Laboratorul nr.

Localizarea enzimelor

Tirozinaza

Tirozinaza este o enzima extracelulara, prezenta în celulele animalelor, plantelor si

microorganismelor.Este larg răspândită în natură, are masa moleculara de aproximativ 30-50
kDa, iar pH-ul optim variaza la enzimele din surse microbiene în aria neutră şi uşor acidă, cu
unele exceptii.
Funcțiile biologice ale tirozinazelor în celulele plantelor nu sunt bine cunoscute dar
prezenta lor este evidentă. Astfel, după lovire sau tăiere, în timp relativ scurt, în funcție de sursă,
locul afectat al plantei se brunifică. Acest fenomen este vizibil la unele plante cum sunt cartofii,
perele, merele sau bananele. Brunificarea este rezultatul oxidării fenolilor și chinonelor naturale.
În celulele mamiferelor tirozinaza catalizează biosinteza pigmenților melaninici în doua
etape plecând de la tirozina (Figura 1). Reacțiile au loc în melanocite și produc pigmenții care
determină culoarea pielii, părului și ochilor. Tirozinaza localizată în piele este activată de razele
ultraviolete determinând producerea melaninei și în final bronzarea.

Fig.1 Oxidarea tirozinei la dopacrom în prezența tirozinazei

Tirozinaza are codul E.C. 1.14.18.1, care dă următoarele informaţii despre această
enzimă: 1 → clasa oxidoreductaze;
14 → acţionează asupra unei perechi de donori de H, cu încorporarea sau reducerea
oxigenului molecular;
18 → un donor poate sa încorporeaze un atom de oxigen în celălalt donor;
1→ prima enzimă din subclasa din care face parte.
Denumirea sistemică a tirozinazei este: monofenol, L-DOPA:oxigen oxidoreductaza
Informaţiile furnizate de aceasta denumire arata că donorul de hidrogen este reprezentat
de monofenol si L-DOPA iar acceptorul este oxigenul.
Tirozinaza este o metaloproteină care include în structura situsului catalitic o pereche de
ioni de Cu2+. Enzima poseda doua situsuri catalitice: unul catalizează hidroxilarea
monofenolilor pentru a forma o-difenoli (activitate monofenolazică) şi celalalt catalizeaza
oxidarea o-difenolilor la chinonele corespondente (activitate difenolazică). Tirozinazele sunt deci
enzime bifuncţionale.
Tirozinaza este enzima care limitează rata de biosinteză a pigmenţilor melaninici
(melanigeneză), începând de la tirozină ca substrat precursor. Melaninele sunt polimeri
polifenolici heterogeni ale căror culori variază de la galben la negru. In ciuperci melanina este
responsabilă pentru brunificarea ţesutului rănit, când acesta este expus la aer şi de brunificarea
apărută în timpul depozitării post-recoltare. În agricultură aceasta este o mare problemă, cu un
impact economic imens, fapt care face extrem de importantă identificarea compușilor care face
posibilă formarea melaninei.
La oameni, rolul principal al melaninei este fotoprotecţia pielii prin absorbţia radiaţiilor
UV care produc deteriorarea ADN şi formarea unor specii de oxigen reactiv. Deficienţa
melaninei la om cauzează boli ca albinismul oculocutanat şi vitiligo. S-a manifestat de asemenea
un mare interes faţă de implicarea melaninei în melanosomii maligni, tumorile carcinogene ale
pielii. Relaţia dintre neuromelanină şi deteriorarea neuronilor şi vulnerabilitatea lor selectivă în
boala Parkinson au fost deasemenea subiectul unei atenţii mărite. Producerea anormală de
melanină a cauzat o arie de probleme relevante din punct de vedere estetic precum: puncte negre,
melasma (zone mari de piele închise la culoare) şi aluniţe.

