul cu prob[, unde dizolvl gr[simile din materialul vegetal artahzat.
CAnd solventul atinge nivelul superir al sifonului, are loc o sifonare (antrenarea solventului cu

gr[sime din corpul extractor in balonul de distilare). Extrac{ia se face prin astfel de sifon[ri
repetate, timp de c0teva ore. Dup[ terminarea extracliei, se scoate carfuqul din corpul extractor

iar instalalia se monteazil drnnou, pentru recuperarea solventului. Se inc[lzegte balonul qi se

lasd extractorul s[ se umple cu solvent care astfel se recupere azd. Se repet[ opera{ia pAn[ cind

in balon r[m6ne gr[simea brut[ qi o foarte mic[ cantitate de solvent. Se demonte azb' rnstala\ia
iar balonul cu gr[sime brutd se usucd la etuvd gi se cdntdreqte.

Calcul
Se fac um[toarele notafii:
a - greutatea cartuqului gol; b - greutatea cartuqului cu prob[;

c - greutatea balonului gol; d - greutatea balonului cu reziduu lipidic.

(b - a) g materiai vegetal (d - c) g lipide
I 00 g material vegetal ................................ x g lipide
x : ( d-c lb-a). 100 glipide

Gr[simebrutd o/, : ( glipide / gproba) . 100

 Dozarea grăsimii brute prin metoda Soxhlet

Partea experimentală

Pregătirea probelor
Proba fin mărunţită se cântăreşte într-un cartuş poros care se introduce în corpul extractor
al instalaţiei de distilare. Se montează instalaţia conform instrucţiunilor din referat, se adaugă
eterul de petrol şi se porneşte distilarea. La sfârşitul distilării lipidele extrase din probă se vor
acumula în balonul de distilare.

Baterie extractoare cu patru cuiburi de tip Soxhlet

Dozarea grăsimii brute

După îndepărtarea eterului de petrol, grăsimea brută extrasă se va determina cantitativ
prin gravimetrie.

Calcul
Pentru a determina conţinutul de grăsime brută din probă vom raporta gramele de lipide
extrase prin această distilare la gramele de probă supuse analizei şi vom înmulţi cu 100 conform
relaţiei:
Grăsime brută (g%) = (g lipide extrase / g probă)  100

unde: g lipide extrase = Balon cu reziduu lipidic – Balon gol;

g probă = Cartuş cu probă – Cartuş gol.

Patru probe vegetale au fost analizate pentru determinarea conţinutului de grăsime brută
prin metoda Soxhlet. Cântăririle realizate conform metodei sunt prezentate în tabelul următor:

Probă Cartuş Cartuş Balon Balon cu Grăsime

gol cu probă gol reziduu lipidic brută
(g) (g) (g) (g) (g%)
Porumb 2,4735 4,4742 136,323 136,392
Soia 2,1463 4,1471 127,361 127,750
Floarea soarelui 2,6241 4,6253 139,629 140,574
Susan 2,3727 4,3733 131,821 132,616
Să se calculeze concentraţia de grăsime brută din probele analizate.
 DOZAREA GLUCIDELOR SOLUBILE DTRECT REDUCATOARI PRIN
METODA SCHOORL

Glucidele se gf,sesc in cantitAli mari in organismele vegetale (85 - 90%). Ele pot fi
solubile in ap[ (glucoza, fructoza, zaharoza etc.) sau insolubile in ap[ (celuloza etc.).
Determinarea lor cantitativ[ trebuie s[ !in[ seama atdt de solubilitatea lor cit qi de

caracterul lor reducbtor. Prin metoda Schoorl se pot doza direct glucidele solubile
reducdtoare qi se pot doza glacidele solubile totule dac[ se face in prealabil transformarea
glucidelor solubile nereduclto are in reduc[to are.
Metoda urm[reqte etapele clasice ale unei dozdrr biochimice qi anume extraclia
compusului de interes urmatd de dozarea lui printr-o metodf, adecvatf,.

Extracfie
Extraclia glucidelor solubile se face in ap6, la cald, in prezenla unor defecanti.
Agenlii defecanJi au rolul de a ?ndepdrta, prrn precipitare, din extractul pentru dozare

biocomponente ce ar putea influenla negativ dozarea. in cazul determindrii glucidelor,

proteinele Si acizii organici trebuiesc inldturali deoarece interferl in reaclia utrhzatd. pentru
dozare. Pentru precipitarea acestora este utilizat acetatul de plumb.

Dozare
Glucidele solubile direct reduc[toare se pot doza pe baza reuctiei de oxido-
rerlucere cu reactiv Fehling. in prezenla acestuia, la cald, glucidele solubile direct
reduc[toare se oxideazd la acidul aldonic corespunz[tor. La sfhrqitul reacliei se va observa
formarea oxidului cupros, un precipitat roqu-cbrdmiziu.
CuSO+ + 2NaOH ----) Cu(OH)2| + NazSO+

Cu(OH)2 J -') CuO + IIzO

R-CHO + 2CuO S"n-CooH + CuzOJ
in mediu se introduce un exces de reactiv, glucidele reducltoare reaclionAnd doar

cu cantitatea propo4ional[ de Fehling. Excesul de reactiv Fehling neredus este descompus

cu acid sulfuric, c6nd se reface sulfatul de cupru.

 cu(oH)2 | + llzSo+ --- cuSo+ + 2H2o
Ionii de cupru care nu au participat la reaclie ( aflali in exces) sunt dozali pe cale
volumetrici, prin metoda iodometricd. Pentru aceasta, sulfatul de cupru in exces este tratat
cu iodur[ de potasiu ducind 1a formare de iodur[ cuproasd qi iod molecular.

