PEPTIDE. PROTEINE Unitile constitutive de baz ale peptidelor/proteinelor sunt aminoacizii.

Acestia sunt uniti intre ei prin legaturi peptidice - legaturi de tip amidic stabilite intre carboxilul unui aminoacid si grupa amino a aminoacidului urmator. Prin urmare, prin hidroliza chimica sau enzimatica, orice proteina genereaza aminoacizi. Un numar mic de aminoacizi (3-50) legati prin legaturi peptidice alcatuiesc peptide. Mai multe peptide unite intre ele (incluzind 50-300 aminoacizi) formeaza polipeptide, iar 1-n polipeptide legate intre ele alcatuiesc proteinele (cu M = 5 0001000 000 u.a.m). O caten polipeptidic se scrie (se consider) ncepnd cu aminoacidul cu grupa NH2 liber (aminoacid N-terminal). Ultimul aminoacid va fi cel cu grupa COOH liber, acesta fiind numit aminoacid C-terminal. Prin urmare, denumirea unei peptide este alctuit din numele aminoacidului N-terminal i al celorlaltor aminoacizi n care se nlocuiete terminaia in cu il urmate de numele ntreg al aminoacidului C-terminal (spre exemplu alanil-valil-serina).
O CH3 H3C Aminoacid N-terminal Alanil-valil-serina CH CH3 O CH2 OH Aminoacid C-terminal

H2N CH C NH CH C NH CH COOH

O peptid atipic este glutationul (-glutamil-cisteinil-glicina). Acesta este o tripeptid alctuit din acid glutamic, cistein i glicin, acidul glutamic nefiind ns legat prin COOH din poziia ci cu cel din (legtur izopeptidic).
O NH HS H2C Cys HC C CH2 CH2 + NH3 _ COO _ CH COO Gly

Glu

C NH CH2 O Glutation

Glutationul se gsete n cantitate foarte mare n ficat i constituie cel mai abundent antioxidant cu mas molecular mic i unul dintre cei mai importani antioxidani plasmatici intra- i extracelular, datorit posibilitii sale de a exista att n form oxidat (GSSG) ct i redus (GSH). Cteva dintre funciile cele mai importante ale glutationului sunt: * n form redus particip la descompunerea apei oxigenate i a peroxizilor lipidici, protejnd astfel membranele celulare de aciunea oxidant a acestora; * contribuie la meninerea grupelor SH din centrul activ al enzimelor n form redus, la transformarea methemoglobinei (Fe3+) n hemoglobin (Fe2+); * inactiveaz insulina, prin reducerea punilor disulfurice din molecula acesteia;
1

* particip la biotransformarea substanelor xenobiotice din organism, fiind implicat n faza a II-a conjugarea (reaciile glutationului cu formele reactive ale toxicului rezultate n faza I prin reacii de oxidare, reducere, hidroliz etc.). Conjugarea este catalizat de glutation-S-transferaze (prezente preponderent n ficat, intestin, rinichi, glande suprarenale, plmni), fiind localizate n special n citoplasm; Peptidele ndeplinesc diferite roluri fiziologice: unele peptide din creier intervin n procesele memoriei, somnului, durerii (endorfinele, encefalinele), altele au rol de hormoni: glucagonul (hormon pancreatic cu rol n reglarea glicemiei), somatostatina (sintetizat n hipotalamus i pancreas regleaz eliberarea glucagonului i a altor hormoni), vasopresina (sau hormonul antidiuretic stimuleaz reabsorbia apei n tubii renali distali), oxitocina (stimuleaz contracia musculaturii netede a uterului). O peptid este i aspartamul (L-aspartil-L-fenilalanil-1-metilester), ndulcitor artificial, mai dulce de 160 ori dect zaharoza.
O O + H3N CH C NH CH C OCH3 CH2 CH2 _ COO C6H5 Aspartam

Proteinele sunt caracterizate de patru tipuri de structuri: primar, secundar, teriar i cuaternar. Structura primar se refera la numarul si felul aminoacizilor componenti si la inlantuirea lor secventiala. Are urmtoarele caracteristici: 1) constituie coloana vertebral a oricrei molecule proteice; 2) conine legturi peptidice; 3) este alctuit din secvene (succesiuni) bine definite a aminoacizilor in catenele peptidice, secvene aflate sub control genetic. Pe scurt, aceasta se explic astfel: secvena nucleotidelor din ADN (molecula ereditii) este transcris ntr-o secven complementar de nucleotide din ARN. Secvena de nucleotide din ARN este cea care determin succesiunea aminoacizilor din proteine, fiecare aminoacid fiind codificat prin una sau mai multe secvene de trei nucleotide numite codoni. 4) determina configuraia specific oricrei proteine. Structura tridimensional (conformaia spaial) i activitatea biologic a proteinei sunt dependente si controlate de secvena de aminoacizi caracteristic structurii primare. Proteinele sunt macromolecule naturale, majoritatea cu caten liniar (neramificat). Legtura peptidic este stabilizat prin rezonan i are aproximativ 40% caracter de dubl legtur, prin urmare atomii de carbon i azot nu se pot roti liber, iar atomii de oxigen i hidrogen se afl n poziie trans.

