I

Laborator 3 Farmacie

II

semnifica{ia clinici a compugilor azota{i neproteici: uree, creatinini, NH3 in s6nge gi urini

in lichidele biologice se gesesc Ai o serie de compu$i azottqi neproteici, rc tatidin degradarea

proteinelor in procesele metabolice. Catabolilii proteici sunt reprezentati de amoniac, uree, creatind
gi creatinind. Determinarea concentraliei acestora este importanti pentru stabilirea diagnosticului
mor afecliuni insolite de un catabolism intens al proteinelor, de o sintezd deficitarh a acestor
compugi ca rczultr.t al unei funcrionari necorespunzaioare a organelor implicate in sinleza acesrora
sau de o eliminare defectuoasd din organism.
Ureea. Metode de dozare a ureei
Ureea este principalul produs al catabolismului proteic, reprezent6nd circa 15% dincompuqii
azotali neproteici ce se excretd prin urind.
Biosinteza sa este o consecinld fiziologicd pentru conhacararea efectului toxic al amoniacului,
incorporat astfel intr-o substanfd netoxicd, solubilh in apd, forma de eliminare, in special pe cale
rcnald., a azotl}ui aminic excedentar.
Biosinteza are loc in ficat prin procesul de ureogenezd, amoniacul provenind in cea mai mare
parte din acidul glutamic dezaminat oxidativ sub acliunea glutamat dehidrogenazei.
. _Formarea ureei este dependentd intr-o mare mdsurd de: dietd, acliLrnia normald a enzimelor
implicate in ureogenezd gi integritatea firncliilor hepatice.
Peste 90 Yo din uree se indepdrteazi prin rinichi la nivelul glomerulului qi, in mod normal, 40
70 %o din wee depdqegte pasiv tubii renali.
Eliminare ureei este dependenti, in special, de buna funclionare a rinichilor, astfel incdt unele
^
afecfiuni,
ca cele glomerulare, tubulare sau interstiliale renale, vor induce tulburdri de filtrare a
ureei gi, in consecinfd, vor determina cre$terea concentaliei sale in s6nge.
Deoarece determinarea ure ei s-a realizat la inceput pe un filtrat proteic deproteinizat al s6ngelui
total 9i se mesua cantitate a de azot, analiza este numitd deseori BUN (blood urea nihogen). Pentru
a converti concenftalia azotului ureic in concentralie de uree, se inmullegte valoarei oblinutd la
determinare cu 2.14.
Dozarea ureei s-a realizat prin mai multe metode:
a) metoda azotometricd (Kowarsky) (mai pulin exactd);
b) metoda colorimetricd cu diacetilmonoxima (Kitamwa-Jukv):
c) mel.ode enzimalice.
in prezent, metodele cele mai folosite sunt cele enzimatioe.

Metoda colorimetrici cu diacetilmonoxima

Principiu: Ureea condenseazd cu diacetilul formAnd un compus colorat, diazina. Se utilizeaz[
diacetilmonoxima care, in mediu acid, genercazd diacetilul instabil, conform reactiei:

ilc-ff,-crl + qo
HO-NO

qc+o
I

H3C{=O

HN\^L ^
=J
Hl(
.

/.'"t1"2"

4c-fi

+ HO_NH'
fr_Crr3

oo

11C{=N..- -1----J' r |

Hn

sn1=N/
'-:']--" '-

Metoda enzimatici Berthelot

Principiu: Ureea este hidrolizatd. sub acliunea ureazei, amoniacul format fiind dozat orin reactia
Benhelot- prin care ionul amoniu reactioneazS. cu hipocloritui de sodiu gi fenolul. in mediu alcalin
9i
in_ prezenla nitroprusiatului de sodiu ca si catalizator, rezultAnd indofenolul,
substanld coloratd in
albastru. Intensitatea culorii este indirect propo4ionald cu concentratia meei din propa analizata.

wa/A

2r\nr

u- - H^U

2-

2NHo

CO,

OH
NH4

+ 5Naocl

,/\

* 21 ll
\-,/

uo

"y) (lo",*o

,no

\-'\N-^\-,,,

Metoda enzimatici cinetici

Principiu: Uresa este hidrolizatd sub acliunea ureazei formdnd amoniac Ai dioxid de carbon.
Amoniacul rezultat va fi transformat in prezenla unei oxidoreductaze" glutamat dehidrogenaza,
enzimd NAD - dependenti.

GIDH
2 NH3 + 2 NADH,Ht + 2 o-cetoglutarat
2 L-glutamat + 2NAD*+ 2H2O
Se misoard scdderea absorbtiei la 340 nm care este proporlionald cu cantitatea de uree din proba

-----+

analizatd.