2 CuSO+ + 4KI --- 2CtI J + +K2SO4 -t Iz

CXCES

Iodul eliberat estetitrat cutiosulfat de sodiu 0,i N, cu factor cunoscut, in prezenta

amidonului, ca indicator.
Iz + 2NazSzO: -, 2NaI + NazSgO5

Cunosc6nd cantrtateatotald. de cupru introdus[ in mediu gi cantitatea de cupru ce nu

a participat la reaclia de oxido-reducere (dozatd. volumetric), prin diferen!6, se afl6
cantitatea de cupru redusf, de glucidele din solulie.
Cantrtatea tota16 de cupru introdusd in mediu se afl[ cu ajutorul unui martor.
Martorul conline doar reactivii de dozare, fir6 extract glucidic. Prin dozarea volumetricb a

martorului se determind cdt tiosulfat de sodiu se consumi la titrare in absenJa glucidelor

din mediu, adtcd" cdt iod molecular este pus in libertate de intreaga cantitate de sulfat de
cupru. F[c6nd diferenta dintre volumul de tiosulfat de sodiu folosit latitrarea martorului
(Vr'r) li volumul folosit la trtrarea probei (Vr) putem afla cdt cupru s-a redus datorrtl.
glucidelor din mediu. Cantrtatea de glucide direct reducltoare, din prob[, exprimutd in
miligrume glucold, se deduce din tabele ce stabilesc o corelatie intre volumul de tiosulfat
de sodiu folosit la titrare qi glucidele direct reduc[toare. Cantitatea de cupru precipitatl nu

este echivalent[ ci doar proporlional[ cu glucidele direct reduc6toare din prob[.

Calcul
Se fac urmS.toarele nota-tii :

a ----> cantitatea de material vegetal supus anahzei

v -) volumul extractului glucidic supus dozdrn,
Vr - volumul balonului in care s-au extras glucidele reducltoare ;

Vru - volumul de tiosulfat de sodiu folosit latrtrarea martorului ;

Vp - volumul de tiosulfat de sodiu folosit latitrarea probei.

(Vn - Vr) Va ' F: Ve NazSzO: corespunzltor glucidelor direct reduc[toare din

prob6.
Ve ml NazSzOg A mg glucozl ( transformarea:se face in tabelul Schoorl

direct sau prin interpolare)

----+
A mg glucozb v ml extract

x mg glucozd .. Vr ml extract

x:A.Vr lv mgglucozi

x mg glueozi ag material vegetal

v mg glueoz[ 100 g material vegetal

y : x. 100 / a = A.Vr.100 / v '&

Glucide solubile direct reduc[toare

o,/n : A'Vr ' 100 /v' etmg glucoz[
 Dozarea glucidelor solubile direct reducătoare prin metoda Schoorl

Partea experimentală

Extracţia
Pentru extracţia glucidelor solubile direct reducătoare realizăm următoarele etape:
- se cântăresc aproximativ 10 g material vegetal (a) şi se mojarează fin;

- mojaratul se trece cantitativ cu apă distilată, în balon cotat de 200 ml şi se adaugă 5

ml acetat de plumb cu rol de defecant;

1
 - baloanele se ţin pe baie de apă 30 minute la 75 οC, iar după răcire sub jet de apă, se aduc
la cotă cu apă distilată;
-

- se omogenizează conţinutul baloanelor şi se filtrează prin filtru cutat.

-

Astfel se obţin 200 ml extract (VT).

Dozarea glucidelor solubile direct reducătoare

Pentru dozarea glucidelor solubile direct reducătoare se relizează următoarele etape:
- se măsoară 10 ml extract (v) într-un pahar Erlenmeyer şi se adaugă 10 ml reactiv
Fehling I şi 10 ml reactiv Fehling II;

2
- paharele se încălzesc la fierbere, pe plită electrică, timp de 2 minute;

- după răcire sub jet de apă se adaugă 10 ml iodură de potasiu şi 10 ml acid sulfuric;

3
- se titrează cu tiosulfat de sodiu 0,1 N cu factor cunoscut (F=0,9900), în prezenţă de
amidon, până la echivalenţă şi se citeşte la biuretă volumul aproximativ (VP) folosit.

4
 Volumul de tiosulfat de sodiu (VP) folosit la titrarea extractelor se găseşte în tabelul
următor:
Produs VP Na2S2O3 (ml)
Păstârnac 0,03
Morcov 0,26
Portocală 1,32
Măr 5,83

Pentru calcul conţinutului de glucide solubile direct reducătoare în paralel se titrează un

martor. Martorul se lucrează în aceleaşi condiţii ca proba, dar fără extract.

5
 Volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titarea martorului este VM=14,5 ml Na2S2O3.
Cantitatea de glucide solubile direct reducătoare se exprimă în glucoză. Volumul exact
(Ve) de tiosulfat de sodiu, corespunzător glucidelor solubile direct reducătoare din probă, se
transformă prin interpolare în tabelul Schoorl în mg glucoză.