C C O

..

H C'

C _ . .O C

H C'

C _ C O

+ N

H C'

Atomii de carbon, oxigen, azot, hidrogen, mpreun cu cei doi atomi de carbon C i C implicai n legturile peptidice sunt coplanari iar resturile de aminoacizi (radicalii organici ai aminoacizilor) sunt dispui alternativ deasupra i sub planurile legturilor peptidice, ntr-un aranjament trans repetabil.
H C C O H N C R O C N H R H C C O H H N C R O C N H R H C C O

Geometria trans a legaturilor peptidice

I. Prima etapa in studiul unei proteine o constituie izolarea (separarea) in stare pura a proteinei. Acest lucru se realizeaza in special prin metode cromatografice (cromatografia pe hirtie, in strat subtire, pe coloana, pe geluri, pe schimbatori de ioni, cromatografie de afinitate), prin electroforeza dar si prin tehnici de cristalizare, precipitare, dizolvare selectiva etc. II. A doua etapa o reprezinta analiza calitativa si cantitativa. 1. dac proteina conine mai multe lanuri polipeptidice, acestea se separ prin tratare cu un acid, o baz sau o sare foarte concentrate ori cun agent de denaturare i se purific; 2. toate punile de sulf sunt rupte (spre exemplu cu ajutorul acidului performic sau -mercaptoetanolului), iar grupele SH rezultate se alchileaz (de obicei cu iodoacetat); 3. se efectueaz hidroliza total a fiecrui lan peptidic, n mediu puternic acid (HCl la fierbere), urmat de dozarea cromatografic a amestecului de aminoacizi rezultai. Se obine compoziia peptidei, dar nu este furnizat nicio informaie cu privire la ordinea (succesiunea) aminoacizilor n catena polipeptidic; 4. se identific aminoacizii N- i C-terminali; 5. se efectueaz hidrolize pariale, chimice sau enzimatice, obinndu -se peptide mai mici din care se poate determina secvena de aminoacizi. Pentru determinarea succesiunii aminoacizilor se apeleaz la urmtoarea strategie: Determinarea aminoacidului N-terminal - cu ajutorul unui reactiv ce marcheaza aminoacidul N-terminal. Reactivul poate fi: * 2,4-dinitrofluorobenzenul (DNFB, reactivul lui Sanger)

O2N

F + H2N CH C NH CH CO R1 O R2 NO2 H2O H+ O2N NH CH COOH + R1 NO2

O2N

NH CH C R1 NO2 O

NH CH CO R2

H2N CH CO R2

+ amestec de aminoacizi si oligopeptide

Se efectueaz apoi hidroliza rezultnd aminoacidul marcat, galben strlucitor, care se separ de restul aminoacizilor formai prin extracie cu eter de petrol. Prin aceast metoda catena polipeptidic este distrus. * fenilizotiocianatul. Prin tratarea cu acest reactiv rezulta un derivat de tiouree care este scindat de restul peptidei printr-o hidroliza blinda (cu HCl diluat sau acid trifluoroacetic).
Ph N C + H2N CH CO NH CH CO R R'
pH=9

Ph

NH .. C NH CH R S
F3CCOOH anh.

..

S Fenilizotiocianat

CO NH CH CO R'

R HN S

O H N Ph
+

R N

O S NH Ph + H3N CH CO NH CH CO R' R''

+

Feniltiohidantoina

Derivat de tiazolinona (se extrage intr-un solvent organic si se transforma intr-un compus mai stabil)

In acest caz se separa un singur aminoacid (cel N-terminal), restul catenei polipeptidice ramnnd intact.Operaia poate fi repetata, detandu-se si analiznduse de fiecare dat un singur aminoacid (procedeu pus la punct in 1950 de ctre Pehr Edman, care a reusit apoi automatizarea acestuia). Procedeul este limitat la polipeptide cu cel mult 20 aminoacizi. * alti reactivi pentru capatul N-terminal: clorura de 1-dimetilaminonaftalin-5sulfonil (clorura de dansil) si clorura de 4-dimetilaminoazobenzen-4-sulfonil (clorura de dabsil), metodele respective fiind foarte sensibile
H3C N H3C N H3C SO2Cl Clorura de dansil (Clorura de 1-DimetilAminoNaftalin-5-Sulfonil) Clorura de dabsil (Clorura de 4-DimetilAminoAzoBenzen-4'-Sulfonil) N N SO2Cl CH3

