CAPITOLUL 12 Alte procese de separare

12.1. Cromatografia n fluide supercritice Pn spre anii 1980 cromatografia n fluide supercritice (SFC) s-a dezvoltat ca o tehnic similar cromatografiei de lichide, prin utilizarea coloanelor umplute, singura deosebire fa de LC fiind natura fazei mobile, dat de un fluid supercritic. Prin introducerea coloanelor capilare SFC a cunoscut o nou dezvoltare, ca tehnic de separare similar cromatografiei de gaze. Intr-adevr, n prezent tehnica SFC prezint asemnri ambelor tehnici cromatografice, att din punct de vedere al separrii, ct i al deteciei. Mecanismul de separare SFC se bazeaz pe diferena dintre constantele de repartiie faz mobil/faz staionar ale analiilor din prob, care la rndul lor depind de raportul dintre solubilitatea analiilor n fluidul supercritic i afinitatea acestora fa de faza staionar. Elementele componente ale unui cromatograf n care faza mobil este un fluid supercritic sunt redate n figura de mai jos.
Coloana Restrictor

Mixer Pomp

Proba

Detector Valva de injecie Pomp Sistem de termostatare Achiziie/ prelucrare date

CO2 lichid

Modificator

Fig. 12.1. Configuraia unui sistem cromatografic cu fluide supercritice.

CO2 este stocat ntr-un cilindru, iar nainte de a intra n pomp acesta trebuie rcit pentru creterea densitii sale. Dei sunt utilizate i pompe de nalt presiune, sunt preferate pompele tip sering, pentru eliminarea pulsurilor i a controlului presiunii fluidului. Modificatorul polar (cum ar fi metanolul) este adus n sistem cu ajutorul altei pompe, similar procesului SFE (cap. 7.4). Aceste dou componente ale fazei mobile sunt apoi amestecate in-line cu ajutorul unui mixer. Introducerea probei se face cu ajutorul unui valve de injecie folosit n HPLC. Dac proba este rezultatul unei prelucrri bazat pe extracie n fluide supercritice (SFE), atunci se asigur compatibilitatea dintre compoziia solventului probei (CO2 cu sau fr modificator polar) i cea a fazei mobile.
218

Pentru a controla i menine temperatura fazei mobile (CO2), coloana cromatografic (umplut sau capilar) se plaseaz ntr-o incint de termostatare (similar celei din HPLC sau GC), depinznd de tipul acesteia. Datorit viscozitii mici ale fluidelor supercritice utilizate ca faze mobile n SFC, lungimile coloanelor umplute pot fi mai mari dect n HPLC, permind obinerea unor rezoluii mai bune prin aceast tehnic cromatografic. La ieirea din coloan i naintea intrrii n detector se gsete un restrictor, care are rolul de a menine parametrii fizici ai fazei mobile constante. Acesta const dintr-un tub foarte subire, metalic sau din silice topit, cu lungimea de aproape 10 cm i diametrul mai mic de 50 m. Fazele staionare cele mai importante pentru separrile SFC pe coloane umplute sunt urmtoarele: - polimeri polistiren-divinilbenzen sub form de bile poroase care ridic unele probleme legate, pe o parte, de unele efecte de contractare sau umflare, care conduc la lipsa de reproductibilitate a separrilor, i pe de alt parte de utilizarea lor la separarea de compui cu caracter hidrofob; - silicagel modificat chimic cu grupri cian, fenil, alchil, acoperit cu un polimer pentru a masca gruprile silanol reziduale ce interacioneaz puternic cu gruprile polare din moleculele de analit i conduc la forme asimetrice ale picurilor cromatografice; - faze staionare de tip chiral (menionate n 11.11). Fazele staionare menionate la separarea prin cromatografie de gaze pe coloan capilar pot fi utilizate i n cazul SFC pe acelai tip de coloan. Detectorii specifici ambelor tehnici cromatografice pot fi folosii, dar alegerea acestora depinde de natura analiilor din probe (vezi cap. 10.10 i 11.13). O dezvoltare a tehnicii tandem SFC-MS utiliznd surse de ionizare la presiune atmosferic s-a nregistrat n ultimii ani, datorit avantajului dat de CO2 supercritic de a se auto-volatiliza prin destinderea sa n compartimentul de nebulizare al sistemului MS. Aplicaii Practic prin aceast tehnic cromatografic se pot separa compui organici volatili i nevolatili, nepolari sau slab polari. Astfel, SFE este aplicat cu succes la analiza probelor de mediu, controlul alimentelor sau al produselor farmaceutice, precum i n analiza oligomerilor din matrici polimerice. In schimb, cromatografia n fluide supercritice poate fi cu greu substituit n separarea i determinarea compuilor labili termic sau compuilor cu caracter exploziv din diverse probe multi-component. De exemplu, determinarea trinitrotoluenului i a compuilor nrudii poate fi realizat prin SFC-MS, utiliznd coloane capilare cu fenilmetilpolisiloxan. Analiza carburanilor pentru motoare cu reacie este un alt exemplu de aplicaie important a tehnicii SFC. De obicei, n aceste amestecuri se adaug difenilamina ca stabilizator, cu scopul combinrii acesteia cu oxizii de azot formai n procesul de descompunere a carburantului, cnd se formeaz derivai nitrozo- i nitro-. Aceti derivai nu pot fi determinai prin analiza GC, deoarece se descompun la rndul lor n difenilamina, dar pot fi determinai prin SFC cu detecie NPD. Un alt exemplu, este determinarea nitroglicerinei din amestecuri carburante, care poate fi mai greu realizat prin GC, datorit degradrii sale cu temperatura, sau prin HPLC cu detecie spectrometric UV, deoarece acest compus nu absoarbe n ultraviolet. Ori utilizarea SFC pe coloana capilar i detecie FID poate fi utilizat la determinarea acestor compui cu caracter exploziv. Cuplajul acestei tehnici analitice de separare i determinare cu SPE, dar mai ales
219