Calcul
Pentru calcul se utilizează algoritmul prezentat în referat. Rezultatele se vor prezenta în
următorul tabel:

Produs Glucide reducătoare (g%)

Păstârnac
Morcov
Portocală
Măr

Exemplu de calcul:
10 g măr, soiul Ionatan sunt supuse extracţiei într-un balon cotat de 200 ml, pentru
dozarea glucidelor solubile direct reducătoare prin metoda Schoorl.
10 ml extract sunt utilizaţi pentru dozarea glucidelor solubile direct reducătoare.
Proba se titrează cu VP=13,5 ml Na2S2O3, iar martorul se titrează cu VM=15,8 ml
Na2S2O3. Factorul soluţiei de Na2S2O3 este F=0,9900.
Să se calculeze conţinutul glucidelor solubile direct reducătoare din probă.

(15,8-13,5)=2,3 ml Na2S2O3 (Va)

2,3x0,9900=2,277 ml Na2S2O3 (Ve)

Ve se transformă în mg glucoză, în tabelul Schoorl, prin interpolare astfel:

3 ml Na2S2O3 ………..9,4 mg Glc
2 ml Na2S2O3 ………..6,3 mg Glc
1 ml Na2S2O3 ………..3,1 mg Glc
0,277 ml…………….. X
X = 0,277x3,1 = 0,8587 mg Glc 

Deci pentru 2,277 ml Na2S2O3 vom avea 6,3+0,8587=7,1587 mg Glc

7,1587 mg Glc…………..10 ml extract

x……………………200 ml extract
x=143,174 mg Glc

143,174 mg Glc………….10 g măr

y……………….…...100 g măr
y=1431,74 mg Glc = 1,43 g Glc%

6
 DOZAREA GLUCIDELOR SOLUBILE TOTALE PRIN METODA
SCHOORL

Prin glucide solubile totale se inlelege suma glucidelor solublle reducdtoare gi

nereducdtoare. Determinarea cantitativd a glucidelor solubile totale presupune:

-extraclia glucidelor solubile; "

- transformare a glu c ide lor ner edu cdtoar e tn r e ducd.loare ;

dozarea glucidelor solubile totale.

Extracfia
, Extractia glucidelor solubile se facd conform metodei Schoorl anterior prezentat6.

Transformarea glucidelor nereducltoare in reducitoare

Transformarea . glucidelor nereduc[toare in reducdtou]re se face prin hidrolizd
acidrt, h cald. tn aceste condilii glucidele nereduc[toare se descompun in ozele
cornponente. Amestecul de oze format are caracter reducitor gi poarti numele de
zahdr invertit, iar procesul chimic se numefte invertire (datoritEschimblrii sensului
activitefli optice)

Dozarea glucidelor solubile totale

Pentru dozarea glucidelor solubile totale ia hidrolizatul oblinut din extractul
glucidic trebuie sE facem intdi neutralizarea excesului de acid rimas dup[ hidrolizd, in
scopul efectui.rii reacliei de oxido-reducere cu reactivul Fehling.
tn continuare probele se lucreaz6 conform metodei Schoorl, ca in cazul glucidelor
solubile direct reducitoare, cu menliunea ci in loc de extract se utilizeazi hidrolizat.
 Cantitatea de glucidehsr solubile totale din probi, exprimatd tn
miligrame zahdr
invertit se deduce din tabelul Schoorl.

Calcul
Se fac urmitoarele notatii :

a ----+ cantitatea de material vegetal supus

anahzei ;

---+ volumul hidrolizatului glucidic supus dozdrii;

V' *
volumul balonului in care s-a fEcut hidroliza glucidelor nereduc6toare;
V ---) volumul de extract glucidic supus hidrolizei
,

Vr ---- volumul balonului in care s-au rixtras glucidele;

Vrr ---- volumul de tiosulfat de sodiu fol,rsil la titrarea martorului
,

Vp -' volumul de tiosulfat de s-rdiu folosrn, la titrarea probei.

(Vlr - vp) : va' F : Ve NazSeor cor^spunzdtBl elucidelor solrrbrle totale din probi
ve ml NazSzo: n ,"gffi*uffilrro.*area se face in tabelul Schoorl
cirrect sau prin interpolare).

B mg zahir ---+
invertit v ml hidrolizat
x mg zahlr invertit . .. V' ml hidrolizat

x:B.V'/v mg zah[r invertit

X mg zahir invertit V ml extract

v mg zahdr invertit Vr ml extract

y: x'V1 lV mg zah[rinvertit: B.V'.Vr / v.y

v mg invertit
zahlr a g material vegetal
z mg zahf,r invertit 100 g material vegetal

