ANALIZA UNOR ENZIME CU IMPORTANŢĂ CLINICĂ

COORDONATOR ŞTINŢIFIC, CANDIDAT,

Prof. Dr. VIORICA DULMAN PAVELIUC CARMEN

IAŞI 2006
CUPRINSUL LUCRĂRII:

 SCURT ISTORIC
 1.NOŢIUNI GENERALE
 2.NOMENCLATURA ŞI CLASIFICAREA ENZIMELOR
 3.CINETICA ENZIMATICĂ:
3.1. MECANISMUL CATALITIC AL ENZIMELOR
3.2. FACTORI CE INFLUENŢEAZĂ REACŢIILE ENZIMATICE
3.3. CALCULUL ACTIVITĂŢII ENZIMATICE
3.4. ENZIME CA REACTIVI
3.5. ENZIME CA MARKERI
3.6. METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE
 4. ENZIME CU IMPORTANŢĂ CLINICĂ
4.1. DISTRIBUŢIA INTRACELULARĂ A ENZIMELOR
4.2. CLASIFICAREA ENZIMELOR
4.3. CONTROLUL DE CALITATE AL ANALIZELOR DE LABORATOR
4.4. PRINCIPALELE ENZIME CU VALOARE DE DIAGNOSTIC
4.4.1.CREATINKINAZA
4.4.2.LACTATDEHIDROGENAZA
4.4.3.ASPARTAT TRANSAMINAZA
 4.4.4. ALCALINTRANSAMINAZA
4.4.5. FOSFATAZA ALCALINĂ
4.4.6. FOSFATAZA ACIDĂ
4.4.7. -GLUTAMIL TRANSFERAZA
4.4.8. AMILAZA
4.4.9. 5’-NUCLEOTIDAZA
4.4.10. LEUCINAMINO PEPTIDAZA
4.4.11. ALDOLAZA
4.4.12. GLUCOZO-6-FOSFAT DEHIDROGENAZA
4.4.13. LIPAZA
4.4.14. COLINESTERAZA
 5.VALOAREA DIAGNOSTICĂ A DETERMINĂRILOR DE ENZIME
5.1. INFARCTUL MIOCARDIC
5.2. BOLI ALE MUSCULATURII
5.3. BOLI SANGVINE
5.4. BOLI ALE OASELOR
5.6. BOLI ALE FICATULUI ŞI CĂILOR BILIARE
5.7. NEOPLAZII
5.8. DEFECTE ENZIMATICE FAMILIALE
 6. METODE AUTOMATIZATE DE ANALIZĂ A ENZIMELOR
1. NOŢIUNI GENERALE

 Termenul de “enzime”= catalizatori naturali= proteine cu proprietăţi de catalizatori biochimici

 Structura şi specificitatea enzimelor conduc la o diferenţiere netă a catalizei enzimatice de
cea chimică prin faptul că:
-eficienţa catalizei enzimatice este mai mare decât cea a catalizei chimice
-enzima acţionează în condiţii blânde de pH,T,presiune osmotică, spre deosebire de
cataliza chimică care activează în general în condiţii dure de reacţie.
 Eficienţa catalitică enzimatică este exprimată prin numărul de turnover ,ce reprezintă
numărul de moli de substrat transformat într-un minut de un mol de enzimă.Variază de la 100
până la 3 milioane.
 IUBMB:o unitate enzimatică (U) catalizează transformarea unui micromol de substrat în
decurs de un minut în condiţii standard recomandate.
 exprimarea se face sub formă de mU/mL sau U/L.
 Katal=activitatea enzimatică capabilă să transforme un mol de substrat în decurs de o
secundă(kat= moli/sec.).
2. Nomenclatura şi clasificarea enzimelor

