3.

2 PEPTIDE Peptidele se formeaz prin condensarea grupei amino (din poziia ) dintr-un aminoacid cu gruparea carboxil (din poziia ) a unui alt aminoacid cu formarea unei legturi amidice (numit legtur peptidic). Formula general a unei peptide este: O H2N C C N H R C H C O H N H

COOH

H R aminoacid N-terminal

R n aminoacid C-terminal

3.2.1 Clasificare. Nomenclatur a)Dup numrul de aminoacizi din molecul: - oligopeptide : 2 < n < 10 resturi de aminoacid - polipeptide : 11 < n < 50 - -- proteine: n > 50 - -b)Dup forma lanului peptidic: - liniare - ramificate - ciclice - semiciclice Numele unei peptide este format din numele aminoacidului N-terminal + il, urmat de numele celorlali aminoacizi componeni, iar la sfrit se adaug numele ntreg al aminoacidului C-terminal: Exemplu: alanil-valil-fenilalanil-glicina

43

Multe peptide naturale cu funcie biologic important au denumiri comune: - glutationul este -glutamil-cisteinil-glicina: O O _ OOCCHCH2CH2CNHCHCNHCH2COOH NH3 + - carnosina este -alanil-histidina: CH2SH N H2NCH2CH2CNHCHCH2 O -oxitocina: Cys Tyr Ile Gln Asn Cys Pro Leu GlyNH2 S -vasopresina: Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg GlyNH2 S 3.2.2 Structura peptidelor Studiul structurii legturii peptidice este foarte important pentru determinarea structurii proteinelor care sunt catene polipeptidice mari, capabile s adopte o structur tridimensional prin formarea de legturi covalente S-S, legturi de hidrogen, legturi mai slabe de tip van der Waals sau electrostatice,etc. Legtura peptidic este o legtur amidic n care exist o conjugare caracteristic: H H C 1 C 1 N N .. C C 2 C + C 2 _ : O: :O : .. S S COOH NH

44

Aceast conjugare determin coplanaritatea atomilor implicai: C 1-O-C-N-C 2. Atomii de carbon chirali din poziiile fa de gruparea carbonil i NHau o structur tetraedric, atomul de hidrogen i restul R fiind orientai n spaiu de o parte i de alta a planului catenei polipeptidice:
o O oR H 110 123 N C C C C oN 117 H O H R

H C O

H N H
o

O C R C N H

1.32 A (~ C = C)

1.47 A

1.53 A (~ C-C )

In legtura peptidic legtura C-N are caracter parial de dubl legtur, iar legtura C=O are caracter parial de simpl legtur, fapt ce are dou consecine importante: - grupa iminic NH nu are tendin de ionizare sau protonare - legtura C-N este rigid fiind mpiedicat rotaia liber n jurul su, catena adopt astfel conformaii stabile. 3.2.3 Proprietile peptidelor a) Starea de agregare Peptidele sunt compui solizi cu punct de topire ridicat. b) Solubilitate Peptidele sunt solubile n ap, chiar i cele care conin aminoacizi greu solubili. Oligopeptidele formeaz soluii, iar polipeptidele dispersii coloidale. In etanol absolut peptidele sunt insolubile, iar n soluii acide sau bazice formeaz sruri solubile asemntor aminoacizilor. c) Reacii de recunoatere * Reacia biuretului Aceast reacie este specific legturii amidice.
45

Peptidele cu mai mult de trei resturi de aminoacizi dau o culoare albastruviolet la tratare cu soluie alcalin de sulfat de cupru. Se formeaz un complex specific asemntor biuretului (care d ns o coloraie roie n aceleai condiii): H2NCONH2 + HN=C=O H CO N HN CO N H rou-nchis Cu proteinele sulfatul de cupru formeaz un complex asemntor: CO R CH N Cu 2_ + 2K H2NCONHCONH2 biuret Cu H N OC N OC H 2 NH

_ + 2K

biuret CuSO4 KOH

CH R N CO N CH R

CO N R CH

CO CH R

albastru-violet * Reacia Pauli Este specific numai pentru tirozin: Acidul sulfanilic diazotat, n mediu alcalin, d cu peptidele care conin tirozin o coloraie roie datorit colorantului azoic care se formeaz prin cuplare. * Reacia xantoproteic Proteinele i peptidele dau o culoare galben la tratare cu acid azotic concentrat la rece sau la cald. La adugare de baz se intensific culoarea datorit formrii de fenoxizi substituii cu grupe nitro.
46