cu SFE, a condus la realizarea i comercializarea unor sisteme total automatizate, capabile s analizeze un numr mare de probe. 12.2. Electroforeza Electroforeza este un proces de separare bazat pe viteza diferit a speciilor ncrcate electric (ioni, macromolecule cu sarcin electric, coloizi, unele celule, precum bacterii sau eritrocite) plasate ntr-un cmp electric. Acest principiu a fost utilizat pentru prima dat de Tiselius la separarea a patru componente majore din serului proteic.[62] Dup mediul n care se deplaseaz speciile ncrcate electric, metodele electroforetice se pot mpri n dou mari clase: 1) electroforeza ntr-un mediu liber nelegat (pe o coloan de lichid); 2) electroforeza ntr-un mediu fixat (pe suport poros). O specie ionic cu sarcina q, aflat ntr-un cmp electric de intensitate E (msurat n voli/cm) va interaciona cu acesta prin fora electric FE, dat de relaia simpl:

FE = q E

(12.1)

Deplasarea speciei ionice sub aciunea cmpului electric E are loc ntr-un mediu lichid. Acestei deplasri i se opune fora de frecare Stokes dintre ion i mediul lichid (Ff):
Ff = 6 r v e

(12.2)

, n care este vscozitatea mediului lichid n care sarcina se deplaseaz, r este raza speciei ionice (considerat sferic), iar ve este viteza de deplasare. Conform acestei relaii fora de frecare crete proporional cu creterea razei speciei ionice, viscozitii mediului n care se deplaseaz i viteza de deplasare. La o deplasare cu o vitez constant, cele dou fore sunt egale (FE = -Ff). Viteza de deplasare va depinde astfel de parametrii menionai anterior, conform relaiei:
ve = q E 6 r

(12.3)

Primul termen din relaia de mai sus este definit ca mobilitate electroforetic (e):

e =

q 6r

(12.4)

Aadar, relaia care st la baza separrilor electroforetice este urmtoarea:

ve = e E

(12.5)

Pe baza acestor relaii se poate deduce c viteza de deplasare ntr-un cmp electric este direct proporional cu sarcina electric a speciei ncrcate i invers proporional cu raza sa. Mediul n care are loc deplasarea influeneaz viteza de deplasare prin viscozitatea sa, viteza crescnd cu scderea viscozitii acestuia. Un parametru care influeneaz procesul electroforetic este i pH-ul mediului n care are loc deplasarea componenilor probei: la pH acid speciile bazice neutre se ncarc cu sarcin
220