In cazul utilizarii acestor reactivi, dar si in cazul folosirii reactivului Sanger, pentru peptide cu numar mic de aminoacizi este utila efectuarea unei hidrolize partiale (folosind cantitati de apa si acid mai mici decit cele necesare stoechiometric), hidroliza in urma careia rezulta un amestec de aminoacid marcat, alti aminoacizi si di, tri, polipeptide. Polipeptidele se separa din amestec si sint supuse unei noi hidrolize, obtinindu-se aminoacizii componenti. Restul se reduce la o problema de logica. Determinarea aminoacidului C-terminal Se realizeaza cel mai bine prin hidroliza enzimatica cu ajutorul peptidazelor (enzime hidrolitice -hidrolaze- specializate in hidroliza unei anumite legaturi peptidice). In functie de pozitia legaturii peptidice atacate de enzima se deosebesc: exopeptidaze (hidrolizeaza legaturile peptidice marginale) si endopeptidaze (hidrolizeaza legaturi peptidice interioare). Spre exemplu, carboxipeptidaza (enzim extras din pancreas) este o exocarboxipeptidaz care atac legatura peptidic vecin cu COOH liber, realizndu-se astfel descompunerea lantului polipeptidic pornind de la capatul C-terminal. Aceasta metoda poate fi si ea automatizata. Similar, aminoacid peptidazele (exoaminopeptidazele) realizeaz ruperea legturii peptidice formate de aminoacidul N-terminal. Att endo- ct i exo-peptidazele au cerine specifice legate de natura resturilor de aminoacid ce alctuiesc legtura peptidic pe care o scindeaz (v. mai jos). Alte metode de identificare a aminoacidului C-terminal: *esterificarea cu metanol urmata de reducere cu LiBH4 si apoi de hidroliza totala - rezulta aminoalcoolul corespunzator alaturi de ceilalti aminoacizi liberi;
H2N CH CO NH CH CO R1 R2 NH CH CO NH CH COOH Rn-1 Rn NH CH CO NH CH COOCH3 Rn-1 Rn
H2O HCl
+

CH3OH

H2N CH CO NH CH CO R1
LiBH4 H2N

LiBH4

R2

CH CO NH CH CO R1 R2
+

NH CH CO NH CH CH2OH Rn-1
+

Rn
+

H 2O HCl

_ + H3N CH COO R1

_ + H3N CH COO R2

.............

H3N

_ CH COO Rn-1

H3N

CH CH2OH Rn

*hidrazinoliza (reacia cu hidrazina n mediu acid), prin care toate legaturile peptidice sunt desfacute obtinindu-se aminoacidul C-terminal liber alturi de aminoacil-hidrazidele respective.
H2N CH CO NH CH CO R1
+

NH CH CO NH CH COOH Rn-1
+

H2N NH2

H2N

CH C NH NH2 + R1 O

R2 H2N CH C NH NH2 R2 O

Rn
+

.............

H2N

CH C NH NH2 Rn-1 O

H2N

CH COOH Rn

Cu ajutorul endopeptidazelor pot fi efectuate scindari selective in interiorul lantului peptidic, existind enzime care hidrolizeaza legatura peptidica din imediata vecinatate a anumitor aminoacizi. - pepsina (acioneaz n mediu puternic acid, pH2) hidrolizeaz n principal legturile peptidice formate de grupele NH2 ale fenilalanainei, triptofanului, tirosinei i leucinei (dar i ale altor aminoacizi); - tripsina (enzim secretat de pancreas n intestinul subire; acioneaz n mediu slab bazic, pH8) hidrolizeaza legaturile peptidice formate de grupele COOH ale lizinei si argininei (aminoacizi cu catene laterale ncrcate pozitiv); - chimotripsina (de asemenea secretat de pancreas n intestinul subire i acionnd n mediu slab bazic), mai putin selectiva, hidrolizeaza legaturile peptidice formate de grupele COOH ale tirosinei, fenilalaninei, triptofanului (aminoacizi cu grupe hidrofobe voluminoase) si, mai lent, ale metioninei, asparaginei, histidinei, leucinei i acidului glutamic. Cele trei enzime nu acioneaz n cazul n care cellalt aminoacid implicat n legturile peptidice scindate este prolina. Exista si reactivi chimici specifici anumitor aminoacizi. Spre exemplu: bromcianul (Br-CN) realizeaza ruperea legaturii peptidice formate de grupa COOH a metioninei (aceasta este un aminoacid mai puin rspndit n proteine, de aceea scidarea legturilor peptidice formate de metionin permite, n practic, fragmentarea polipeptidelor n oligopeptide); N-bromosuccinimida scindeaza legaturi peptidice vecine cu tirosina.

H2N

CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH CO NH CH COOH R1 R2 Rx Ry Rn-1 Rn - exocarboxipeptidaze - esterificare si reducere cu LiBH4 - hidrazinoliza

- exo-aminopeptidaze - metoda Sanger - metoda Edman - clorura de dansil/dabsil

- bromcian pt. Rx = Met - endo-peptidaze: * pepsina pt. Ry = Phe, Tyr, Trp * tripsina pt. Rx = Lys, Arg * chimotripsina pt. Rx = Phe, Tyr, Trp Leu, Met, Asn, Glu etc.

