Electroforeza

Introducere

Electroforeza este o metodă larg folosită pentru

separarea diverselor molecule precum proteine,
polipepdide și acizi nucleici din amestecuri biologice
complexe.
Acestă metodă folosește ca și principiu fenomenul
fizico-chimic de migrare a moleculelor încărcate într-un
câmp electric la unul din electrozi fără ca între aceștia și
moleculele separate să aibă loc reacții.
 Moleculele (acizi nucleici, peptide, proteine), se
deplasează dea lungul gelului într-un câmp electric
asemanator trecerii printr-o sită moleculară, astfel gelul
permite moleculelor mici să se deplaseze mai repede iar
celor cu masa moleculară mai mare să se deplaseze mai
greu.

Structura secundară a unui fragment dintr-o proteină

 Pentru separarea probelor în gel există două
metode electroforetice care sunt folosite cel mai des:
-metoda unidimensionala(1D-gel)
-metoda bidimensionala (2D-gel)
Ambele folosesc ca agent de solubilizare și
încarcare negativă a probelor sodiumdodecil sulfat
(SDS) și un gel de poliacrilamidă, SDS-PAGE (din
eng. Sodium dodecil sulphate–polyacrilamid gel
electrophoresis)

Aceste metode electroforetice sunt utilizate pentru:

-monitoriza purificarea
-verifica puritatea probelor
-estima greutățile moleculare pentru proteinele
necunoscute.
Electroforeza în gel-protocol experimental
 Reprezentarea schematică a unui sistem vertical de gel-electroforeză (SDS-
PAGE)

Separarea proteinelor se realizează în geluri acrilamidice unde gelurile sunt

polimerizate între plăci de sticlă şi rămân acolo pe durata întregii proceduri de separare.
Probele sunt introduse în gelul de așezare cu ajutorul unei seringi Hamilton în
eșantioanele cu formă de pieptene.
 Schema reprezentată mai sus folosește un sistem
electroforetic care este cu succes folosit în cazul amestecurilor
complexe în combinație cu o separare prealabilă în funcţie de
punctul izoelectric al proteinelor. Această separare se bazează pe
punctele izoelectrice (pI) ce reprezintă valoarea pH-ului lor unde
sarcina netă a proteinelor este zero. Metoda prezentată mai sus se
numeste bidimensională (2D-gel) deoarece separarea proteinelor
se face în prima etapă în funcție de punctul izoelectric iar în cea
de-a doua în funcţie de masa lor moleculară.Gelurile SDS-PAGE
oferă doar o estimare calitativă a maselor moleculare a
proteinelor separate; masa lor moleculară putând fi determinată
cu ajutorul unei probe standard ce conţine un amestec proteine
standard cu mase moleculare cunoscute.
 După ce probele sunt separate este necesară vizualizarea lor iar pentru
acesta este necesară folosirea diferitelor tehnici de colorare precum
colorarea cu Coomasie Brilliant Blue (R-250 sau G-250), colorarea cu
azotat de argint sau colorarea cu Sypro ruby.

Structura Coomasie Brilliant Blue

Benzi a unor probe analizate
Electroforeza cu SDS-PAGE prezintă câteva avantaje
-SDS solubilizează aproape toate proteinele, chiar şi proteinele
hidrofobe şi denaturate
-toate proteinele migrează într-o singură direcţie către anod;
-împreuna cu reducerea şi alchilarea se obţine o completă
denaturare a proteinelor.
-permite determinarea greutăţii moleculare;
-este mai rapidă decât separările native;
-benzile sunt uşor de fixat, nu sunt necesari acizi tari;
-sensibilitate ridicată.
 Bibliografie

1. O'Brien, R.W.; L.R. White , Electrophoretic mobility of a spherical

colloidal particle". 1978J. Chem. Soc. Faraday Trans. 2 (74): 1607
2. Bambeck SG , Electrophoresis separation gel and method for preparing an
electrophoresis separation gel. 1996, USA patent number. 5,589,104
3. Milan Bier. Electrophoresis. Theory, Methods and Applications (3rd
printing ed.). 1959, Academic Press. p. 225
4. Gordon, A.H , Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch
gels. 1975.New York: American Elsevier Publishing Company, Inc.
5. Gel Electrophoresis. Avaible from:
http://www.molecularstation.com/molecular-biology-techniques/gel-
electrophoresis
6. Robyt, John F.; White, Bernard JBiochemical Techniques Theory and
Practice. Waveland Press. 1990.
7. Kastenholz B , Preparative native continuous polyacrylamide gel
electrophoresis (PNC‐PAGE): an efficient method for isolating cadmium
cofactors in biological systems, 2004.Analytical Letters 37 (4): 657–665.
Vă mulțumesc pentru atenție!