* Reacia Erlich pentru triptofan restul indolic d o coloraie albastrviolet la tratare cu p-dimetilaminobenzaldehid. * Reacia Sakaguki pentru arginin la tratarea proteinelor cu hipoclorit de sodiu i -naftol se obine o coloraie roie. * Prezena cisteinei i cistinei se verific prin fierberea proteinei cu acetat de plumb n soluie alcalin, cnd se formeaz sulfur de plumb de culoare neagr. d) Activitatea optic Oligopeptidele prezint o activitate optic aditiv a activitii optice a aminoacizilor componeni. Dintr-o protein se pot obine prin hidroliz blnd oligopeptide optic active. e) Proprieti acido-bazice Peptidele sunt separate dintr-o soluie apoas neutr ca ioni dipolari la fel ca aminoacizii. Comportarea acido-bazic a peptidelor este determinat de prezena gruprilor -amino N-terminale libere, a gruprilor -carboxilice terminale libere i a grupelor ionizate din catenele laterale R. n lanurile polipeptidice lungi numrul gruprilor ionizate depete pe cel al gruprilor ionizate terminale. n peptide pKa-ul grupelor -carboxilice crete, iar pKa-ul grupelor amino N-terminale scade n raport cu valorile din aminoacizii liberi (vezi i Tabelul 3.1): Tabelul 3.2 : Valori comparative ale pK i pI pentru aminoacizi i peptide Aminoacidul/ Peptida glicina glicil-glicina glicil-glicil-glicina alanina alanil-alanil-alanil-alanina alanil-alanil-lizil-alanina glicil-asparagic pKa1 -COOH 2,34 3,06 3,26 2,34 3,42 3,58 2,81
47

pKa2 -NH3+ 9,6 8,13 7,91 9,69 7,94 8,01 8,60

pKa3 (cat. R) 10,58 4,45

pI 5,97 5,59 5,58 6,02 5,68 9,3 3,6

Curbele de titrare acido-bazice ale peptidelor sunt asemntoare cu ale amino-acizilor. Punctul izoelectric al peptidelor poate fi calculat din valorile pK. Speciile ionice ale peptidelor sunt asemntoare cu ale aminoacizilor: Ala-Gly + H3NCHCONHCH2COOH Cation / pH ~ 1 CH3 anion / pH ~ 11 H2NCHCONHCH2COO CH3 Amfion / pH ~ 6 _ + H3NCHCONHCH2COO CH3 _

3.2.4 Peptide din proteine i peptide neproteice a) Prin hidroliza acid sau enzimatic a proteinelor se obin, dup separri laborioase, peptide. Astfel, din fibroina mtsii naturale s-au obinut: Gly-Ala; Gly-Ser; Ala-Gly, iar din elastin: Gly-Leu i Ala-Leu. b) Exemple de peptide neproteice: - Glutationul ( -Glu-Cys-Gly) a fost izolat din drojdie: _ OOCCHCH2CH2CONHCHCONHCH2COOH NH CH2SH + 3 - Acidul oftalmic ( -Glu- -aminobutiril-Gly) a fost izolat din cristalinul ochiului de viel: _ OOCCHCH2CH2CONHCHCONHCH2COOH NH3 CH2CH3 + - Acidul noroftalmic ( -Glu-Ala-Gly) a fost izolat tot din cristalinul ochiului de viel: _ OOCCHCH2CH2CONHCHCONHCH2COOH NH3 CH2CH3 +
48

- Carnosina ( -Ala-His) a fost obinut din muchi (vezi formula la pag. 44). In unele peptide neproteice se gsesc i D- -aminoacizi. Astfel n tirocidina A, izolat din bacterii, care are aciune antibiotic, se afl D-fenilalanin: Orn Leu (D)Phe Pro Phe Val Tyr Gln Asn (D)Phe

Variaiile structurale ale peptidelor au rolul de a le proteja mpotriva aciunii proteazelor, care atac specific numai legturile peptidice n care sunt implicai L-aminoacizi. 3.2.5 Identificarea chimic a aminoacidului N-terminal dintr-un lan peptidic a) Metoda Sanger(1953) Aminoacizii N-terminali reacioneaz cu 2,4-dinitro-fluorobenzen (DNFB) i formeaz compui galbeni, separabili prin hidroliz acid cu soluie HCl 6N: R2 O2N NO2 R1 R2 O2N NO2 O2N NO2 R1 R3 R3
+

R4 R3

F + H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCO..

