ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE

5. DESCRIERE PROCEDURA – ELECTROFOREZA PROTEINELOR

SERICE

5.1 Principiul metodei

Metoda fotometrica:

Electroforeza este o metodă de analiză şi separare bazată, în principal pe

criterii de sarcină electrică şi masă moleculară. Migrarea diferenţială a
particulelor încărcate electric se face sub acţiunea unui câmp electric continuu.
Electroforeza proteinelor pe gel de agaroză este tehnica cea mai uşoară şi mai
puţin costisitoare, implicând o cantitate limitată de materiale, un timp de lucru
scurt şi o reproductibilitate foarte bună. Separarea electroforetică a proteinelor
serice prezintă un interes major în testele clinice, datorită importantelor
informaţii pe care le oferă acestea în diverse afecţiuni, precum şi asupra
modalităţilor de tratare a acestora.
Metoda curentă pentru separarea proteinelor serice utilizată în
laboratoarele de biochimie medicală este electroforeza. Se utilizează suporturi
solide şi pH alcalin, la care toate componentele proteice sunt încărcate negativ
şi migrează spre polul pozitiv. Pe electroforegramă, după colorare, proteinele
apar sub formă de benzi cărora li se măsoară densitatea optică, fiecare bandă
având un maxim de absorbţie. Prin electroforeză, în condiţiile amintite mai sus,
se obţin cinci fracţiuni: albumina serică, a1, a2, b, g - globuline.

Electroforeza reprezinta miscarea unei particule incarcate electric aflate sub

imfluenta unui camp electric.Aceasta miscare este data de forta Lorentz,care
poate fi descrisa ,ca proprietate electrica fundamentala a unui corp studiat si a
conditiilor electrice ambientale,de catre ecuatia:
unde F este forta Lorentz,q este sarcina electrica cu care este incarcat corpul , E
este campul electric.
Miscarea electroforezica rezultata este contracarata de fortele de frecare,prin
urmare rata miscarilor este constanta intr-un camp electric omogen constant:
unde v este velocitatea si f este coeficientul de frecare:
Mobilitatea electroforetica este definita ca fiind:
Mobilitatea depinde atat de proprietatile particulei ,cat si de proprietatile
solutiei.Pentru concentratii ridicate de ioni,o expresie aproximativa pentru
mobilitatea electroforetica este data de ecuatia lui Smoluchowski:
unde ε este constanat dielectica a lichidului, ε0 este permitivitatea spatiului liber,
η este vascozitatea lichidului si ζ este potentialui zeta al particulei.
5.2 Reactivi: solutii gata preparate:

1 . Placuta cu gel agaroza in tampon Tris-Barbital cu conservant si stabilizator

Placutele sunt gata pentru utilizare.
Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

2 . Bureti imbibati cu tampon; contin bureti imbibati in Tris-Barbital cu

conservant si stabilizator.

Buretii sunt gata pentru utilizare.

Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

3 . Colorant Acid Blue,concentrat; contine Acid Blue in solutie de acid acetic.

Pentru utilizare se dilueaza 1 mL concentrat la 1L apa distilata. Se agita 10
min. Pana se dizolva complet. Solutia este pentru 10 placute. Se pastreaza la
temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

4 . Solutie spalare pentru aplicator; surfactant,solutie apoasa cu conservant.

Solutia este gata de utilizare.
Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

5 . Placa probe de unica folosinta; este din plastic;prezinta alveole pentru

pipetatrea produsului de analizat.
Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

6 . Hirtie de filtru pentru absorbtia exesului de tampon de pe placute.

Se pastreaza la temperatura camerei (15 – 30oC) pana la data expirarii.

Kitul se pastreaza la 2 -8 0C pana la data expirarii

Cei doi rectivi se sunt integrati intr-o caseta care este stabila la bordul
aparatului la o temperatura de 10 – 15 0C timp de 8 saptamani.

Manipularea reactivilor se face cu atentie si numai de catre responsabilii de

analiza.
Containerele goale se vor arunca in recipiente speciale.

5.3 Analiza

Pentru determinarea factorului reumatoid se utilizeaza analizorul automat

Cobas Integra 400 Plus furnizat de Roche Systems corespunzator ILA-02
Produsul biologic de analizat: ser
Serul de analizat se obtine in urma centrifugarii eprubetei cu produsul biologic
conform PO –01
Se face selectare de teste si programe conform ILA - 02
Se pipeteaza,aproximativ 500 µ L ser , cu o pipeta automata,in cupele (micro
sau standard) situate pe discul de probe, sau se pune vacutainerul centrifugat.
Se actioneaza butonul START din ecranul Start pentru a incepe analiza.
Dupa terminarea analizei rezultatele sunt afisate si tiparite.