z : y.100 I a : B.V".V'.l00 I v .y.a

Glucide solubile totale zahlr invertit

 t55

--:-Gf Ef !ttE3-==E=g==EsE=-EE-=E3EtE E!-E E=E= EE- EtTEAGltrEtE-t.tG!!I-

=E=-
Solutle'O,l x d.o Cupnr GlucoaE ZIhBr tnvcrttt
ttoiurfet (d) (tus) (re) (rg)
GE!aGrttGasE=t=!!=tEg =aart=rlEtlt==at!===E =GCq!=rE= =it =EE-re*satr':=tr=:t-il!et:Jtlll
I 614 3tZ )12,
"? L2 rT 6e 6-,1:
L9,1 t9r7
7
. _ 9,4'
+
.E
2r,4 !2 16 1Lo
31,8 15 t"9 16'4
6 )8 12 Lg rZ
.1?' .*,'
7 44 15 ?2 r4
-?})z
"9.' 5o,9 25 t6 25 rot
'9. 57,) 2819 29 19
1o 63 16 32 rj 33#
}L 7o ro 35 ,T . J5'8
L2 T6 r) 39 rs 4o r3
13 82 rT 42 14 43 rB
14 89 rI 45'rB +7 rj
15 95 14 49.-3 5o rB
I6 lol rg 53t8 54 r3
1o8rl ,6,3 58'o
18 LL4 14 59,8 61rB
1.9 l2o rB 6) rj 65'-5
2o LZT & 65 r9 69 )4
2L L33 15 7orT T3r3
22 If9 rB 74 r5 T7 ,2
2) L46 12 78 r5 8112
24 L52 )6 82 O6 BS ra
ir
Pc lEq,** 8{"6 EB u?
g.:lgtEH!:tuc13:gBg'=a:=LSL:-3At=*g5=-=;33LSsl=;Ji":Egi5=5-*-*=l::3:*==i=g5=-:=i:E=83{-ggill
 Dozarea glucidelor solubile totale prin metoda Schoorl

Partea experimentală

Extracţia
Pentru dozarea glucidelor solubile totale se utilizează extractul obţinut anterior (metoda
Schoorl de dozare a glucidelor solubile direct reducătoare).

Vă reamintesc:
10 g material vegetal fin mojarate au fost trecute cantitativ cu apă distilată, în balon cotat de
200 ml şi supuse extracţiei pe baie de apă, în prezenţă de acetat de plumb, cu rol de defecant.

Transformarea glucidelor nereducătoare în reducătoare

- 25 ml extract se trec într-un balon cotat de 50 ml şi se supun hidrolizei în prezenţă de
acid clorhidric, pe baie de apă, la 65 οC;

- după zece minute excesul de acid nereacţionat este neutralizat cu hidroxid de sodiu, în
prezenţă de fenolftaleină;

1
 - balonul se aduce la cotă cu apă distilată.

Astfel se obţin 50 ml hidrolizat.

Dozarea glucidelor solubile totale

Pentru dozarea glucidelor solubile totale se măsoară 10 ml hidrolizat şi se lucrează
conform metodei Schoorl deja prezentată.

Volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titarea martorului este VM=14,5 ml Na2S2O3.

2
 Volumul de tiosulfat de sodiu folosit la titarea probelor hidrolizate se găseşte în tabelul
următor:

Produs VP Na2S2O3 (ml)

Păstârnac 11,8
Morcov 10,7
Portocală 10,1
Măr 8,1

Cantitatea de glucide solubile totale se exprimă în zahăr invertit. Volumul exact de

tiosulfat de sodiu, corespunzător glucidelor solubile totale din probă, se transformă prin
interpolare în tabelul Schoorl în mg zahăr invertit (ultima coloană).

Calcul
Pentru calcul se utilizează algoritmul prezentat în referat. Rezultatele se vor prezenta într-
un tabel ce va cuprinde şi valorile obţinute pentru glucidele solubile direct reducătoare.

Produs Glucide reducătoare (g%) Glucide totale (g%)

Păstârnac
Morcov
Portocală
Măr

Pentru calculul glucidelor solubile totale din probe folosiţi următoarele informaţii:

VM=14,5 ml Na2S2O3; F=0,9900; v=10 ml hidrolizat; V`=50 ml hidrolizat;

V=25 ml extract; VT=200 ml extract; a=10 g material vegetal.

3
 Exemplu de calcul:

10 g măr, soiul Ionatan sunt supuse extracţiei într-un balon cotat de 200 ml, pentru
dozarea glucidelor solubile totale prin metoda Schoorl.
25 ml extract sunt hidrolizaţi într-un balon cotat de 50 ml.
10 ml hidrolizat sunt utilizaţi pentru dozarea glucidelor solubile totale.
Proba se titrează cu VP=12,3 ml Na2S2O3, iar martorul se titrează cu VM=15,8 ml
Na2S2O3. Factorul soluţiei de Na2S2O3 este F=0,9900.
Să se calculeze glucidelor solubile totale din probă.

(15,8-12,3)=3,5 ml Na2S2O3 (Va)

3,5x0,9900=3,465 ml Na2S2O3 (Ve)

Ve se transformă în mg zahăr invertit, în tabelul Schoorl, prin interpolare astfel:

4 ml Na2S2O3 ………13,0 mg Z.I.
3 ml Na2S2O3 ………..9,7 mg Z.I.
1 ml Na2S2O3 ………..3,3 mg Z.I.
0,465 ml…………….. X
X = 0,465x3,3 = 1,53 mg Z.I. 

Deci pentru 3,465 ml Na2S2O3 vom avea 9,7+1,53=11,23 mg Z.I.

11,23 mg Z.I………….10 ml hidrolizat

x…………………..50 ml hidrolizat
x=56,15 mg Z.I.

56,15 mg Z.I………….25 ml extract

y…………………200 ml extract
y=449,2 mg Z.I.