HF

H O/HCl NHCHCONHCHCONHCHCONHCHCO.. 2 R4

R4

+ + NHCHCOOH + H3NCHCOOH + H3NCHCOOH + H3NCHCOOH R2 R1

49

b) Metoda clorurii de dansil (clorura de 1-dimetilaminonaftalin-5-sulfonil) Reactivul folosit este clorura de dansil, iar aceast metod este de 100 de ori mai sensibil dect metoda Sanger. Compusul dintre clorura de dansil i aminoacidul N-terminal se separ prin hidroliz acid i prezint fluorescen galben. El poate fi separat prin cromatografie, iar analiza structural poate oferi date despre natura catenei laterale a aminoacidului N-terminal: N(CH3)2 R2 R1 N(CH3)2 R2 SO2 R3

R4

SO2Cl + H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCO..

_ HCl

R4

NHCHCONHCHCONHCHCONHCHCO.. R3 R1

H2O/HCl

N(CH3)2 R4 R3 + + + NHCHCOOH + H3NCHCOOH + H3NCHCOOH + H3NCHCOOH R1 compus galben fluorescent R2

SO2

50

c) Metoda Edman Reactivul folosit n aceast metod este fenilizotiocianatul, care reacioneaz cu peptida la pH alcalin (pH = 9): R2 R4 pH = 9 N=C=S + H2NCHCONHCHCONHCHCONHCHCO.. R1 R3

NH- C = S

R4 .. HNCH C NHCHCONHCHCONHCHCO.. R1 O R3 NH- C HN

+

R2

CF3COOH

C O CH +

R2
+

R4 R3

NH3CHCONHCHCONHCHCO..

feniltiazolinona R1
+

H sol. apoas a

N OC

C NH CH

R1 feniltiohidantoina Metoda Edman are avantajul c poate separa numai N-aminoacidul, iar restul catenei peptidice rmne neschimbat. Automatizarea acestei metode conduce la rezultate foarte bune, randamentul de identificare fiind de 100% pentru o peptid cu 30-40 resturi de aminoacizi.

51

3.2.6 Identificarea chimic a aminoacidului C-terminal dintr-un lan peptidic a) Hidrazinoliza Peptidele reacioneaz cu hidrazina n mediu acid cu obinerea hidrazidelor corespunztoare tuturor aminoacizilor, cu excepia aminoacidului Cterminal: Rn-1 + H+ H3NCHCO....NHCHCONHCHCOOH +NH2NH2 R1 Rn

+ + + H3NCHCONHNH2 + .... H3NCHCONHNH2+ H3NCHCOOH R1

Rn-1

Rn

aminoacid C-terminal b) Reducerea cu LiBH4 a esterului metilic a aminoacidului C-terminal La nclzirea peptidei cu metanol, n cataliz acid, se obine esterul metilic al aminoacidului C-terminal, care prin reducere cu hidrur de litiu i bor se transform n grupare hidroxilic. Dup hidroliza peptidei cu soluie de acid clorhidric 6N, se separ aminoalcoolul corespunztor aminoacidului C-terminal: Rn-1 + CH3OH / H H3NCHCO....NHCHCONHCHCOOH
+

R1

Rn

52

H3NCHCO....NHCHCONHCHCOOCH3 R1 LiBH4 Rn

Rn-1

Rn-1 H2NCHCO....NHCHCONHCHCH2OH R1 HCl 6N

+

Rn

aminoacizi + H3NCHCH2OH Rn aminoalcool 3.2.7 Identificarea metioninei dintr-un lan polipeptidic

Bromcianul reacioneaz cu o peptid care are n componen metionin: R R .. NHCHCONHCHCO... + BrCN C ... HNCHCONHCH CH2
:O ..

CH2 S CH3 R ... HNCHCONHCH CH2 C :O ..