pozitiv, iar la un pH bazic speciile cu caracter acid se ncarc cu sarcin negativ. Modalitatea cea mai cunoscut de efectuare a separrilor electroforetice este pe coloan umplut cu soluie tampon (aa-numita celul de electroforez de tip Tiselius). La cele dou capete se monteaz cei doi electrozi pentru a realiza cmpul electric necesar deplasrii electroforetice, iar n dreptul unuia dintre capete se plaseaz detectorul sistemului. Sistemele moderne utilizeaz o capilar pentru separarea electroforetica, aa dup cum se sunt prezentate n continuare. 12.3. Electroforeza capilar Electroforeza capilar, numit datorit performanelor sale i electroforez capilar de mare performan (HPCE high performance capillary electrophoresis), realizeaz separarea electroforetic pe o capilar foarte ngust (din silice sau teflon, cu diametrul ntre 25 i 75 m, iar lungimea cuprins ntre 10 i 80 cm), n care se gsete o soluie tampon. Utilizarea capilarei are multe avantaje, dar primul i cel mai important este nlturarea efectului Joule de nclzire. Rezistena electric mare a capilarei permite aplicarea unui potenial electric foarte mare (ntre 100 i 500 V/cm), cu generarea unei cantiti minime de cldur. In plus, datorit raportului mare suprafa/volum n cazul capilarei, are loc o disipare eficient a cldurii care este generat la transportul speciilor ncrcate prin mediul lichid. Este cunoscut faptul c, la nivel periferic, cuarul prezint din loc n loc grupri hidroxilice reziduale (grupri silanol, cu caracter acid). Dac electrolitul suport introdus n capilare de cuar se gsete la un pH suficient de mare ( 4), gruprile hidroxilice reziduale vor disocia, genernd sarcini negative distribuite la nivelul peretelui intern. In acest mod se va forma la nivelul peretelui un strat dublu electric (vezi Fig. 12.2). Contraionii, dispui n straturi lng suprafaa intern a capilarei de cuar, pentru a egaliza sarcina suprafeei, vor genera un potenial, denumit potenial zeta . Contraionii din stratul rigid (Stern), la aplicarea potenialului E, se vor deplasa ctre catod. Aceast migrare n cmp electric va atrage dup sine deplasarea ionilor electrolitului, din straturile difuze, dar i a moleculelor de ap care hidrateaz ionii. In consecin, va aprea n interiorul coloanei o deplasare de la anod ctre catod, cunoscut sub numele de migrare electroosmotic, sau electroendosmotic. Viteza de deplasare electroosmotic vEOF este dependent de mobilitatea electroosmotic a ionilor din electrolitul suport, potenialul zeta generat la interfaa capilar/electrolit suport, constanta dielectric , vscozitatea electrolitului suport i cmpul aplicat:
v EOF = E

(12.6)

Conform acestei relaii, mobilitatea electroosmotic este:

EOF =

(12.7)

De remarcat, ns, c aceast mobilitate este independent de cmpul aplicat. Sensul componentei de deplasare electroosmotic depinde de modul n care se ionizeaz suprafaa intern a capilarei.
221

Chiar n cazul n care materialul din care este confecionat capilara nu prezint tendin de ionizare la interfaa cu electrolitul suport, componenta electroosmotic apare datorit adsorbiei ionice, specifice la nivelul acestei suprafee. pH-ul electrolitului suport influeneaz n cea mai mare msur mobilitatea electroosmotic. Fig. 12.3 prezint o astfel de dependen n raport cu materialul din care este confecionat capilara i cu pHul electrolitului suport.
+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + -

Peretele capilarei

Strat rigid

Strat difuz

Fig 12.2. Reprezentarea dublului strat format la nivelul peretelui interior al capilarei.

EOFx10 (cm /V.s) 5

-4

Pyrex
4

Cuart
3

Teflon

0 3 4 5 6 7 8

pH

Fig. 12.3. Dependena mobilitii electroosmotice (EOF) n raport cu pH-ul electrolitului suport, pentru trei materiale din care sunt des confecionate capilarele in HPCE. 222

Modalitile de influenare a cmpului electroosmotic prin diveri parametri experimentali sunt prezentate schematic n tabelul urmtor.
Tabel 12.1. Modaliti de control a cmpului electroosmotic. Variabila Rezultat Observaii - poate conduce la cretere proporional a cmpului scderea rezoluiei; Cmpul electric aplicat EOF - produce nclzire prin efect Joule. - modul cel mai eficient de EOF scade la pH jos control al EOF; pH-ul electrolitului suport - poate ioniza analiii de EOF crete la pentru pH ridicat interes. - I nalt i nclzire prin efect Joule; Tria ionic (concentraia Potenialul zeta i EOF scad la - procese de adsorbie; electrolitului suport) creterea triei ionice - variaii ale conductibilitii i picuri asimetrice. Temperatura - controlat instrumental. Modificri ale (2-3% /1C) Prezena unui modificator - poate altera selectivitatea. , = f(cmod.org.) organic n electrolit - cei anionici mresc EOF; - cei cationici scad EOF Agent tensioactiv Poate schimba sensul EOF sau i schimb sensul; (surfactant) - poate influena selectivitatea. -multiple posibiliti Modificarea chimic a Modificarea structurii suprafeei - probleme de stabilitate. suprafeei interne a capilarei