CLASA NUME ABREVIERE ABREVIERE CODUL NUMERIC NUME SISTEMATIC

RECOMANDAT COMUNĂ STANDARD

OXIDOREDUC- LACTATDEHIDRO- LDH LD 1.1.1.2.7 L-lactat:NAD

TAZE GENAZA oxidoreductaza

GLUCOZO-6-FOSFAT G-6-PDH G-6-PD 1.1.1.3.0 D-glucozo-6-fosfat NAPD oxodoreductaza

DEHIDROGENAZA

TRANSFERAZE ASPARTAT GOT AST 2.6.1.1 L-aspartat:2-oxoglutarat transaminaza

TRANSAMINAZA

ALANIN TRANSAMINAZA GPT ALT 2.6.1.2 L-alanin:2-oxoglutarat

aminotransferaza

CREATINKINAZA CPK CK 2.7.3.2 ATP:creatin N-

fosfotransferaza

-GLUTAMIL GGPT GGT 2.3.22 ( 5-glutamil)peptido

TRANSFERAZA aminoacid-5-glutamil transferaza

HIDROLAZE ALCALIN FOSFATAZA ALP ALP 3.1.3.1 fosfohidrolaza monoesterului ortofosforic

ACIDFOSFATAZA ACP ACP 3.1.3.2 fosfohidrolaza monoesterului ortofosforic

5’-NUCLEOTIDAZA NPT 5’-NT 3.1.3.5 5’-ribonucleotid

fosfohidrolaza

AMINOPEPTIDAZA LAP LAP 3.4.11.1 Amonoacilpeptid hidrolaza(citosolică)

(citosolică)

-AMILAZA AMS AMS 3.2.1.1 1,4-D-glucan

Glucon hidrolaza

COLINESTERAZA CHS CHS 3.1.1.8 Acetilcolin acil hidrolaza

LIAZE FRUCTOZO BIFOSFAT ALS ALS 4.1.2.13 D-fructozo-1,6-bifosfat-D-gliceraldehid-3-fosfat

ALDOLAZA liaza
 3.CINETICA ENZIMATICĂ
3.1.MECANISMUL CATALITIC AL ENZIMELOR

k1 k2
E+S ES E+P Km = [E] [S] = k- 1 + k2 (1)
k-1 [ES] k1

În general: [Et]=[E]+[ES]
[E]=[Et]-[ES]
Km[ES]=]Et][S]-[ES][S] ( Km+[S]) [ES]=[Et][S] [ES] = [Et][S] (2)
Km[S]

unde: [Et]=concentraţia totală a enzimei

[E]= [Et] – [ES] =concentraţia enzimei libere
[S] =concentraţia substratului
Km =constanta Michaelis

V=K[ES] ; Vmax=K[Et]; v =[ES] = [Et][S] 1

Vmax [Et] Km+[S] [Et]

V = [S] (3) V= V max [S] (4)

Vmax [S]+Km K m + [S]
3.2. FACTORI CE INFLUENŢEAZĂ REACŢIILE ENZIMATICE

INFLUENŢA CONCENTRAŢIEI SUNSTRATULUI ŞI A CONCENTRAŢIEI ENZIMEI

Fig.1. Variaţia vitezei reacţiei în funcţie de Fig.2.Variaţia vitezei unei reacţii enzimatice în
concentraţia substratului. funcţie de concentraţia enzimei.

Matematic ( fig.2 ) această linearitate se exprimă prin relaţia:

Vo=k [ E] (5)
unde:
k este o constantă caracteristică pentru fiecare sistem [ ES ]
INFLUENŢA pH-ULUI ŞI TEMPERATURII ASUPRA ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

Fig.3.Variaţia activităţii enzimelor Fig.4. Variaţia activităţii unor enzime

în funcţie de temperatură în funcţie de pH
3.6. METODE DE DETERMINARE A ACTIVITĂŢII ENZIMATICE

 METODE SPECTROFOTOMETRICE
-sunt caracterizate de proporţionalitatea care există între absorbanţa A(densitate optică,extincţie) şi concentraţia substanţei de interes:
A=cd ,
unde: coeficient molar de absorbţie
c=concentraţia produsului respectiv
d=grosimea substratului
-calculul rezultatelor se face prin utilizarea unei soluţii etalon sau prin trasarea unei curbe de etalonare

 METODE FLUORIMETRICE
-extrem de sensibile (până la 10-2 ppm)
-intensitatea radiaţiei fluorimetrice(F):
F=Kabc =Bc

 METODE POLARIMETRICE
- se determină unghiul de rotaţie,  :
[] t0= 
ld

 METODE TITRIMETRICE
-în reacţiile enzimatice S sau P prezintă caracter acid sau bazic, putând fi dozaţi titrimetric.