5.4 Calcule si interpretarea rezultatelor

IFA, IFB = constante ale instrumentului ;

Valorile normale : 0 – 5 mg/L

5.5 Echipamente

Analizor automat de biochimie HITACHI 912 ,cu numar de inventar

2251063/157616, aflat in dotarea laboratorului din 2005 si care este descris in
ILA 01
Sau Cobas Integra 400 Plus,cu numar de inventar TR2478,aflat in dotarea
laboratorului din 2007 si descris in ILA-02.

5.6 Esantionare

Probele biologice sunt recoltate de catre asistentii din clinici,la patul bolnavului
sau de catre asistentii din ambulatoarele de specialitate sau triaj. Recoltarea se
face in monovette,sistem inchis cu vacuum .
In cadrul laboratorului exista o camera pentru primirea probelor unde acestea
sunt receptionate.
Probele necorespunzatoare se ignora.
Dupa receptionare ,identificare unica si centrifugare probele sunt transportate
in laborator pentru inregistrarea electronica si prelucrare.
Laboratorul de biochimie nu pastreaza contraprobe.

5.7 Raportarea rezultatelor

Raportarea rezultatelor se face pe buletinul de analiza intocmit de executant

conform PG – 18, validat de responsabilul de analiza si aprobat de seful de
laborator.
 5.8 Controlul calitatii

In Laboratorul de Biochimie se foloseste un control de calitate

interlaboratoare si un control extern prin care rezultatele obtinute in laboratorul
nostru sunt comparate cu rezultatele altor laboratoare,inscrise in acest
program, care folosesc aceleasi aparate si aceleasi metode de lucru.
In zilele in care se lucreaza electroforeze se executa controlul de calitate
apoi se pun in lucru probele.

5.9 Estimarea incertitudinii de masurare

Raportarea incertitudinii de masurare a fost realizata dupa urmatorul model

de calcul:

Rezultatele au fost prelucrate astfel:

reproductibilitatea - au fost prelucrate rezultatele obtinute in luna mai 2008 pe
urmatoarele seruri de control
PRECINORM U LOT 178985 EXP 02.2010
PRECIPATH U LOT177995 EXP 08.2009
PRECINORM L LOT 178148 EXP 06.2010
PRECIPATH HDL/LDH LOT 178149 EXP 06.2009
PRECINORM CK-MB LOT 177901 EXP 12.2008
PRECIPATH CK-MB LOT 179735 EXP 05.2009
PRECINORM PROTEINE LOT 179631 EXP 08.2009
PRECIPATH PROTEINE LOT 179632 EXP 08.2009
RF CONTROL SET LOT 600321 EXP 03.2009
m=media aritmetica = ∑ xi/n ;unde xi =valoarea ptr nivel normal sau patologic a
controlului obtinut;
n= numarul total de valori luat in calcul

CV(%)=coeficientul de variatie=(SD/m) x100 ;unde SD=abaterea standard=s(x)

m=media aritmetica

s(x)= √∑(xi-m)2/n-1; s(x) = up unde up= incertitudine standard

D=deplasarea sau biasul = m- tinta unde: m=media aritmetica; tinta reprezinta

valoarea tinta ptr nivel l normal sau patologic a controlului mai sus mentionat

uD=incertitudine standard=D/√3

urmin =valoarea min a intervalului ptr nivel normal- SD( mentionat de producator in
prospectul insotitor
control nivel normal)
urmax= valoarea max a intervalului ptr nivel normal- SD( mentionat de producator in
prospectul insotitor
control nivel patologic)
 ur= incertitudinea standard datorata materialului de referinta=(urmax-urmin)/ √12

Uf = incertitudinea extinsa datorata calibratorului folosit ptr calibrarea parametrilor pe

cele doua
analizoare(COBAS INTEGRA PLUS; HITACHI 912);valorile au fost puse la
dispozitia
laboratorului da catre firma ROCHE DIAGNOSTICS GmbH
uf=incertitudine standard =Uf/2 unde (2 reprezinta constanta k)

Uet= incertitudinea de etalonare de pe certificatul obtinut de la INM in urma etalonarii

celor doua analizoare
ptr 3 parametrii respectiv- UREE;CREATININA;GLUCOZA
uet= incertitudine standard de etalonare= Uet/2 unde (2 reprezinta constanta k)

uc=incertitudinea compusa=√up2+uD2+ur2+uf2+uet2

U=incertitudinea extinsa =ucx2 unde (2 reprezinta constanta k)

Raportarea incertitudinei extinse s-a realizat in doua variante:in valoare absoluta si in

valoare relativa de tipul R=x±U(k=2)unde :x=m( media aritmetica) ; U=incertitudinea
extinsa