Structura secundar Reprezint organizarea spatiala a catenei polipeptidice principale (a coloanei vertebrale a moleculei polipeptidice, alctuite din atomii participani la legturile amidice, fr considerarea catenelor laterale). Este realizat i stabilizat prin legturile de hidrogen intra- i intercatenare dintre grupele amino si carbonil ale legturilor peptidice. Este reprezentat prin doua conformaii caracteristice proteinelor fibrilare: elice (- helix) si foi pliate sau conformatie (-pleated sheet). O conformatie speciala o reprezinta conformaia tip colagen.

Conformatia elice . La baza descoperirii ei au stat cercetarile cu raze X efectuate de W. Astbury, in Anglia, la inceputul anilor30. Spectrele de difractie de raze X au indicat o periodicitate sau o unitate (lungime) ce se repeta de aprox. 0,5 0,55 nm de-a lungul axei longitudinale. Continund studiul cu raze X al aminoacizilor, al di- i tri-peptidelor, Linus Pauling propune (1951) conformaia de elice a lanurilor proteice: conformatie elicoidala rezultata prin spiralarea catre dreapta a catenei polipeptidice; pasul elicei (distanta dintre doua puncte identice din spire consecutive)= 5,4, fiecare pas este alcatuit din 3,6 aminoacizi iar o spira este alcatuita din 4,6 aminoacizi. Conformaia de elice este posibil datorit configuraiei L a aminoacizilor componeni ai proteinelor. Este o conformaie contractat meninut prin legturi de hidrogen intracatenare stabilite ntre grupa carbonil a unei legturi amidice i grupa amino a
7

altei legturi amidice separate de prima prin 3 aminoacizi (altfel spus, ntre grupa carbonil a aminoacidului n i grupa NH2 a aminoacidului n+4).

Radicalii aminoacizilor componenti sunt asezati alternativ deasupra si sub planurile legaturilor peptidice si orientati spre exteriorul elicei, astfel nct interaciunile sterice ntre ei i de asemenea cu catena principal sunt minime. Aminoacizii predominani sunt cei cu catene nepolare: alanin, leucin, izoleucin, fenilalanin, metionin. Exemplul clasic de proteine cu conformaie de elice il constituie -keratinele. -Keratinele se gsesc in coarne, unghii, piele, pr, ln etc. Aceste keratine sunt bogate n resturi de cistein, ceea ce perimite formarea unui numr mai mare sau mai mic de puni de sulf. Cu ct acest numr este mai mare cu att fibra este mai dur (rigid). -Keratina se ntinde la incalzire, astfel ca firul de par cre umed, supus la incalzire isi dubleaza lungimea, prin ruperea legaturilor de hidrogen i a punilor disulfurice intracatenare (ceea ce duce la distrugerea elicei si rearanjarea catenelor intr-o conformatie ). Alungirea nu este permanenta, parul revenindu-si, n timp, prin racire, la lungimea normal. Conformatia sau foi pliate (-pleated sheet) a fost propus tot n anul 1951, de ctre Linus Pauling i Robert Corey. Reprezinta o conformatie ordonata si relaxata, stabilizata prin legaturi de hidrogen intercatenare, in care catenele polipeptidice au conformatie in zig-zag, fiind paralele intre ele. Legaturile de hidrogen se formeaza in numar maxim, intre grupe carbonil si amino apartinind la catene diferite. Radicalii aminoacizilor se afla dispusi alternativ deasupra si sub
8

planul legaturilor peptidice, iar atomii de carbon purtatori ai acestor radicali sint amplasati pe muchia dintre doua planuri.

Orientarea catenelor polipeptidice poate fi paralel (ambele catene evolueaz de la captul N-terminal spre cel C-terminal) sau antiparalel (un lan se desfoar de la captul N-terminal spre cel C-terminal, iar cellalt n sens invers). Conformaia cu catene paralele este mai puin stabil dect cea cu caten ele orientate antiparalel, cel mai probabil din cauza distorsionrii legturilor de hidrogen intercatenare.

Prototipurile acestui model sunt -keratinele - acestea se gasesc in firul produs de viermii de matase, in solzii, ghearele si ciocurile reptilelor si pasarilor. Spre deosebire de -keratine, -keratinele nu se pot ntinde deoarece lanurile polipeptidice sunt deja aproape complet ntinse. Conformaia tip colagen este specific colagenului. Colagenul este cea mai abundent protein prezent n vertebrate; reprezinta cca 1/3 din totalul proteinelor din organismul animal, fiind prezent in piele, oase, cartilagii, tendoane, cornee, dinti, vase de singe etc. Confer form i rezisten esuturilor n care se gsete. Exist mai multe tipuri de colagen, majoritatea coninnd in proporie mare glicocol (~30-35%) i n cantiti semnificative prolin (~12%), 4-hidroxiprolin (~9%, acest aminoacid fiind rar ntlnit n alte proteine) i

