Determinarea activității enzimatice a

transaminazelor plasmatice prin metoda

enzimatic-cinetica
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

Transaminazele sau aminotransferazele sunt enzime intracelulare care catalizeaza

transferul unei grupări amino de la un aminoacid la un α-cetoacid. Această reacție are ca
rezultat formarea unui nou aminoacid și a unui nou α-cetoacid.
Transaminarea este un proces general de degradare și sinteză a aminoacizilor. Două
enzime au fost studiate în special în biologia clinică, acestea fiind: aspartate
aminotransferaza (AST) si alanin aminotransferaza (ALT).

ALT si AST sunt răspândite în țesuturi, în principal în ficat și mușchii netezi (cardiaci) și
striați (scheletici), dar și în pancreas, creier și rinichi.

Deoarece transaminazele sunt enzime localizate strict intracelular, acestea sunt eliberate
în plasmă prin citoliză. Astfel, un nivel ridicat de transaminaze în ser este reflectarea
unei leziuni celulare în general la nivelul ficatului, inimii, rinichilor sau mușchilor.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

1. Alanin aminotransferaza (ALT) numită anterior glutamat piruvat transaminaza (GPT) este o enzimă
citoplasmatică care catalizează o reacție reversibilă care permite dezaminarea alaninei cu formarea
piruvatului. Acesta din urmă poate intra in calea gluconeogenezei sau a ciclului Krebs. Această enzimă
se găsește în hepatocite și celule musculare striate scheletice.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

ALT este o enzimă hepatica ce crește semnificativ în tulburările

hepatobiliare. Orice creștere semnificativă a concentrației ALT indică
distrugerea celulelor sau creșterea permeabilității membranei.
Determinarea activității serice permite, prin urmare, demonstrarea
leziunilor de citoliză. Eliberarea în sânge are loc la câteva ore după
leziune, iar timpul de înjumătățire al enzimei este scurt.
La carnivore, alanin aminotransferaza (ALT sau GPT) este un marker
major al suferinței hepatice, dar o creștere a concentrației sale serice se
găsește și în cazul unei patologii musculare severe.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
2. Aspartat aminotransferaza (AST) numită anterior glutamat oxaloacetat transaminază
(GOT) este o enzimă citoplasmatică și mitocondrială care catalizează o reacție reversibilă
care permite dezaminarea aspartatului cu formarea oxaloacetatului care poate intra în ciclul
Krebs. Cu toate acestea, acestei enzime îi lipsește specificitatea, deoarece se găsește în
cantități mari în diferite organe: mușchii scheletici striați și inima, ficatul, rinichii, creierul și
alte țesuturi, inclusiv eritrocitele.

AST
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

Pe de altă parte, nivelurile ridicate de AST se pot asocia cu tulburari la nivelul

inimii sau mușchiului scheletic, precum și ale parenchimului hepatic.
Măsurarea paralelă a ALT și AST este efectuată pentru a distinge între leziuni
hepatice, cardiace sau musculare. Localizarea citosolică a transaminazelor
permite eliberarea lor imediată. Durata și amploarea activității
transaminazelor măsurate secvențial pot prezice activitatea și severitatea bolii.
Măsurarea activității serice a enzimelor „hepatice” este un indicator foarte util
al afectării hepatobiliare.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
Principiul metodei
Măsurarea activității catalitice a ALT (ALT) utilizează două reacții consecutive:
1. ALT catalizează transferul reversibil al unei grupari amino de la alanină la ⍺-
cetoglutarat cu formare de piruvat și glutamat.