 METODE CALORIMETRICE
-se bazează pe măsurarea căldurii de reacţie ca o măsură a vitezei cu care substratul este modificat enzimatic, atunci când reacţia este exotermă.

 METODE RADIOMETRICE
- se bazează pe măsurarea intensităţii radioactivităţii naturale a fenomenelor ce au loc la interacţiunea radiaţiilor nucleare cu materia
- exactitatea de +/- 10%
4. ENZIME CU IMPORTANŢĂ CLINICĂ

 2000 de enzime cercetate până în prezent

 aproximativ 100 au fost studiate in scop diagnostic
 sunt clasificate în 2 categorii:
-enzime plasmatice:enzimele coagulării, lecitin-colesterol-aciltransferaza(LCHT)
-enzime neplasmatice:
-enzime de secreţie:amilaza,tripsina,lipaza, pepsinogen
-enzime celulare:AST,ALP,CK,LD,AMS,etc.
 2 factori sunt direct responsabili de procesul de denaturare:
-hemoliza.
-temperatura de conservare de la recoltare până la efectuarea determinărilor
clinice:unele enzime ca AMS,LPS,GGT,sunt stabile la temperatura camerei;altele sunt
stabile la 40C:CK, GOT,GPT,ALP, ETC..
4.4. PRINCIPALELE ENZIME CU VALOARE DE DIAGNOSTIC

CREATINKINAZA (CK) E.C. 2.7.3.2.

-specifică ţesuturilor cu activitate intensă:muşchi scheletici, muşchiul inimii, creier;
-prin electroforeză s-a realizat separarea CK în mai multe fracţii izoenzimatice:

IZOENZIMELE CREATINKINAZEI .LOCALIZARE TISULARĂ ŞI SURSE DE CREŞTERE

IZOENZIMA ŢESUT AFECŢIUNI
CK-MM INIMĂ Infarct miocardic,distrofie musculară,
MUSCULATURA hipotiroidism,hipertermie malignă
SCHELETICĂ

CK-MB INIMĂ Angina, intervenţii chirurgicale,distrofia

MUSCULATURA SCHELETICĂ musculară Duchenne,sindromul
Reye,intoxicaţii cu CO,etc

CK-BB CREIER,PLĂMÂN,PROSTATĂ, Encefalopatie anoxică,accident

STOMAC,COLON,UTER, cerebrovascular,traume uterine sau
TIROIDĂ placentare,cancer,sindromul Reye,etc.

-valori normale(370C):- femei:27-170 U/L

- bărbaţi:27-195 U/L
Cea mai uzuală metoda de determinare a activităţii CK, folosită în laboratorul clinic, are la bază
următoarele reacţii:

CK
creatinfosfat + ADP creatina + ATP

HK
ATP + glucoza ADP + glucozo-6-fosfat

G-6-PD
Glucozo-6-fosfat + NADP 6-fosfogluconat + NADPH

Reacţia are loc la un pH optim de 6,8 în timp ce pentru reacţia declanşatoare pH-ul este de 9,0.

Calculul rezultatelor:334 nm: UI/I =DA/min 8252

340 nm: UI/I = DA/min 8199
305 nm: UI// = DA/min 14571
5.VALOAREA DIAGNOSTICĂ A DETERMINĂRILOR DE ENZIME

Enzima Provenienţa Modificări patologice Observaţii

ficat,miocard,muschi Creşteri marcante:infarct miocardic, În ficat:60% în citosol şi 40% în

mici cantităţi în pancreas, Hepatită acută,leziuni toxice acute ale ficatului. mitocondrii.
rinichi,eritrocite; Creşteri moderate:hepatite cronice, mononucleoză
Aspartatamino- infecţioasă,afecţiuni musculare
transferaza(AST,
GOT)

Alaninaminotrans- citosolul hepatocitelor;cantită- Creşteri marcante:hepatită acută şi leziuni toxice ale ficatului. Exclusiv în citosolul hepatocitelor şi mai
feraza (ALT , GPT) ţi reduse în miocard Creşteri moderate:hepatite cronice, ales în celulele de la periferia
muşchi, rinichi,pancreas mononucleoză,colici biliare. lobulilor hepatici.