449,2 mg Z.I……………10 g măr

z…………………...100 g măr
z=4492 mg Z.I. = 4,49 g Z.I. % g măr

4
 Dozarea glucozei cu orto-toluidină utilizată ca metodă de determinare a glicemiei

Partea experimentală

Extracţia
- 0,2 ml ser se tratează cu 3,8 ml acid tricloracetic pentru deproteinizare şi se filtrează.

Dozarea glucozei
- din filtratul obţinut anterior se măsoară 1 ml şi se tratează cu 3 ml reactiv orto-toluidină;

1
- probele se fierb 10 minute pe baie de apă, iar după răcire se determină extincţia la =630 nm.

Calcul
Valorile pentru extincţia probelor sunt transformate în valori de concentraţie cu ajutorul
unei curbe etalon. Se pregăteşte o serie de soluţii etalon de glucoză utilizând ca soluţie stoc
glucoză de concentraţie 50 mg/100 ml.

Din fiecare etalon se măsoară 1 ml şi se adaugă 3 ml reactiv orto-toluidină.

2
 Eprubetele se fierb 10 minute pe baie de apă.

După răcire se determină extincţia la 630 nm.

M E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10
-3 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250
Glc10
(mg/ml)
E630 0 0,08 0,15 0,22 0,31 0,42 0,53 0,61 0,73 0,84 0,91

Pentru realizarea curbei etalon utilizaţi hârtie milimetrică! Trasaţi o dreaptă care să
pornescă din origine şi să treacă printre puncte. Ar trebui să obţineţi o astfel de curbă:

3
 Concentraţia citită pe curbă prin interpolare (X mg Glc) este utilizată la calcul după cum
urmează:

X mg Glc………………..1 ml filtrat
Y mg Glc………………..4 ml filtrat
Y=X4 mg Glc

Y mg Glc…………………..0,2 ml ser
Z mg Glc…………………..100 ml ser
Z = Y100 mg Glc /100 ml ser
0,2

Pentru trei probe de ser de cabaline au fost determinate extincţiile din tabelul următor:

Proba E630 Glucoză (mg/100ml ser)

1 0,11
2 0,21
3 0,14

Să se calculeze concentraţia de glucoză.

4
 DOZAREA GLIJCOZEI CU oTto-TOLUIDINA UTTLTZNTA CR iVIEIOPA Og
DETERMINARE A GLICEMIEI

Principiulmetodei
Dazareaglucozei sanguine constituie un indicator in diagnosticarea stdrilor de diabet,
precum qi in sesizarea stdrilor de dezechilibre nutri{ionale. Glucoza din sdnge, in prezen{a

orto-toluidiaei in mediu de acid acetic, la cald, printr-o reacfie de condens are, formeazd, un
amestec de glicozilamind" gibaza S chiff corespunz[toare:
H
I

o
O=C

H-c-oH
I
H
CHs
H gH,I
HO-C-6
I I

HO-C _NH Hoi=--D\

n-l.o*
I I

H-C_OH u-C-OH
th
Ho-c-6-l
I

H-c-oH
I

---- HO-C-P :--

cH2
I

-oH
I

H-c-oH - HrO
H-c-4H
I

i
rl
I
Glucoza - H-c-oH - n-LoH
I

cH^ cH2-oH cH2-oH

,\)
l' Glicozilamina Baza Schiff
)

orto-Toluidinf
Ca urmare a acestor reaclii apare o colora{ie verde-albastrd.Intensitatea culorii este

direct propor{ionald cu concentra{ia in glucozd a serului analizat. Metoda de dozare este

spectrofotometricl, pentru determinarea concentra{iilor probelor fiind necesatd o curbd

etalon. Determinarea spectrofotometricfl a extincfiilor se face la ]" : 630 nm. Valorile

extincfiilor se transformd in valori de concentra{ie cu ajutorul curbei etalon, rcalizatd pe
concentrafii cunoscute de glucozd.
 Prelucrarea probelor
in scopul determinflriiglicemiei, serul analizatse deproteinizeazdcttacidtricloracetic.
Se lucreaz[pe filtratul astfel obfinut.

Trasarea curbei etalon

Pentru oblinerea curbei etalon seutllizeaz[ o solufie stoc de ghtcozl de concentra{ie

50mgYo.

M Er Ez E3 8,, E5 E6 E,I Eg Ee Ero

Glc stoc 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

(rrr1)

HzO d 4 3,8 3,6 3,4 7)

")- J 2,8 2,6 2,4 )) 2

(ml)
Glc.10-3 0 25 s0 75 100 12s 1s0 t75 200 22s 2s0

(mglml)
Din 1 I 1 1 I I 1 1 I I 1

fiecare et.
a t a a a
R. o-T J J J J J J J -1 .,) J J

(rnl)

10 min. fierbere pe baie; r[cire;

Eo:o

R. o-T: reactiv orto-toluidin[

Se reprezintd grafic dependenla extincliei, inregistrat[ la ]" : 630 nm, de concentratia

glucozei exprimati in mg/ml.