Aplicatii ale tirozinazei

Studii privind utilizarea microorganismelor pentru utilizarea acestora în scopul producerii
de tirozinaze se datorează capacității acestora de a fi utilizate in diferite procese biotehnologice,
industria alimentară, industria textilă, industria hârtiei și medicină.
Principala aplicaţie este în detoxifierea apelor uzate şi a solurilor contaminate care conţin
fenoli. Compuşii fenolici sunt transformaţi de enzimă la chinone care autooxidează pentru a
forma compuşi polimerici insolubili care precipită din apă.
Compuşii fenolici sunt prezenţi în apele uzate rezultate din mai multe industrii, cum ar fi
conversia cărbunelui, răşinilor şi maselor plastice, rafinării petroliere, textile, vopsele, fier şi oţel
(Brasquet și colab., 1999). Fenolii sunt poluanţi toxici din reziduurile industriale care induc mai
multe tipuri de riscuri pentru sănătatea oamenilor, dintre care unele posibil carcinogene, în plus
fenolii produc colorarea apelor primite, de aceea decontaminarea acestor produşi este
esenţială.(Singh și Singh 2002).
Tratamentele convenţionale folosite în mod normal (oxidare şi adsorbție biologică şi
chimică) de multe ori nu pot genera efluenţi finali cu calitatea ceruta pentru a putea fi eliberaţi la
costuri rezonabile. Se caută tehnologii alternative pentru tratamentul apelor uzate care conţin
fenoli, pentru a depăşii piedicile tratamentului convenţional, cum ar fi aria restrânsă a
concentraţiei de contaminant care poate fi tratată, întârzieri asociate cu aclimatizarea biologică şi
generarea unor volume ridicate de nămol.
Mai mulţi cercetători au studiat folosirea enzimelor în tratamentul apelor uzate (Karam și
Nicell 1997). Aplicaţiile enzimelor oxidoreductive cum sunt tirozinaza, peroxidaza şi lacaza în
îndepărtarea fenolilor şi derivaţilor săi a devenit o metodă foarte importantă şi eficientă. ( Ikehata
și Nicell 2000, Krastanov., 2000). Tirozinaza oferă avantajul faţă de celelalte sisteme de enzime
care au fost folosite pentru îndepărtarea fenolilor, că oxidantul este oxigenul molecular, nu
peroxidul de hidrogen, acest fapt reducând, teoretic, costul potenţial de aplicare al tehnologiei.
(Hamed și colab., 2008)
Un alt domeniu în care se utilizează tirozinaza este medicina. Astfel putem aminti sinteza
unor substanţe chimice cu importanţă comercială ca 3,4 – dihidroxi – L – fenilalanina (L-
DOPA), care este medicamentul preferat pentru tratamentul bolii Parkinson. Hidroxityrosolul, un
antioxidant puternic, prezent din abundenţă în măsline, a fost de asemenea sintetizat cu
tirozinază din tyrosol. Chen și colaboratorii (2002) au relatat o utilizare nouă a tirozinazei pentru
conjugarea in vitro a proteinei gelatină la chitosan polizaharid.
Biosenzori care au la bază tirozinaza au fost proiectaţi pentru a măsura fenoli, polifenoli şi
pesticide. (Shuster și colab., 2009)
În industria alimentară această enzimă este utilizată pentru îmbunătățirea calităților
texturale a produselor din cereale, lapte și carne. De exemplu, la producerea pâinii calitatea slabă
a făinii poate fi îmbunătățită prin utilizarea de enzime oxidative cum este tirozinaza.
Deși studii ample arată importanța utilizării acestor enzime în industria alimentară, încă
exista o reținere de promovare a acestora în industrie.
Prepararea solutiei enzimatice
Pentru a evalua prezența enzimei se vor lua parti din ciuperca din 3 zone diferite (A, B si
C) asa cum puteti vedea in figura 2, apoi se mojarează in prezenta de nisip de cuarț; se lasă la
extras 30 minute in 10 ml apa distilată la 40C, se centrifughează la 6.000 rpm, 15 minute si se
păstrează supernatantul. Vom obtine astfel 3 preparate proteice cu activitate tirozinazica din
cele 3 zone ale ciupercii, carora le vom determina activitatea enzimatica a tirozinazei.
In paralel vom realiza si o proba din toata ciuperca.

B
B

Fig.2. Zonele unde se afla tirozinaza in ciuperci

Determinarea activității enzimatice a tirozinazei (Metoda utilizată de noi a fost adaptată după
Markstein, J.A. și Posner, H.B.).
Pentru determinarea activității tirozinazei se analizează dispariția substratului care este L-
DOPA si apariția produsului dopacrom, care este un compus de culoare rosu-caramiziu si se
determina spectrofotometrică la λ=475 nm..