In condiii bine determinate, fluxul electroosmotic poate anula cmpul electroforetic. In cazul n care v EOF > v e , speciile anionice vor migra ctre catod, n cazul operrii cu capilare din cuar. In consecin, mobilitatea analitului (a) se poate calcula dup relaia:
a = e + EOF = lL l = t V lE

(12.8)

unde:

V reprezint voltajul aplicat; l reprezint lungimea efectiv a capilarei (pn n zona de detecie); L reprezint lungimea total a capilarei; t reprezint timpul de migrare; E reprezint cmpul electric. Eficiena global a separrilor HPCE este condiionat de urmtorii factori: difuzie; injecie; temperatur; adsorbie selectiv;
223

 volumul zonei de detecie; electrodispersie. Abaterea standard pentru picul unui analit va fi, n consecin, condiionat de procesele de lrgire a frontului acestuia prin fenomenele amintite anterior:
2 2 2 2 2 T = 2 Dif + inj + T + ads + electrodisp

(12.9)

Instrumentaie Componentele unui sistem electroforez capilar de mare performan sunt redate schematic n figura urmtoare.
Sistem de achiziie date Capilar

Catod

Detector

Anod

Soluii tampon

Sursa de tensiune

Fig. 12.4. Schema-bloc a unui sistem de electroforez capilar.

Conform datelor coninute n Tabelul 12.2 rezult c volumele de injecie trebuie s fie foarte reduse. De aceea, este important ca poriunea din capilar n care proba este introdus n momentul injeciei s fie ct mai redus ca lungime, pentru a nu influena eficiena global a separrii. Cele mai importante modaliti de injecie n HPCE sunt prezentate schematic n Fig. 12.5 i descrise parametric n continuare.[22] Injecia hidrodinamic const fie n aplicarea unui regim de presiune, fie a unui regim de vacuum, n unul dintre rezervoarele n care se gsete prob sau electrolit, fie se apeleaz la sifonare ntre cele dou rezervoare, prin intermediul capilarei. In conformitate cu ecuaia Hagen-Poiseuille, volumul de prob injectat este dat de relaia:
v inj = P d 4 t 128 L

(12.10)

unde:

P reprezint diferena de presiune;

224

d reprezint diametrul intern al capilarei; t reprezint timpul de injecie; reprezint vscozitatea tamponului; L reprezint lungimea total a capilarei. In cazul sifonrii ca modalitate de injecie:
P = g h

(12.11)

unde:

reprezint densitatea tamponului; g reprezint constanta gravitaional; h reprezint diferena de nlime ntre rezervoare. Cantitatea de prob injectat se poate calcula n conformitate cu relaia:
Q inj = l inj C inj d 2 d 2 = Vinj t inj C inj 4 4

(12.12)

Tabelul urmtor coreleaz parametrii de calcul ai volumului de injecie cu caracteristicile coloanei.

Tabelul 12.2. Dependena volumului de injecie de parametrii capilarei i presiunea aplicat.
d = 10m Vinj linj Pt (nL) (mm) (mbars) 25 0,0008 0,01 50 0,0016 0,02 75 0,0024 0,03 100 0,0032 0,04 L = 75 cm; T = 25C; d = 25m Vinj linj (nL) (mm) 0,03 0,06 0,09 0,12 = 1. 0,06 0,12 0,18 0,24 d = 50m Vinj linj (nL) (mm) 0,5 1,0 1,5 2,0 0,25 0,50 0,75 1,00 d = 100m Vinj linj (nL) (mm) 8,2 16,4 24,6 32,8 1,04 2,08 3,13 4,16