Calcul
Pentru a exprima r ez;tiltatul '/o ml ser valoarea cititl pe curb[ se multiplicl cu 2000.

z mgglco/ontl.ser:2000 r x
Se poate aplica qi metoda cu solulie etalon:

z mgglcT, ml ser: (Ep -Es / Esr' Es) ' Cpr o 2000

2
 Interpretarea rezultatelor
Exprimarea glicemiei se face in mg glucozd 96 ml sersanguin.

Valorile normaleale glicemiei la diferite specii sunt urmdtoarele:

- Om: 80 - I l0 mg glc % ml ser;
- Suine:55 -100 mg glc Yomlser;
- Bovine :40 - 70 mg glco/oml ser;
- Cabaline: 58 - 1 15 mg glcYo ml ser.

Valori crescute ale concentraliei glucozei ?n s6nge - hiperglicemie - se reg[sesc in

diabetul zaharut qi reflectd o disfunc{ie a pancreasului (insuficien{[ in secre{ia de insulind).

Valori scdzuleale concentra{iei glucozei in s6nge - hipoglicemie - se reg6sesc in st[ri

de carenf[ alimentar[, disfunlii ale glandelor suprarenale, hipofizei qi ficatului.
 DOZAREA PROTEINELOR DIN PRODUSE YEGETALE

Confinutul in substanle proteice din produse vegetale poate fi exprimat prin

conlinut de: proteind brutd, proteind purd, proteind extractibild.

l. Proteina brutd
Con,tinutul in proteind brut6 se determin[ prin transformarea confinutului de azot
total Q.{1) al produsului vegetal in con}inut de proteind. Se gtie c[ in substanlele proteice
confinutul mediu de azot este de 16 %. Din acest motiv, un gram de azot se regdseqte in
6,25 grane protein5. Ca urmare, pentru a calcula procentul de protein[ brut[ trebuie sd
multiplicdm procentul de azot total cu factorul6,25.
X % PROTEINA BRUTA =Y "h Nt . 6,25
Denumirea de proteini brutd semnificl faptul cE am transformat tntregul conlinut
de azot in substanld proteic[. De fapt fesutul vegetal conline o serie de alte substanfe

azotatecare insd nu sunt de naturd proteici. Prin aceastd transformare globald am modificat

conlinutul real de proteind qi de aceea o numim proteind brut6.

2. Proteina pard
Pentru a determina confinutul real de protein[ facem o prealabil5 extracfie pentru
tndepirtarea unora dintre substanlele azotate neproteice. Se face apoi determinarea azotului
gi prin multiplicare cu factorul6,25 afl[m proteina pur[.

3. Proteina extractibild
Proteinele extractibile reprezirrtd, fracliunea de substanle proteice solubile qi deci
posibil de extras fie tn mediu apos, fie tntr-o solulie tampon. Determinarea confinutului de

substanle proteice tntr-un astfel de extract se poate face printr-o metodd spectro-

fotometricd qi anume metoda biuretului. Metoda urmlregte etapele obiqnuite de lucru:

- prelucrarea probelor (extracfia proteinelor solubile, efectuarea reacliei de

culoare cu reactivul biuret, determinarea extincfiei);

- trasarea curbei etalon specific[ metodei;
 - calcularea concentraliei de proteinl solubild.

Principiul metodei
Proteinele solubile pot fi determinate, din extracte vegetale, pe baza reacliei de
euloare pe care acestea o dau cu ionul cupric in mediu alcalin. in condiliile de reacfie, se

for:meazd un complex chelat, de culoare albastru-violet, intre ionul cupric qi legdturile

peptidice din proteinI. Pentru careac\ia sd aib5 loc este necesard prezenfa a celpultn doud
legdturi peptidice in compusul de natur[ protidica ce participd la formarea chelatului. Ca
unnare reaclia este pozitivd atit pentru proteine cAt qi pentru peptidele cu minimum doui
legdturi peptidice (cel pulin trei aminoacizi condensali).

fragment proteic
.HN - CH-
ttl CO - NH - CH - CO - NH - CH- CO......... + reactiv biuret

Rr R, R-3

compus albastru-violet

Metoda se numeqte a biuretului deoarece biuretul este un compus organic, de

naturd neproteicd, ce conline dou[ leg[turi peptidice, ce-i permit sd formeze 'urfi complex

chelat cu ionul cupric tn acelaqi mod cu proteinele.

HN
HN\\ r oC C -O Cu2*; HO-

2 C: O --------------+ ) compus chelat

HzN
,/
- NH3
\": o albastru-violet
H2N

uree biuret
Reacfia poate fi folosit[ intr-o determinare spectrofotometric[ deoarece intensitatea

coloraliei este direct proporlionald cu valoarea concentraliei proteinelor din prob6. Aceastd
metodl de determinare este bunl pentru aflarea confinutului in proteine extractibile din
lesutul vegetal dar nu permite determinarea conlinutului total de protein[. Existd proteine
str6ns legate in structura fesutului vegetal (in membrane celulare, in organite celulare etc.)

ce nu pot fi extrase prin aceastd metod[.

Prelucrarea probelor
Materialul vegetal se mojareazd, fin qi se supune extracfiei, in apd,la rece sau cu

uqoar[ incdlzire. in filtratul obfinut dup[ extraclie se realizeazd reac\ia biuretului gi se

I a$teapte formarea chelatului (dezvoltarea culorii albastru-violet). Solufia coloratd este

spectrofotometrat[ la ]u : 570 nm. Valorile gdsite sunt transformate in concentratii de

proteind cu ajutorul unei curbe etalon.