COO- COO- COO- COO-

ALAT
H3N C H + C O C O + H3N C H
CH3 CH2 CH3 CH2
CH2 COO- CH2 COO-
L-Alanine -Cétoglutarate Pyruvate L-Glutamate
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
2. Piruvatul produs este apoi redus la lactat, o reacție enzimatică catalizată de enzima lactat
dehidrogenază (LDH) în prezența cofactorului (NADH).
COO- COO-
LDH HO C H
C O + NADH + H+ + NAD+
CH3 CH3
Pyruvate L-Lactate

NADH (formă redusă) absoarbe în ultraviolet (UV) la 340 nm, în timp ce NAD + (formă
oxidată) nu absoarbe la această lungime de undă. Prin urmare, este posibil să se măsoare
activitatea enzimatică a reacției secundare catalizate de LDH urmarind scăderea absorbantei
la 340 nm (corespunzătoare consumului de NADH în timpul reacției enzimatice secundare) și
astfel să se deducă din aceasta activitatea enzimatică din ALT.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

- Tampon Tris-HCl pH 7,15 ……….....................................140 mmol/L

Reactiv 1 - L-Alanina …...................................................................700 mmol/L
- LDH……………………………………………………………………………>2300 mmol/L
- α-cetoglutarat…………………………………………….…….85 mmol/L
Reactiv 2
- NADH……………………………………………………………....85 mmol/L
Proba - Ser/plasma recoltat pe heparina sau EDTA
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

Reactiv Proba
Ser (µL) 100
Reactiv de lucru (µL) 1000
Se amestecă 4 parti R1 cu 1 parte R2.
Se amestecă și se incubează 1 minut. Se citeste absorbanța inițială la 340
nm, și apoi se citeste absorbanța în fiecare minut timp de 3 minute.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

∆ 𝐀 / 𝐦 𝐢𝐧 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐫𝐞𝐚𝐜𝐭𝐢 𝒆
𝐀 𝐋 𝐓 [𝑈 𝐼 / 𝐿 ]= × ×10
3
𝛆× 𝐥 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐩𝐫𝐨𝐛𝐚

ε - coeficientul de absorbție molară al coenzimei NADH la 340 nm; ε = 6,3 L / mmol / cm

l - lungimea traseului optic al celulei de măsurare utilizate (aici 1 cm).
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
Niveluri scăzute de ALT
- nivelurile scăzute de ALT pot indica existența bolilor hepatice in stare grava:
unele hepatotoxine inhibă transcrierea genelor sau interferă cu biosinteza
ALT (de exemplu, hepatotoxicitatea indusa de aflatoxina B1,
hepatotoxicitatea data de microcistin, o cianotoxină produsă de bacteriile
cianoficea)
- nivelurile scăzute de ALT pot implica, de asemenea, o reducere a viabilității
hepatocitelor, în stadiul final al hepatitei cronice sau al bolii hepatice acute
severe. Tulburările altor organe pot provoca, de asemenea, suferinta
hepatica, de exemplu, insuficiența cardiacă congestivă poate duce la o
circulație sanguină slabă, stagnarea fluxului sanguin hepatic și o funcție
hepatică slabă.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
Niveluri ridicate de ALT
- Nivelurile foarte ridicate de ALT (>1000 UI/L) indică întotdeauna necroză hepatică
severă, de obicei legată de hepatita virală (infecția câinilor cu virusul hepatitei
Rubarth, hepatita ischemică sau afectarea ficatului din cauza unui medicament sau
a unei toxine).
- Hepatitele parazitare date de leishmania, infecții cu Hepatozoon sau Neospora.
- Leptospiroza este o cauză a hepatitei bacteriene. Un număr de medicamente
(anticonvulsivante, antibiotice, antiinflamatoare, deparazitare) sunt susceptibile de
a provoca hepatită.
- Substantele toxice (pesticide, amanita faloidă, tetraclorură de carbon,
acetaminofen și nitrozamină) acționează, de asemenea, asupra ficatului și pot
crește activitatea serică a ALT.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

Principiul metodei
Măsurarea activității catalitice a AST (GOT) utilizează două reacții consecutive:
1. AST catalizează transferul reversibil al unei grupări amino de la aspartat la alfa-
cetoglutarat pentru a forma oxaloacetat și glutamat.