Lactatdehidroge- musculatură, ficat, Creşteri marcante:infarct miocardic, Izoenzimele LDH1

naza(LDH) miocard,rinichi;cantităţi reduse în anemie megaloblastică , leziuni toxice acute ale ficatului. Şi LDH2 în boli miocardice şi anemia
pancreas, eritrocite, Creşteri moderate:hepatita acută, hemoliza acută, boli Biermer , LDH4 şi LDH5 în leziuni
plămâni. musculare,limfoame maligne,infarct pulmonar. acute ale ficatului şi musculaturii.

Creatinkinaza musculatură, miocard, creier Creşteri importante:infarct miocardic, S-au evidenţiat 3 izoenzime
(CK) dermatomiozite,distrofie musculară dimerice:CK/MM de origine
progresivă,rabdomioliza şi mioglobinurie. musculară şi
Creşteri moderate:după injecţii intramus- miocardică,CK/BB din creier, CK/MB
culare cu exclusiv miocardică.
diazepam,tetraciclină,pentazocină şi în hipotiroidism.

-Amilaza glande salivare, pancreas Creşteri importante:pancreatită acută Există izoamilaze pancreatice şi
Creşteri moderate:parotidite,obstrucţii salivare.Creşterea în ser e de scurtă
ale căilor excretorii, ale glandelor salivare sau pancreatice;ulcer durată, -amilaza apărând apoi în
perforat, insuficienţa renală, sarcină extrauterină. urină.

Fosfataza alcalină ficat, oase , duoden ,rinichi Creşteri importante:în colestaza intra- şi extrahepatică,în boli La copii valori normale aproximativ
(ALP) osoase asociate cu reacţie osteoblastică (rahitism , duble faţă de adulţi.
osteomalacie ,boala Paget) Enzimă inductibilă.
Scăderi:în hipofosfatazie genetică,acondroplazie,mixedem.

Fosfataza acidă prostată , mici cantităţi în eritrocite, Creşteri moderate:carcinom prostatic cu depaşirea Enzimă foarte labilă.Izoenzima prostatică
(ACP) plăcuţe rinichi, ficat capsulei;uneori în carcinoame mamare cu metastaze este tratrat inhibabilă.
osoase.

Colinesteraza secretată activ de către hepatocite Scăderi importante:insuficienţa hepatică (mai ales ciroze), S-au descris variante genetice cu modificări
(CHE) intoxicaţie cu organofosforice. ale activităţii şi mai ales cu deficit
Scăderi moderate:denutriţie, reacţie de fază acută (postoperator), de hidroliză a succinilcolinei.
anemii severe, hipotiroidism.
Creşteri moderate:sindrom nefrotic , diabet cu obezitate ,
hiperlipemii,hipertiroidism (fără caşexie)
INFARCTUL MIOCARDIC

-cauze ce declanşează infarctul miocardic:-efortul fizic excesiv

-traumatisme ale musculaturii
-hipotiroidism sever
-interpretarea datelor se face în strânsă legătură cu rezultatele obţinute la ECG.Explorarea
-
enzimelor serice are valoare diagnostică deosebită în special atunci când ECG este
necaracteristică pentru infarct şi în special în microinfarcte.

Modificarea enzimelor plasmatice după infarctul de miocard:

Enzima Debutul Concentraţia maximă după Durata menţinerii concentraţiei

creşterii(ore) Producerea infarctului(ore) crescute (zile)

AST 6-8 24-48 4-6

CK(total) 4-6 24-48 3-5
LD 12-24 48-72 7-12
6. METODE AUTOMATIZATE DE ANALIZĂ A ENZIMELOR

Fig.5.Graficul conţinutului unui ser aparţinând unui pacient cu probleme de diabet.Se constată
valori anormale ridicate pentru GOT, fosfatza alcalină dar şi pentru glucoză şi bilirubină.
Linia neagră indică nivele fiecărei substanţe determinate, şi formele haşurate reprezintă nivele
normale.