Trasarea curbei etalon

Pentru oblinerea curbei etalon se ttilizeazd o solutie stoc de albumind de
concentra{ie 10 mglml.

M E1 E2 E3 Ea E5 E6

Albumin[ (10mg/ml) 0 0,5 1 1,5 2 )5

-,- J

HzOd (ml) J )5 2 1,5 I 0,5 0

Conc. Alb. (,eg/3ml) 0 5 10 15 20 25 30

Reactiv biuret (ml) 5 5 5 5 5 5 5

20 minute repaus;

Eszo

Se reprezintd grafrc dependenla extincfiei, inregistratE la X 570 nrn, de

concentralia de albumin[ exprimat[ inpg/3ml.

Calcul
Pentru calcularea confinutului de proteind extractibil[ din probi extincfia cititd la
570 nm este transformatd, prin interpolare pe curba etalon, in concentralie de proteind.
Jindnd cont de rapoartele volumetrice de lucru, rezultafi;J glsit este exprimat in final la
suta de grame de material vegetal.
 Dozarea proteinelor din produse vegetale

Partea experimentală

Proteina brută
Această modalitate de exprimare a conţinutului de proteină este frecvent utilizată în
agricultură. Chiar dacă rezultatul este mai puţin exact, este suficientă această exprimare pentru a
putea evalua calitatea unui soi nou, sau influenţa solului şi a utilizării de amendamente asupra
culturii obţinute.

Proteina pură
Această modalitate de exprimare a conţinutului de proteină este mai puţin utilizată fiind
însă mai exactă şi potrivită pentru cercetare.

Proteina extractibilă
Această modalitate de exprimare a conţinutului de proteină este potrivită pentru
determinarea proteinelor din surse vegetale. Sensibilitatea metodei este în domeniul
miligramelor. În cazul proteinelor de provenienţă animală şi în cazul enzimelor în general se
folosesc metode mai sensibile (domeniul µg) cum este metoda Lowry. Metoda Lowry este
obţinută prin îmbunătăţirea metodei biuret fiind foarte utilizată în biochimie şi mai ales în
enzimologie.

Extracţie
- Se cântăresc 5 g material vegetal, se mojarează fin şi se trec cantitativ cu apă distilată într-un
balon cotat de 100 ml;

- după 15 minute baloanele se aduc la cotă cu apă distilată, iar conţinutul se omogenizează;

1
- extractul proteic se filtrează prin filtu cutat.

Dozare
- Din filtratul obţinut anterior se măsoară 3 ml şi se tratează cu 5 ml reactiv biuret;

2
- probele se ţin în repaus 20 minute pentru dezvoltarea compusului colorat;
- se determină extincţia la =570 nm.

Calcul
Valorile pentru extincţia probelor sunt transformate în valori de concentraţie cu ajutorul
unei curbe etalon. Se pregăteşte o serie de soluţii etalon de albumină utilizând ca soluţie stoc
albumină de concentraţie 10 mg/ml.

Se adaugă reactiv biuret şi după 20 de minute repaus se citesc extincţiile etaloanelor la

570 nm.

M E1 E2 E3 E4 E5 E6
Albumină (mg/3 ml) 0 5 10 15 20 25 30
E570 0 0,09 0,19 0,27 0,36 0,49 0,62

Pentru realizarea curbei etalon utilizaţi hârtie milimetrică! Trasaţi o dreaptă care să
pornescă din origine şi să treacă printre puncte. Curba etalon arată astfel:

3
 Concentraţia citită pe curbă prin interpolare (X mg proteină) este utilizată la calcul după
cum urmează:

X mg proteină………………..3 ml filtrat
Y mg proteină……………..100 ml filtrat
Y=X100 mg proteină
3

Y mg proteină …………………..5 g material vegetal

Z mg proteină ………………...100 g material vegetal
Z = Y100 mg proteină /100 g material vegetal
5

Seminţele a patru probe au fost analizate pentru determinarea conţinutului de proteină

extractibilă prin metoda biuret. În urma analizei au fost determinate extincţiile din tabelul
următor:

Probă E570 Proteină extractibilă (g%)

Fasole 0,22
Mazăre 0,25
Linte 0,21
Năut 0,32

Să se calculeze concentraţia de proteină extractibilă, iar valorile finale, transformate în

grame proteină /100 g probă să fie trecute în tabel.

4
 DOZAREA IODATOMETRICA A VITAMINEI C

Vitamina C este o vitamini hidrosolubild foarte r[spAndit[ in regnul vegetal. Ea poate fi

sintetizatd qi de animale cu exceplia primatelor, cobaiului qi omului. in cantitate mare o g[sim in
m[ceqe, coacilze, citrice, hrean, pdtrunjel etc; apare mai mult in fructe qi fiunze qi mai pufin in rdd[cini.

Din punct de vedere chimic este y - lactona unui acid hexonic. in stare pur[ este o substan{[
solid[, cristalin[, uqor oxidabild (chiar qi cu oxigen atmosferic). Vitamina C poate exista in stare redusd
(acid ascorbic) sau in stare oxidatil (acid dehidroascorbic). intre cele dou[ forme se stabileqte un
echilibru ce permite vitaminei C s[ participe la procesele de oxidare qi reducere din organism.

c:o
I
C_ o
I
C-OH -2lF^* C: o
ll I
o C- OH O C: o
I ,t
I
C-H
I
+2H' -c- I
H
HO- C-H HO-C- H
I I
cH2 - oH cH2 - oH
acid ascorbic acid dehidroascorbic

Vitamina C este foarte important[ pentru organism indeplinind numeroase roluri: stimuleazd
metabolismul glucidic, lipidic, protidic; participd la procese redox din organism; arc acliune
antioxidantd penhu unii compugi metabolici (vitamine liposolubile, glutation etc.); intervine in
procesele de osificare.