+

R .. NHCHCONHCHCO... _ NCSCH3 R metiltiocianat

_

CH2 S CH3 Br CN

53

Prin eliminarea metiltiocianatului, urmat de hidroliz, se formeaz peptidil-homoseril-lactona (peptidil-HSL): R ... HNCHCONHCH CH2 CH2 R ...HNCHCONHCH CH2 peptidil-HSL CH2 R C O + H3NCHCONHCHCO... O R
+

R C O H O NHCHCONHCHCO... 2 _ _ HBr Br R
+

Deoarece n proteine metionina nu are o abunden prea mare, aceast metod conduce la obinerea unui numr mic de oligopeptide, a cror structur poate fi identificat uor. 3.2.8 Reactivi chimici utilizai pentru izolarea catenelor peptidice Pentru studiul structurii unei proteine, care conine puni de sulf, formate ntre resturi de cistein aflate n catene polipeptidice diferite, este necesar separarea lanurilor polipeptidice. Ruperea punilor de sulf se poate face utiliznd doi reactivi: a) Acidul performic Prin tratarea unei proteine cu acid performic se oxideaz punile de sulf cu formare de resturi sulfonice (aceast metod conduce ns la distrugerea triptofanului): R R ...NHCHCONHCHCO... ...NHCHCONHCHCO... CH2 CH2 _ HCOOOH S SO3 + HCOOH _ S SO3 R CH2 R CH ...NHCHCONHCHCO...
2

...NHCHCONHCHCO...
54

b) -Mercaptoetanol Pentru a evita distrugerea triptofanului se folosete un alt reactiv care reduce punile de sulf cu formare de grupe mercapto(SH): R ...NHCHCONHCHCO... CH2 S S CH2
+ 2 HSCH2CH2OH

R ...NHCHCONHCHCO... CH2 SH SH CH2 R

+

SCH2CH2OH SCH2CH2OH

...NHCHCONHCHCO...

...NHCHCONHCHCO...

Pentru a mpiedica refacerea punilor de sulf, grupele SH se alchileaz cu iodoacetat: _ ...NHCHCONHCHCO... + ICH2COO CH2 SH R R - HI ...NHCHCONHCHCO... CH2 S _ CH2COO S-carboximetilcistein a

3.2.9 Identificarea enzimatic a aminoacizilor Aminopeptidazele sunt enzime care hidrolizeaz legturile peptidice dintr-o peptid. Aciunea acestor enzime este specific: aminopeptidazele (exopeptidaze) hidrolizeaz exclusiv legtura peptidic la care particip aminoacidul N-terminal; carboxipeptidazele (exopeptidaze) hidrolizeaz numai legtura peptidic la care particip aminoacidul C-terminal; endopeptidazele hidrolizeaz legturile peptidice din interiorul catenei.
55

Enzimele proteolitice hidrolizeaz preferenial anumite legturi peptidice la care particip anumii aminoacizi: a) Pepsina este secretat de mucoasa stomacului sub form de pepsinogen. Ea acioneaz la pH puternic acid ( pH ~ 1-2) i hidrolizeaz legtura peptidic a fenilalaninei, tirozinei i triptofanului la care aceti aminoacizi particip prin gruparea amino: pepsina R ...NHCHCONHCHC R O NHCHCO.... Rx

unde : Rx = Phe, Tyr, Trp Pentru a putea hidroliza aceste legturi, pepsina are nevoie de prezena unei grupe COOH sau SH n catena lateral a unui aminoacid vecin, n timp ce o grup amino liber vecin o inhib. b) Tripsina este secretat de pancreas sub form de tripsinogen, acioneaz n mediu bazic i hidrolizeaz legtura peptidic a lizinei i argininei la care particip cu grupa carboxil, fiind inhibat de grupe COOH i amino vecine: tripsina R ...NHCHCONHCHC Rx O unde : Rx = Lys, Arg c) Chimotripsina este secretat de pancreas sub form de chimotripsinogen, acioneaz n mediu bazic i hidrolizeaz legtura peptidic a fenilalaninei, tirozinei, leucinei, metioninei, asparaginei i a acidului glutamic la care particip cu grupa carboxil, fiind inhibat de grupe COOH vecine: chimo tripsina R ...NHCHCONHCHC Rx O NHCHCO.... R NHCHCO.... R