Principiul metodei
Metoda utilizată de noi folosește ca substrat L-DOPA. Aceasta în prezența enzimei și a
oxigenului din aer este oxidată, convertită la dopachinonă și apă. Dopachinona este instabilă și
trece rapid, practic instantaneu, în dopacrom, un pigment rosu-portocaliu. Dopacromul este
suficient de stabil o perioadă destul de îndelungată pentru a permite determinarea
spectrofotometrică a concentrației sale în mediul de reacție. Reacțiile care au loc în acest proces
plecând de la tirozină sunt prezentate în figura 1.
Reactivi şi soluţii
1. Tampon fosfat 0,1 M, pH = 6,0;
2. Se realizează o soluție din 100 mM de L – DOPA în tampon fosfat;
3. Preparat proteic cu activitate tirozinazică.
Realizarea curbei dopacrom standard.
- Într-o eprubetă, învelită în folie de aluminiu, se amestecă bine 10 mL de soluție
standard L-DOPA cu 2,5 mL EPT și se lasă să acționeze la 300C timp de 15
minute. Se realizează astfel o soluție stoc (12,5 mL) de dopacrom care va conține
80 μmoli dopacrom per mL;
- Pentru realizarea curbei etalon de dopacrom se realizează diluții conform
tabelului:
Tampon fosfat, Concentrație
Nr. Soluție stoc
dopacrom,
proba dopacrom, mL mL μmoli/mL

1 2.0 0.0 80

2 1.5 0.5 60

3 1.0 1.0 40

4 0.5 1.5 20

5 0.2 1.8 8

6 0.1 1.9 4

7 0.0 2.0 0

-
-
- Absorbanța probelor realizate prin diluția corespunzătoare a soluției stoc de dopacrom se
citește la 475 nm față de proba martor ( proba 7 din tabel);
- Se reprezintă grafic curba etalon unde concentrația cunoscută de dopacrom se pune pe
axa X, iar densitățile optice/absorbanțele pe axa Y.
 E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7

C dopacrom 0 4 8 20 40 60 80
(μmoli/mL)
0.00 0.03 0.05 0.14 0.30 0.44 0.62
DO λ=475 nm

R² = 0,9985

DO λ=475 nm = 0,0077x concentratia - 0,0069

C dopacrom = (DO λ=475 nm + 0,0069) / 0,0077
REZULTATE:

DO zona A DOzona B DO zona C DO toata ciuperca DOM

DO λ=475 nm 0,297 0,086 0,065 0,450 0,045
C dopacrom
(μmoli/mL)
C proteina totala= 2,7 mg/mL

Determinarea activității enzimatice

Activitatea tirozinazei se determină prin măsurarea vitezei cu care substratul este
convertit în produs.
Pentru determinarea activității, într-o eprubetă sau chiar direct în cuva spectrofotometrică
se pun, dupa ce au fost aduse la o temperatură de 300 C, 0.5 mL soluție stoc de L-DOPA (50
μM) și 0.5 mL soluție enzimatică. Se acoperă cuva cu parafilm și se amestecă compoziția. Se
citește absorbanța după exact 1 minut.
Calculul rezultatelor
Activitatea tirozinazică a preparatului proteic se exprimă prin folosirea curbei etalon.
Astfel, se calculează viteza de reacție (AE), mai exact, câți micromoli au fost transformați dintr-
un mL de proba, într-un minut (μmoli/mL/minut).
O unitate de tirozinază este definită ca fiind cantitatea de enzimă ce oxidează 1 μmol de
L-DOPA la dopacrom, într-un minut, la 300C.
De asemenea, cunoscând coeficientul de extincție al dopacromului la 475 nm, care este
de 3,6 cm2/ μmoli putem folosi legea lui Beer-Lambert și determina activitatea prin diferența de
absorbanțe între probă și martor pe minut, raportată la coeficientul molar al dopacromului
convertit în μmoli. De asemenea, trebuie să se țină cont de faptul că în determinare se iau doar
0,5 mL de soluție enzimatica, deci se va înmulți cu 2 pentru o raportare corectă, deoarece curba
referitoare la dopacrom este efectuată determinând D.O. pentru concentrații de μmoli la 1 mL.
Astfel se va folosi relația:

Concentratie dopacrom din proba−Concentratie dopacrom din martor

AE = x2
3,6
<AE> = [μmoli dopacrom/mL/min]

Dacă dozăm și concentrația proteică în preparatul cu activitate enzimatică analizat, putem

exprima activitatea enzimatică sub forma activității enzimatice specifice:
AE
AES =
𝐶 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑐𝑎 

<AES> = [μmoli dopacrom/mg proteina]