Caren\a in vitamind C determind apai\ia scorbutului care se manifestfl prin gingivite,

hemoragii, tulburdri digestive, anemii, stari subfebrile etc.
Determinarea carllritativd a vitaminei C se poate face printr-o metodd volumetricd numitd
iodatometrle. Metoda presupune re alizarea etapelor de extrac{ie qi dozare propriu-zis5.

Extrac{ie
Extraclia vitaminei C se face in mediu acid deoarece stabilitatea ei este astfel mai mare gi se
evit[ oxidarea cu oxigen atmosferic.
 Dozare
Dozarea vitamiaei Cse face ln extractul vitaminic obfinut din produsul vegetal pe baza reacliei
de oxidare a ei cu iod la acid dehidroascorbic. Iodul necesar este pus in libertate direct in mediu in urma
reacliei dintre iodura de potasiu ;i iodatul de potasiu in prezenla acidului clorhidric. in momentul
oxiddrii intregii cantit[ti de acid ascorbic, in mediu apare iod in exces carc fu prezenla amidonului
formeazd un complex de incluziune de culoare albastrd ceea ce ne indic[ punctul de echivalen!6.
Reactivul de titrare folosit este iodatul de potasiu. Reac{iile care au loc sunt:

5KI + KIO: + 6HCl ---------+ 3I2 + 6KC1 + 3HzO

C:O
I
c:o
I
I
C-OH c:o
I
o C-OH + I, o C:O + 2HI
t-
t_ C-H L- C-HI

HO- C-H
I
- HO- C-H
I

I I
CHz - OH cHz - oH

12 (exces) + amidon complex (amidon - 12)

albastru

Calcul
Se lucreazd o probd (P) qi w martor (M -nu confine extract vitaminic). Titrarea probei qi a
martorului se fac cu KIO3 0,001 N pAnd,la bleu. Se noteazd volumele de KIO: folosite la titrarea probei
(Vp)qiamartorului(Vm).VolumuldeKlO:consumatlaoxidareavitamineiCvafi: V:Vp-Vm.
Xgvit.6 : (VxFxN)pt. KIO: xmEgpt.vit.C
Transformim g in mg deoarece conlinutul in vitamine fiind mic se exprim[ in mg; inlocuim
V = Vp- Vm; F:1(deoareceKlO3estesolulieetalon); N:0,00lpt.KIO3 qi mEgvit.C: 0,088 g
(deoarece Egvit. C: L7612 : 88g):

X mg vit. C : (Vp - Vm) x 0,088

X mg vit. C..........................v ml extract

Ymgvit. C.............. Vt mlextract

Ymgvit. C : 0,088x(Vp - Vm)xVt / v
Y mg vil C ..........................p g material vegetal

Z ms vit. C ......................... I 00 e material veqetal

Z : 0,088x(Vp -Vm)xVtx100l vxp mgvit. C % g materialvegetal

 Dozarea iodatometrică a vitaminei C

Partea experimentală

Extracţia vitaminei C
- o cantitate exact cântărită de probă (p = 5 g) se mojarează fin şi se trece cantitativ într-un
balon cotat de 100 ml. Extracţia se face în acid clorhidric 2%;

- după 15 minute repaus, se aduce la cotă cu acid clorhidric şi se omogenizează;

- extractul vitaminic se filtrează prin filtru cutat.

1
Dozarea vitaminei C
Din extractul obţinut anterior se măsoară v = 2 ml într-un pahar Erlenmeyer şi se adaugă
iodură de potasiu şi amidon.

Proba se titrează cu iodat de potasiu (KIO3) de concentraţie 0,001 N până la viraj bleu
pal. Se citeşte la microbiuretă volumul de iodat de potasiu (Vp) folosit la titrarea probei. În
paralel se lucrează şi un martor pentru a vedea cât iodat de potasiu se consumă în absenţa
vitaminei C. În cazul martorului volumul de 2 ml extract se înlocuieşte cu 2 ml acid clorhidric
2%.

După titrarea martorului se notează volumul de iodat de potasiu folosit (Vm); se scade
Vm din Vp iar volumul obţinut (V = Vp - Vm) este utilizat pentru a calcula conţinutul de
vitamină C din probă.

Calcul
Pentru calcul concentraţiei de vitamină C din probă utilizaţi ecuaţiile prezentate în
referat!

Patru probe vegetale au fost analizate pentru determinarea conţinutului de vitamină C

prin metoda iodatometrică. Volumele de iodat de potasiu folosite la titrarea probelor (Vp) şi a
martorilor (Vm) sunt prezentate în tabelul următor:

2
 Probă Vp Vm Vitamină C
(ml) (ml) (mg/100 g)
Pătrunjel 1,63 0,04
Leuştean 0,97 0,04
Tomată 0,21 0,04
Portocală 0,66 0,04

Să se calculeze concentraţia de vitamină C din probele analizate.