de asemenea alanin (~11%). Astfel, secvenele de aminoacizi cele mai frecvent ntlnite sunt Gly-Pro-X sau Gly-X-Hyp (X poate fi orice alt aminoacid). Prezint o conformatie de elice tripla sau super-elice (triplu helix) foarte rigida): trei catene polipeptidice rasucite spre stinga, fiecare catena fiind nfurat slab, spre dreapta, una n jurul celeilate. O spira din oricare elice este alcatuita din 3 aminoacizi. Aceasta conformatie este favorizata de prezenta in proportie mare a prolinei, hidroxiprolinei si glicocolului care nu permit adoptarea uneia dintre conformatiile mentionate anterior. Numeroasele resturi de prolina determina aranjamentul elicoidal, caracteristic, al lanturilor, in timp ce radicalii de glicocol, mai mici, plasati in fiecare a treia pozitie, permit incolacirea lanturilor unul in jurul celuilalt (atomul de hidrogen din catena lateral a glicocolului fiind singurul care se potrivete (are loc) n interiorul att de aglomerat al super-elicei. Stabilitatea super-elicei este asigurata de legaturi de hidrogen din interiorul fiecarei elice si intre elicele componente, realizate in special de catre prolina. Se formeaza insa si legaturi de hidrogen suplimentare de ctre grupele OH din 4 hidroxiprolina (mai rar i din 3-hidroxiprolin) si 5-hidroxilisina, acesti doi aminoacizi formndu-se prin hidroxilare enzimatica n cursul biosintezei colagenului. Grupa OH din 4-hidroxiprolina este indispensabila pentru formarea legaturilor de hidrogen intercatenare, lanturile polipeptidice ale tropocolagenului nerasucindu-se in super-elice in absenta lor; de asemenea nici asamblarea irurilor de tropocolagen n fibrile nu se poate realiza n absena legturilor de hidrogen ale 4-hidroxiprolinei. Hidroxilarea prolinei i lizinei are loc in prezenta enzimelor prolilhidroxilaz, respectiv lizilhidroxilaz, a oxigenului, -cetoglutaratului i a vitaminei C. Lipsa vitaminei C impiedica deci hidroxilarea prolinei si lisinei, conducind la slabirea rezistentei pielii si a vaselor de singe, la singerarea gingiilor, la dermatoza si la aparitia scorbutului.
_ COO N C H H prolina CH C NH O + O2 + CH2 CH2 C O _ COO N prolilhidroxilaza vitamina C - CO2 C H H 4-hidroxiprolina CH C NH O + _ COO CH2 CH2 _ COO succinat

-cetoglutarat

_ COO NH CH CO (CH2)4 NH2 lizina + O2 + CH2 CH2 C O _ COO -cetoglutarat lizilhidroxilaza vitamina C - CO2

NH CH CO (CH2)2 CH OH CH2 NH2 5-hidroxilizina +

_ COO CH2 CH2 _ COO succinat

10

Fibra de colagen este alctuit din mai multe fibrile, aranjate diferit, n funcie de rolul biologic al esutului respectiv. Astfel, ele pot fi dispuse n mnunchiuri paralele (n tendoane, avnd o rezisten deosebit de mare la ntindere) sau se pot ncrucia formnd o reea (n piele). Unitatea structurala de baza este tropocolagenul format din elice triple de colagen. Unitatile de tropocolagen sunt asezate cap la coada, in sir, nefiind insa unite, astfel incit intre ele exista spatii. Sirurile de tropocolagen sint dispuse paralel in manunchiuri in care capetele apar in trepte, decalate cu cca 67 nm (un sfert din lungimea unei uniti de tropocolagen).

Lanurile polipeptidice paralele de tropocolagen sunt unite ntre ele prin legturi covalente ncruciate. Numrul legturilor covalente crete odat cu vrsta. Se formeaz astfel fibrila de colagen, cu o rezisten foarte mare. Colagenul nu este o protein simpl ci, de fapt, este o glicoprotein, ntruct acesta leag prin grupa OH a 5 hidroxilizinei carbohidrai (oligozaharide) printr-o legtur O-glicozidic. Prin nclzirea ndelungat a colagenului cu ap, acesta nti se mbib cu ap, apoi, prin ruperea unor legturi de hidrogen se transform n gelatin. Aceasta este uor solubil n ap (la uoar nclzire), formnd soluii vscoase care la rcire se transform n geluri elastice (piftii) ce conin 2-3% gelatin, restul ap. Oasele i dinii sunt alctuite n principal din colagen i hidroxiapatit de calciu [Ca5(PO4)3OH]. Hidroxiapatita cristalizeaz n spaiile libere dintre unitile de tropocolagen rezultnd un material dur dar cu o oarecare elasticitate datorat colagenului. partea interioar a dintelui este alctuit n principal din dentin ce are un procent mare de substan anorganic (75%); partea exterioar are un coninut i
11