COO- COO- COO- COO-

ASAT
H3N C H + C O C O + H3N C H
CH2 CH2 CH2 CH2
COO- CH2 COO- COO- CH2 COO-
L-Aspartate -Cétoglutarate Oxaloacétate L-Glutamate
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
2. Oxaloacetatul produs este apoi redus la L-malat, o reacție enzimatică catalizată de
enzima malat dehidrogenază (MDH) în prezența unui cofactor (NADH).
COO- COO-
M DH HO C H
C O + NADH + H+ + NAD+
CH2 CH2
COO- COO-
Oxaloacétate L-Malate

NADH (formă redusă) absoarbe în ultraviolet (UV) la 340 nm, în timp ce NAD + (formă
oxidată) nu absoarbe la această lungime de undă. Prin urmare, este posibil să se
măsoare activitatea enzimatică a reacției secundare catalizate de MDH urmarind
scăderea absorbției UV la 340 nm (corespunzătoare consumului de NADH în timpul
reacției enzimatice secundare) și astfel să se deducă din AST enzimatic activitate.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

- Tampon Tris-HCl pH 7,15 ………....................................140 mmol/L

- L-aspartat …..................................................................700 mmol/L
Reactiv 1 MDH………………………………………………..…………………………2300 mmol/L
-

- α-cetoglutarate……………………………………………………………….85 mmol/L
Reactiv 2 - NADH………………………………………………………………………………..85 mmol/L

Proba - Ser sau plasma recoltat pe heparina sau EDTA

Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

Reactiv Proba
Ser (µL) 100
Reactiv de lucru (µL) 1000
Se amestecă 4 parti R1 cu 1 parte R2.
Se amestecă și se incubează 1 minut. Se citeste absorbanța inițială la 340 nm, și
apoi se citeste absorbanța în fiecare minut timp de 3 minute
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

∆ 𝐀 / 𝐦 𝐢𝐧 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐫𝐞𝐚𝐜𝐭𝐢 𝒆
𝐀 𝐒 𝐓 [ 𝑈 𝐼/ 𝐿 ] = × × 10
3
𝛆× 𝐥 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐩𝐫𝐨𝐛𝐚

ε - coeficientul de absorbție molară al coenzimei NADH la 340 nm; ε = 6,3 L / mmol / cm

l - lungimea traseului optic al celulei de măsurare utilizate (aici 1 cm).
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice
Creșterea AST indică de obicei leziuni hepatice dacă ALT, bilirubina și fosfataza alcalină sunt, de asemenea,
crescute.
Afectarea ficatului (inflamație, hipoxie, toxic, traume, neoplazie etc.) determină eliberarea de AST din
hepatocite și, prin urmare, o creștere a activității sale serice. Nivelurile foarte ridicate de AST (1000 UI/L) se
datorează de obicei hepatitei virale, hepatitei ischemice sau leziunilor hepatice datorate unui medicament sau
unei toxine. Cele două transaminaze vor fi analizate simultan.
Măsurarea paralelă a ALT și AST se efectuează pentru a distinge între leziuni hepatice, cardiace sau
musculare. Dacă numai activitatea AST este crescută (fără creșterea ALT), aceasta poate indica boli cardiace
sau musculare (infarct miocardic). Activitatea fizică viguroasă la câini poate, de asemenea, să creasca
activitatea AST.
Raportul AST/ALT va fi calculat, deoarece oferă informații despre tipul de leziune sau boală hepatică implicată.
- Valoarea normală a raportului este de aproximativ 0,8.
- AST/ALT<0,8 poate apărea in cazul hepatitei sau steatozei hepatice
- AST/ALT>0,8 poate apărea în cazul cirozei, metastazelor sau congestiei
- AST/ALT>3.0 poate apărea imediat după leziuni musculare.
 Determinarea activității enzimatice a transaminazelor
plasmatice

La carnivore, aspartat aminotransferaza (AST sau GOT) nu este recomandata pentru a se

măsura singură, ci mai degrabă într-un set de markeri pentru explorarea hepatica.
AST indică prezența unor daune mai recente/active. La rumegătoare și cai, aspartat
aminotransferaza este un marker mai bun decât ALT pentru confirmarea leziunilor
hepatocelulare.
Testul de AST este indicat pentru a detecta necroza cardiacă sau afectarea ficatului. O
valoare AST serică crescută nu este specifică bolilor hepatice, valorile AST ar trebui
interpretate împreună cu rezultatele altor enzime hepatice, cum ar fi alanin
aminotransferază (ALT).