unde: R x = Phe, Tyr, Leu, Met, Asn, Glu

56

3.2.10 Separarea peptidelor Peptidele formate la hidroliza parial a proteinelor se separ mai greu dect amestecurile de aminoacizi. Metodele de separare cele mai eficiente sunt metodele cromatografice i electroforetice. Cromatografia bidimensional Amestecul de separat se depune n colul unei hrtii cromatografice. Se introduce ntr-o cuv de developare n care se gsete un amestec de eluare potrivit. Dup ce eluentul a ajuns la linia de fini , se scoate hrtia cromatografic i se continu developarea aeznd-o n poziie orizontal (avansarea eluentului va avea loc pe direcia perpendicular fa de prima developare). La sfritul developrii se obine o hart unde se gsesc separate peptidele componente (dac amestecul de eluare a fost bine ales!):

b) Gel - filtrarea Este o metod cromatografic prin care se separ peptidele dup masa lor molecular. Faza staionar este un hidrat de carbon (cu denumirea comercial Sephadex) care are diverse granulaii. Peptidele cu mase moleculare mari sunt antrenate spre ieirea din coloan, iar peptidele cu mase moleculare mici sunt reinute n reeaua Sephadexului i avanseaz mai greu spre ieirea din coloan. Cromatografia de afinitate Este o metod de separare care se bazeaz pe capacitatea de legare specific de ctre o protein a unei molecule numit ligand.
57

Metoda presupune imobilizarea (de regul printr-o legtur covalent) a ligandului specific pe un suport inert. Prin trecerea amestecului de proteine peste suportul afin astfel obinut, se va reine numai proteina care leag specific ligandul imobilizat. Eluarea se face prin anihilarea interaciei ligand protein prin modificarea pH-ului, a triei ionice a fazei mobile sau prin introducerea n faza mobil a unui partener competitive care se leag de suportul afin n mod preferenial elibernd astfel proteina reinut. O astfel de metod poate fi utilizat pentru separarea unor enzime care utilizeaz un cofactor sau o coenzim n procesul de transformare al unui substrat. n multe cazuri separarea unei astfel de enzime dintr-un amestec de proteine se face cromatografic, faza staionar folosit are imobilizat cofactorul capabil s lege enzima respectiv. Celelalte proteine trec prin coloan, iar enzima reinut va fi desorbit cu un eluent adecvat ( soluie tampon ). Electroforeza Metodele electroforetice se bazeaz pe proprietatea peptidelor, aflate ntrun cmp electric, de a migra spre electrozi n funcie de sarcina electric global. Separarea peptidelor este uoar la punctul lor izoelectric cnd solubilitatea este minim. n prezent se cunosc urmtoarele tehnici: - gel electroforeza: peptidele aflate ntr-un cmp electric vor migra ntrun gel de agaroz sau poliacrilamid n funcie de masa lor molecular (n condiii denaturante) sau de masa molecular i sarcina net (n condiii native). - electrofocusarea ( izoelectric) : peptidele dintr-o soluie, aflate ntr-un cmp electric, se pot separa ntr-un gel cu gradient de pH n conformitate cu punctul lor izoelectric. Ultracentrifugarea Peptidele se pot separa prin centrifugare n funcie de masa lor molecular. Moleculele peptidelor (sau proteinelor) care sunt mai dense dect apa, vor migra ncet ctre captul tubului n timpul centrifugrii. Viteza de sedimentare se poate monitoriza prin metode optice. 3.2.11 Sinteza chimic a peptidelor Sinteza n laborator a peptidelor necesit blocarea grupelor funcionale care nu particip la reacie ( o grupare carboxil i o grupare amino aparinnd celor doi aminoacizi care vor forma o legtur peptidic):
58

Pa HNCHCOOH R1

H2NCHCO Pc R2

-H2O

Pa HNCHCONHCHCO R1 R2

Pc

unde Pa, Pc sunt grupe protectoare Ca reactivi de protejare pentru grupa amino se folosesc cloroformiatul de benzil (Cbz) i t-butoxicarbonilazida (BOC). a) Cloroformiatul de benzil sebine din alcool benzilic i fosgen:

C6H5CH2OH + COCl2 C6H5CH2O C Cl + H2NCHCOOH O R

C6H5CH2O C Cl O C6H5CH2O C HNCHCOOH O R

Eliminarea grupei protectoare se face prin metode blnde: fie prin hidrogenare catalitic, fie prin tratare cu acid bromhidric n acid acetic :
C6H5CH2O C HNCHCOOH O R H2 / cat C6H5CH3+ [HOOCNHCHCOOH] + R derivat de acid carbamic CO2 + H2NCHCOOH R HBr / CH3 COOH C6H5CH2O C NHCHCOOH +OH R + C6H5CH2+ [HOOCNHCHCOOH] R derivat de acid carbamic CO2+ H2NCHCOOH R
59

b) t-Butoxicarbonilazida (BOC) se obine din cloroformiatul de t-butil i azida de sodiu: (CH3)3C O C N3 + NaCl (CH3)3C O C Cl + NaN3 O O t-Butoxicarbonilazida reacioneaz cu un aminoacid la grupa amino: (CH3)3C O C N3 + H2NCHCOOH _ (CH3)3C O C NHCHCOOH HN3 R O O R Eliminarea grupei t-butoxicarbonil se face n mediu acid ( HF / CH 3COOH sau HF / CH2Cl2):

(CH3)3C O C NHCHCOOH O R

H+

(CH3)3C O C NHCHCOOH +OH R

(CH3)3C - H+ (CH3)2C = CH2

[HOOCNHCHCOOH] R CO2 + H2NCHCOOH R

Gruparea carboxil se poate proteja prin esterificare cu metanol: _ CH3OH / H+ H3NCHCOO

+

+ H3NCHCOOCH3 R

Condensarea grupei carboxil a unui aminoacid N-protejat cu grupa amino a unui aminoacid C-protejat are loc n prezena diciclohexilcarbodiimidei (DCC) care activeaz gruparea carboxilic:
60

Pa HNCHCOOH R1

+C6H11N=C=NC6H11

C6H11N = C NHC6H11 Pa HNCHC O R O

1

C6H11N = C NHC6H11 Pa HNCHC O R O

1

H2NCHCO Pc R2

C6H11N = C _ O Pa HNCH C O
+

NHC6H11

R1 H2NCHCO Pc R2

C6H11NHCONHC6H11 Pa

HNCHCONHCHCO Pc R1

R2 Pentru lungirea lanului peptidei se poate debloca una din grupe, se condenseaz cu al treilea aminoacid i se repet aceste dou operaii pn la ataarea tuturor aminoacizilor, apoi se deprotejeaz grupele terminale. Intre anii 1959 1963 B.R. Merrifield i colectivul su de cercetare au pus n aplicare o metod de sintez n faz solid care ulterior a fost automatizat. Cu ajutorul acestei metode s-au obinut peptide active fiziologic cu randament de ~99.5% ntr-un timp scurt. Astfel, pentru sinteza ribonucleazei, format din 124 de aminoacizi, au fost necesare 369 de reacii i 11391 etape de lucru! Metoda Merrifield folosete polistiren reticulat cu divinilbenzen i clorometilat pentru blocarea grupei carboxil a primului aminoacid: SnCl4 ...CH2CH (CH2CH) CH2CH.... + ClCH2OCH2Cl

...CH2CH (CH2CH) CH2CH....

CH2Cl

CH2Cl
61

Polimerul clorometilat se trateaz cu sarea de sodiu a primului aminoacid:

_

Polimer CH2Cl +

OOCCHNH2 R

Polimer

CH2OCOCHNH2 R

Apoi se filtreaz polimerul de care a fost legat astfel primul aminoacid i n prezen de DCC se face condensarea cu al doilea aminoacid care are blocat gruparea amino: Polimer CH2OCOCHNH2 + HOOCCHNH Pa DCC R1 Polimer R2

CH2OCOCHNHCOCHNH Pa + C6H11NHCONHC6H11 R1 R2

Prin deblocarea grupei amino cu acid trifluoroacetic, n clorur de metilen, se creeaz condiia necesar pentru ataarea unui alt aminoacid cu grupa amino protejat. Dup ce a fost sintetizat, peptida se desprinde de pe polimer prin tratare cu acid fluorhidric anhidru, care nu atac legturile peptidice. In anul 1984 Merrifield a fost distins cu premiul Nobel pentru aceast metod de sintez a peptidelor, care a permis obinerea multor proteine cu aciune fiziologic, printr-un proces automatizat,ntr-un timp foarte scurt.

62