mai mare (95%) de substan anorganic, ceea ce determin o duritate foarte mare. Oasele au un coninut de substan anorganic mai mic dect dintele fiind deci mai puin dure (rezistente). Alte proteine fibroase Elastina Se gaseste in tesutul conjunctiv si participa la realizarea structurii arterelor si ligamentelor, fiind flexibila si extensibila dupa toate directiile datorita prezentei dezmozinei care realizeaz ncruciarea lanturilor polipeptidice. Contine in proportie mare glicina, prolina, lisina si alanina. Fibrinogenul este proteina cu molecula de dimensiunea cea mai mare prezenta in serul sanguin, avnd structura asemanatoare -keratinei. Are rol esential in procesul de coagulare a singelui, proces in care fibrinogenul se transforma ireversibil in fibrina, insolubila. Procesul de coagulare are loc n prezena trombinei, fibrinazei i a ionilor Ca2+. Structura tertiara (determinarea acesteia a fost posibila tot cu ajutorul razelor X) se refer la aranjamentul spaial al ntregii catene polipeptidice, incluznd i catenele laterale. Ea indic i poziia fiecrui atom n protein. Este caracteristica proteinelor globulare i reprezinta un stadiu avansat de organizare spatiala rezultnd n urma replierii catenelor polipeptidice ale proteinelor avnd conformaiile descrise mai sus (stucturile teriare ale multor proteine globulare sunt combinaii ale tipu rilor de structuri secundare). Conformaia obinut este mai compact fiind caracterizat de alternana unor poriuni regulate i rigide cu poriuni neorganizate si flexibile. Aproximativ jumtate din resturile de aminoacizi ale unei proteine globulare se afl ca elice i foi pliate, restul sunt inclui n segmente cu diverse conformaii: coturi, bucle, ndoituri etc. Legturile intercatenare ce stabilizeaza structurile tertiare sunt: - interactiuni hidrofobe intre radicalii nepolari din leucina, izoleucina, valina, alanina, fenilalanina. Aa cum a fost precizat anterior, acestea nu sunt interaciuni propriu-zise ci reprezint tendina de atractie mutuala a gruparilor nepolare ce are ca efect direcionarea radicalilor hidrofobi din catenele laterale ctre interiorul moleculei, excluznd moleculele de ap din regiunea intern hidrofoba astfel formata; - legaturi de hidrogen ne-peptidice intre grupe OH si COOH i peptidice intre diferite segmente pliate ale moleculei; - interactii ionice sau puni de sare intre gruparile polare NH3+ din aminoacizi diaminomonocarboxilici si COO- din aminoacizi monoaminodicarboxilici; - legaturi covalente: punti de sulf intre radicalii de cisteina; Structura tertiara este foarte sensibila la actiunea factorilor fizici si chimici care produc ruperea legaturilor implicate in organizarea tertiara. Aceasta determina denaturarea proteinelor, insotita de obicei de pierderea proprietatilor biologice. Structura cuaternar este caracteristica unor proteine cu mase moleculare mai mari de 100 kDa, constituite din mai multe catene polipeptidice (subuniti) i se refer la aranjamentul spaial al subunitilor componente. Aceste proteine se gasesc

12

ca agregate moleculare numite oligomeri (dimeri, trimeri, tetrameri), alcatuiti din mai multi protomeri (2, 3, 4). Interactiunile prin care se asambleaza subunitatile agregatului molecular (protomerii) sunt de natura fizic: interaciuni electrostatice si legaturi de hidrogen localizate la suprafata fiecarei catene polipeptidice. Exemplul tipic este hemoglobina: tetramer alcatuit din 2 catene si 2 catene , iar alt exemplu il reprezinta enzimele alosterice (v. mai departe) ale cror subunitti sunt asamblate n molecula proteic prin interacii necovalente. Spre deosebire de acestea, mioglobina, alctuit dintr-un singur lan polipeptidic, sau chimotripsina, ce conine trei lanuri polipeptidice meninute mpreun prin legturi covalente (puni de sulf intercatenare), nu prezint structuri cuaternare.