S-a putut demonstra c proba poate penetra n coloan n momentul imersiei captului capilarei, fr aplicarea de presiune, vacuum sau sifonare. O lungime a frontului de prob n astfel de condiii a i fost determinat. Efectul este mai nsemnat n cazul capilarelor cu diametru interior mai mare. S-a mai luat n considerare i faptul c imersia captului capilarei n rezervorul de prob poate conduce la adsorbia de analii pe suprafaa exterioar a acesteia, ceea ce poate afecta ulterior, n mod serios, eficiena separrii. S-a demonstrat experimental c splarea suprafeei externe a capilarei are ca efect creterea simetriei picurilor i reducerea efectelor de tren. Totodat, modul de tiere a captului capilarei prezint un rol important. O seciune oblic de tiere poate scdea eficiena global a separrii la jumtate. Injecia electrocinetic se realizeaz prin imersarea captului coloanei capilare n soluia de prob i aplicarea unui cmp electric (n general de 3 - 5 ori mai sczut dect cel folosit pe durata separrii). Pe durata injeciei electrocinetice analitul ptrunde n capilar att prin migrare, ct i prin efectul de pompare al cmpului electroosmotic. In cazul injeciei electrocinetice apare o discriminare generat de mobilitile caracteristice fiecrui analit. Cantitatea de analit injectat este dat de relaia:
225

Q=

( e + EOF ) V r 2 C t L

(12.13)

unde:

e reprezint mobilitatea electroforetic a analitului; EOF reprezint mobilitatea electroosmotic; V reprezint voltajul aplicat; r reprezint raza capilarei; C reprezint concentraia analitului; t reprezint timpul de injecie; L reprezint lungimea total a capilarei.
Hidrodinamic
Presiune

Proba

Hidrodinamic

vacuum

Proba

Hidrodinamic
Sifonare

Proba

Electrocinetic

Proba

Fig. 12.5. Modaliti de injecie a probei n HPCE.

226

Detecia cea mai utilizat n HPCE se bazeaz pe absorbia radiaiei n ultraviolet i vizibil, prezentnd asemnri cu detecia n cromatografia de lichide (vezi tabelul 12.3).[22] Deoarece fereastra optic a detectorului este situat chiar pe peretele capilarei, n acest caz nu exist efecte de lrgire a picului HPCE datorat volumul celulei. Alte metode de detecie spectrometric se bazeaz pe fluorescena analiilor separai sau prin inducerea fluorescenei cu ajutorul laserului. Metodele amperometrice sau conductometrice sunt de asemenea utilizate n detecia HPCE.
Tabel 12.3. Performanele tipurilor de detecie n HPCE. Limita de detecie Limita de detecie Avantaje/ (mas)* (concentraie) dezavantaje - universal; -13 -16 -5 -8 Absorbie UV-VIZ 10 10 10 10 - informaie structural prin DAD. - sensibilitate mare; -15 -17 -7 -9 Fluorescen 10 10 10 10 - de regul, necesit derivatizare. - sensibilitate mare; - de regul, necesit Fluorescen indus -18 -20 -14 -16 10 10 10 10 derivatizare; prin laser - scump. - sensibilitate mare; - selectivitate n cazul compuilor electroactivi; -18 -19 -10 -11 Amperometrie 10 10 10 10 - necesit componente electronice speciale i modificri ale capilarei. - universal; - necesit componente Conductometrie 10-15 10-16 10-7 10-8 electronice speciale i modificri ale capilarei. - sensibilitate mare; - informaie structural; -16 -17 -8 -9 Spectrometrie de mas 10 10 10 10 - interfaa cu MS este complicat. Tip de detecie
* pentru 10 nL volum de injecie.

12.4 Cromatografia electrocinetic micelar Cromatografia electrocinetic micelar (MEKC Micellar Electrokinetic Chromatography) prezint caracteristici comune electroforezei i cromatografiei. Introdus n 1984 de ctre Terabe, MEKC reprezint n prezent unul dintre cele mai utilizate mecanisme n electroforeza capilar de mare performan, impunndu-se datorit aplicaiilor sale ca o tehnic de separare de sine stttoare.[131] In cazul cromatografiei electrocinetice micelare, n electrolitul suport se adaug un agent tensioactiv ntr-o concentraie mai mare dect concentraia sa micelar. De exemplu, agentul tensioactiv poate fi anionic (R-SO3-). In consecin, micelele generate vor avea o sarcin global negativ i vor crea n interiorul lor un spaiu hidrofob n care vor ptrunde molecule de analit cu structura hidrofob. Cmpul electroosmotic este
227