13

PROTEINE GLOBULARE Caracteristici generale: au forma sferica sau ovala conformatia este mult mai complexa decit a proteinelor fibroase au activitate biologica specifica (spre deosebire de proteinele fibroase care au functie structurala si mecanica): majoritatea sint enzime; unele au rol in apararea organismelor impotriva bolilor (imunoglobuline), altele transporta diverse substante ca oxigen, acizi grasi, lipide, hormoni etc. exemple: albumine, globuline Albuminele pot fi atit de origine vegetala cit si animala; cele de origine animala sint raspindite in citoplasma si in lichidele biologice (spre ex. plasma sanguina) in compozitia lor intra toti aminoacizii cu exceptia glicocolului albuminele plasmatice (serumalbuminele) reprezinta cca 60% din proteinele plasmatice; sint sintetizate in ficat, avnd printre altele, rol n: * mentinerea presiunii osmotice a singelui, controlul presiunii singelui si implicit al tensiunii; * meninerea echilibrului acido-bazic (moleculele au sarcin negativa i alturi de ionii fofat i de hemoglobin constituie principalii ioni negativi care se altur anionului Cl- pentru compensarea sarcinilor pozitive constituite din Na+ i K+); * legarea i transportul unor molecule endogene (acizii grasi, bilirubina) i exogene (xenobiotice medicamente, toxice); * captarea radicalilor liberi (cu efect oxidant nociv pentru organism) datorit numeroaselor grupe SH reductoare pe care le conin; constituie o rezerva de proteine in unele plante, semine, ou; sint insotite de globuline spre exemplu: serumalbuminele sint insotite in plasma sanguina de serumglobuline; lactoalbuminele din lapte sint insotite de lactoglobuline; ovalbuminele din albusul de ou de ovoglobuline; mioalbuminele din muschi de mioglobuline (anume de miozina; aceasta este proteina contractila din tesutul muscular care este alcatuita din trei catene elicoidale avind un segment terminal cu aspect globular prezinta deci proprietati caracteristice atit proteinelor fibroase cit si celor globulare) Globulinele serumglobulinele reprezinta cca 36% din proteinele plasmatice si sint de mai multe tipuri: , , . Valorile cantitative ale acestor fractiuni variaza in functie de specie si de anumite stari patologice si globulinele sint sintetizate in ficat si ajuta la transportul lipidelor si al vitaminelor liposolubile; sint produse in tesuturile limfatice si functioneaza ca anticorpi de imunitate pot fi separate de albumine (cu care coexista) prin precipitare in solutii de sulfat de amoniu: albuminele precipita din solutii saturate, iar globulinele precipita la concentratii mai mici (50%) de sulfat de amoniu

14

HETEROPROTEINE (PROTEINE CONJUGATE) Sint proteine conjugate rezultate prin asocierea unei componente proteice si a unei componente neproteice denumita grupare prostetica. In functie de natura grupei prostetice, proteinele conjugate se impart in: - metaloproteine (proteina + metal) - cromoproteine (proteina + compus colorat, de ex. hem) - fosfoproteine (proteina + rest de acid fosforic) - lipoproteine (proteina + lipid) - nucleoproteine (proteina + acid nucleic) Metaloproteinele contin ca si grupare prostetica un metal, de obicei sub forma de ion bivalent: Fe, Cu, Mn, Zn, Co, Ni etc. Componenta proteica fixeaza metalul prin anumite grupari ale acesteia, numite liganzi care pot dona electroni metalului stabilindu-se astfel legaturi coordinative intre gruparea prostetica si componenta proteica. Metalul astfel fixat de molecula proteica poate stabili insa legaturi coordinative si cu alti liganzi reprezentind molecule mici, formind astfel un complex intern numit chelat. Asemenea structuri chelatice sint posibile in metalenzime si explica mecanismul functional al acestora in reactiile biochimice pe care acestea le catalizeaza. Exemple: * metaloproteine continind Fe: hemoglobina (in hematii) transporta oxigenul; mioglobina (in muschi) transporta si depoziteaza oxigenul; feritina (glicoprotein intracelular sintetizat n ficat) - rol important n stocarea fierului n ficat, splin, mduva osoas; transferina (glicoprotein de legare plasmatic a fierului, sintetizat de ctre ficat) transport fierul n snge; ovotransferina protein de legare a fierului in albusul de ou; lactotransferina proteina de legare a fierului, prezenta in lapte, saliva, lacrimi i alte secretii. * metaloproteine continind Cu: ceruloplasmina (in plasma) transportor de Cu in singe, de culoare albastra; hemocianinele - pigmentii respiratori de culoare albastra din singele molustelor si al artropodelor: melci, crabi, homari, caracatite, scorpioni. Acesti pigmenti nu sint continuti in corpuscule, ca hemoglobina, ci sint dizolvati in plasma sanguina, iar metalul este legat direct de proteina si nu prin intermediul unei alte grupe sau molecule (cum este protoporfirina in molecula hemoglobinei). In stare neoxigenata sint incolori, in stare oxigenata sint albastri. * metaloproteine continind V: pigmentul respirator din singele ascidiilor. Unele metaloproteine sint si cromoproteine Cromoproteinele contin ca si componenta prostetica o substanta colorata care confera culoare intregii molecule. Se clasifica in cromoproteine porfirinice si cromoproteine neporfirinice. In cromoproteinele porfirinice componenta prostetica este o combinatie tetrapirolica diferit substituita numita porfirina. Exemple: mioglobina, hemoglobina, citocromii, enzimele heminice sint pigmenti respiratori; cloroplastine (clorofila), ficobiline (ficocianinele si ficoeritrinele pigmentii din algele albastre, respectiv rosii) nu sint pigmenti respiratori ci sint implicati in fotosinteza.

15

Cromoproteine porfirinice Mioglobina este cromoproteina de culoare rosie existenta in muschi. Are rol de a stoca si difuza oxigenul in tesutul muscular si se gaseste in cantitate mare in tesuturile musculare ale animalelor acvatice (balena, foca, morsa etc.) care trebuie sa stocheze mari cantitati de oxigen pentru a putea supravietui sub apa timp indelungat. Componenta proteica este formata dintr-un singur lant polipeptidic alcatuit din 153 aminoacizi; 75% din catena este -helix (cei 153 aminoacizi sint grupati in 8 segmente de elice unite prin portiuni neelicoidale constituite din prolina, serina si izoleucina). Contine o singura grupare hem. Reprezinta prima proteina a carei structura tridimensionala a fost studiata in detaliu cu ajutorul razelor X (rezultatele publicate in 1960 de catre John Kendrew). Cercetarile au evidentiat o structura compacta, in care catenele laterale nepolare ale aminoacizilor sint orientate spre interior, iar hemul este plasat intr-un buzunar captusit cu resturi de aminoacizi nepolari fiind fixat prin forte hidrofobe. Singurele resturi polare din interiorul moleculei sint doua resturi de histidina legate coordinativ de ionul de fier din centrul hemului. Afinitatea mioglobinei pentru oxigen este de cca 6 ori mai mare decit cea a hemoglobinei, formnd cu acesta un complex disociabil.
MbO2 Mb
+

O2

Hemoglobina reprezinta cromoproteina de culoare rosie existenta in hematiile din singele vertebratelor. Are rolul de a transporta oxigenul molecular de la plamini la tesuturi, pe baza capacitatii hemoglobinei de a foma cu O2 un complex disociabil numit oxihemoglobina. Componenta proteica (globina) este formata din patru lanturi polipeptidice (4 protomeri): 2 unitati (fiecare alcatuita din 141 aminoacizi) si 2 unitati (alcatuite din 146 aminoacizi). Fiecare protomer are atasat un hem. Hemul este alcatuit dintr-o molecula de protoporfirina avind ca substituenti radicali metil, vinil, propionil, in centrul careia se afla un ion de fier bivalent. Fierul este legat de atomii de azot pirolici prin doua legaturi covalente si doua coordinative (coplanare si perpendiculare doua pe celelalte doua).
H 2C H 3C N CH CH3 CH CH2 N H 3C H2C _ OOC H2C CH2 Hem CH2 _ COO Fe
2+

N N CH3

N NH

HN N

Porfina

16

Combinatii ale hemoglobinei Combinatia hemoglobinei cu oxigenul - oxihemoglobina Rolul hemoglobinei in organism este de a transporta oxigenul de la plamini la tesuturi si dioxidul de carbon de la tesuturi la plamini. Transportul oxigenului se realizeaza pe baza capacitatii hemoglobinei de a forma cu acesta un compus disociabil numit oxihemoglobina.
[Hb]4
+

4 O2

[HbO2]4

Factorul esential care influenteaza echilibrul oxigenare - deoxigenare este presiunea partiala a oxigenului: la nivelul alveolelor pulmonare, unde presiunea partiala a oxigenului este mare (~100 mmHg) se formeaza HbO2, iar la nivelul vaselor capilare din tesuturi, unde presiunea partiala a oxigenului este mica (~30 mmHg), are loc disocierea HbO2 cu eliberarea oxigenului necesar oxigenarii tesuturilor si deci reactiilor biochimice celulare ce necesita oxigen. Combinatia hemoglobinei cu dioxidul de carbon carbohemoglobina Fixarea dioxidului de carbon la hemoglobina are loc covalent, la o grupa amino libera a globinei, formindu-se un compus disociabil de tip carbamat:
Hb NH2
+

CO2

Hb

_ NH COO

H+

In acest mod, hemolobina transporta dioxidul de carbon de la tesuturi, unde presiunea partiala a dioxidului de carbon este mare, spre plamini, unde acesta se desoarbe, presiunea sa partiala fiind mica; are loc astfel eliminarea dioxidului de carbon prin procesul de expiratie. Combinatia hemoglobinei cu monoxidul de carbon carboxihemoglobina Carboxihemoglobina rezulta prin legarea coordinativa a monoxidului de carbon de catre hemoglobina, aceasta avind o afinitate mult mai mare pentru monoxidul de carbon decit pentru oxigen. Este un compus toxic, putin disociabil, care blocheaza functia respiratorie a hemoglobinei, provocind intoxicatii sau asfixie - n cazul n care 50% din hemoglobina este blocata sub forma de carboxihemoglobina. Derivati ai hemului continind Fe3+ Compusii in care hemul contine ionul Fe3+ (in loc de Fe2+) se numesc hemine; acestia isi pierd capacitatea de a lega oxigenul. In acesti compusi apare si un anion de compensare: Cl- (in clorhemina sau hemina), OH- (in hematina) Prin tratarea hemoglobinei, la cald, cu acid acetic si clorura de sodiu are loc separarea hemului de globina simultan cu oxidarea Fe2+ la Fe3+ si formarea heminei (clorheminei), cristale caracteristice rosii. Reactia este foarte sensibila, fiind utilizata la identificarea urmelor de singe (spre ex. in criminalistica). Combinatia hematinei cu globina se numeste methemoglobina. Aceasta se formeaza prin oxidarea Fe2+ din hemoglobina cu MnO4- , ClO4-, nitrobenzen. Apare in urina si singe in intoxicatiile cu nitrobenzen sau alti oxidanti.

17