generat n aa fel nct s depeasc n modul pe cel electroforetic, caracteristic micelelor. Rezultanta celor dou cmpuri va determina deplasarea lent a micelelor anionice ctre electrodul pozitiv, acolo unde se situeaz i zona de detecie. Dac proba conine analii neionici acetia se vor deplasa spre catod n baza componentei de deplasare electroosmotic. Ordinea de eluie este dat de ordinea hidrofobicitii lor: cu ct analiii sunt mai hidrofobi, cu att mai mult distribuia acestora ntre micel i electrolitul suport va fi mai favorabil staionarii n interiorul micelei. Aceasta situaie este ilustrat n Fig. 12.6, n care este redat rezultatul unei separri MEKC a trei compui A, B i C, avnd valorile log Kow cresctoare n ordinea dat. Ultimul semnal nregistrat este cel al micelelor (tm), n timp ce primul semnal (pic) nregistrat corespunde fluxului electroosmotic, fiind analog timpului mort (t0) din cromatografia de lichide. Compuii puternic hidrofili, care nu interacioneaz cu micelele vor elua n acelai timp cu fluxul electroosmotic. Compuii puternic hidrofobi vor elua n acelai timp cu micelele formate. In concluzie, compuii neutri din punct de vedere electric vor elua n intervalul de timp [t0, tm]. Pe baza acestor parametri de retenie se pot calcula mrimile cunoscute n cromatografie, factorul de capacitate (k) i constanta de distribuie (K) a analiilor ntre electrolit (faza mobil, cu volumul Vmicele) i micele (analog fazei staionare n cromatografia de lichide, cu volumul Velectrolit).
k' = V tr t0 = K micele tr Velectrolit ) t 0 (1 tm

(12.14)

, n care a doua egalitate este dedus conform relaiei 9.50.

Micele Flux electroosmotic

A B

t0

tA

tB

tC

tm

A B Fig. 12.6. Separarea prin MEKC a trei analii A, B i C, avnd lg K ow < lg K ow < lg K C ow .

Dac n prob se vor gsi, specii anionice de analii sunt importante de cunoscut mobilitile lor electroforetice. Dac veanalit este mai mic n raport cu vem, analitul anionic va migra mai repede spre anod i astfel va elua naintea tm. Distribuia lui n spaiul intramicelar este puin probabil, deci poate fi neglijat. Dac veanalit este mai mare n
< v EOF , atunci analitul anionic elueaz dup tm. raport cu vem, dar totui v analit e
228

Selectivitatea separrilor MEKC este influenat de natura agentului tensioactiv adugat n electrolitul suport pentru formarea micelelor (care poate fi anionic, cationic, amfionic, neionic, sau amestecuri ntre acetia), pH-ul electrolitului suport, concentraia i natura tamponului utilizat, temperatura, sau prezena unor specii modificatoare (solvent organic, uree, ioni metalici, prezena unor selectori chirali). Agenii tensioactivi de tip neionic sau amfionic au cteva avantaje fa de cei ionici, prin faptul c nu modific drastic fluxul electroosmotic, nu modifica conductivitatea electrolitului suport i au o influen mai mic asupra structurii sau activitii n cazul separrilor de proteine. Ca exemple de aplicaii importante ale cromatografiei electrocinetice micelare pot fi menionate separrile de amino-acizi sau nucleotide, vitamine hidro- i lipo-solubile, compui de importan farmaceutic, hidrocarburi aromatice, compui cu caracter exploziv, etc. Ca avantaje ale acestei tehnici analitice pot fi menionate timpul mic de separare pentru probe complexe sau cantitatea mic de prob necesar. 12.5. Izotacoforeza In separarea prin izotacoforez, componenii probei aflai n form ionic prezint mobiliti diferite ntr-un cmp electric. In izotacoforeza zonal obinuit o prob este separat n zone utiliznd doi electrolii suport, avnd mobiliti electroforetice diferite: unul cu o mobilitate foarte mare (de exemplu, ionul acetat) i altul cu o mobilitate electroforetic foarte mic (de exemplu, ionul glicinat). Proba este introdus ntre zonele celor doi electrolii, dup care este aplicat un cmp electric. Principiul de separare a trei anioni oarecare este ilustrat schematic n figura de mai jos.
X, Y, Z
-

Y,Z

A Z, Y, X
-

Fig. 12.7. Principiul de separare prin izotacoforez: a) proba coninnd trei anioni (notai cu X , Y i Z ) sunt injectai ntre doi electrolii (A - frontal; B - final); b) se aplic un curent electric ntre cei doi electrozi, iar anionii migreaz spre electrodul pozitiv; c) dup un timp are loc separarea celor trei anioni n trei zone distincte.

229