Reactivi:
1. Reactiv R1:

NADH,H* (320 pmol/l)

2- Reactiv R2: tampon Tris (100 mmol/l), pH 7,6, ct-cetoghrtarar (9 mmol/l), ureaza (6500 u/1),
glutamat dehidrogenaza (1 100 U/1), NADH, Ff (1,5 mmoyl,) , azida de sodiu 9,5 gil;
3. Standard de uree:48,2 mg/l00 ml
Prepararea reactilrrlui de lucnr: se amestece 3 pirfi reactiv R1 cu 1 parte reactiv R2.

Mod de lucru:
Se pipeteza conform schemei:
Reactivi
Probi
rlasma
l0 ul

Standard

Standard de uree

10 ul

Reactiv de lucru
(^l
Linl
Se agitd
gi
se
citegte
qb
Ers)
dup-4-lQ sec,r"de de ino
g{1$,i.t?:ilffHgbsorbtia 1E1pqi
gl4lpol se iitegte
Hiir{ git{ioi
(Erp si
citeste din nou absorblia
absorbtia la 340 nm (Ezp
$i Ers).

ll#!
fL,5

t = Cafculr mguree/100ml:(Erp-E2p)/(Er5-E2s)x48,2.
Testul este liniar pdnd la 400 mg/l00 ml

se incubeazd

-Ezs). =

:;,
15

'

lli

1
c1993

Ll- b
I

::

t-/
^

inc[
'-

-.l-+1 '

i23 = s,36:>

Valoare normqld: uree sericd (adul1i) 15 40 mg /100 ml (7-18 mgldl - BltN);

uree urinard
23 - 43 el24h (12-20 gi24h - BUD.
Nivelul ureei serice prezint[ v ariayii fiziologice dependente <ie o serie de factori:
- vArstd - nivelul ureei sanguine creqte odat6 cu vdrsta;
- sex - se int6lnesc concentralii mai mari la bdrbaJi;
- dietd - o masd bogatd in proteine creqte nivelul ureeei;
- sarcinA - poate diminua nivelul ureei serice.
VariaYii patologice. Creqterea nivelului ureei peste valoarea de 40 mg/i00 ml a primit denumirea
improprie d.e azotemie.
originea lo\ azotemiile pot fi renale sau extrarenale (prerenale Si postrenale). Nivelul
-foarte Dupd
crescut al ureei serice ce insoleqte insuficienla renald se nume$te uremie iau sindrom uremic.
Modifrcdrile prerenale apar in afeclirurile cu un flux renal redus: insuficienld cardiacd, stdri de
$oc, hemoragii, stdri de deshidratare. Alte azotemii extrarenale sunt determinate de incapacitatea
rinichiului de a elimina un exces de uree rezultat printr-un proces de ureogenezi accentuat (dietd
excesiv proteicd, febr5, afecliuni severe, stres).
Datoritd rolului principal in eliminarea ureei, sc[derea capacit5lii funclionale renale determind
o cregtere a concentraliei ureei plasmatice.

Azotemii renale
Insuficien,ti. renald acuti gi
cronicl
Glomerulonefi:iti acutd gi

Azotemii extrarenale
InsuficienJi cardiaci
Boli infeclioase
Diaree, vdrsdturi
Boala Addison
Diabet zaharat

cronicA
CalculozS. renald
Necrozd tubulari

Nivel scizut al ureei

Aport proteic scdzut
Afecliuni hepatice severe
Sarcind normald

Hemoragii

fi

Azotemii extrarenale pot

prerenale (insuf cardiacd, stdri de goc, hemoragii, deshidratare,
cre$terea.catabolismului proteic dietb, febri, stres) qi postrenale (obstrucfia ciilor urinare tumori
ale vezicii urinare, calculi urinari. tumori ale prostatei, infeclii severe)
Modificarea nivelrilui ureei
ce este inso
Hiperazoturii
Stiri cu un catabolism proteic intens:

de alterdri ale ureei urinare.

Hipoazoturii
Afecliuni hepatice
Afecliuni renale
Administrare de hormoni ce cresc sinteza
proteice
Acidoze

stiri febrile. afecliuni endocrine

(hipertirodism, diabet zaharat, diabet

azoturic), adm in istrare de liroxind
lntoxical.ii cu plumb qi mercur

Nivelul foarte crescut al ureei serice ce insole$te insuficienJa renald se mrme$te uremie satt
sindrom uremic. Sindromul uremic este manifestarea clinicd terminald a insufrcienlei renale,
ren'ltat in urma incapacifilii rinichilor de a-si indeplini adecvat funcliile excretorii, reglatorii qi
endocrine. Simptomele clasice ale uremiei includ oboseald qi sldbiciune musculard, pierderea
apetitului, grealA, vome, tremor, acidozd metabolicS, iar in cazul in care nu se intervine prin dializa

tansplant renal evolueazd spre comA $i moarte.

In concluzie, valoarea semiologicd a nivelului ureei este datd de faptul cd acumularea sa in
plasmd este un indice de insuficienld renald, deqi existi numerogi factori extrarenali care-i
influenleazd sinteza gi concentratia sanguind.
Din aceste motive, de o mai mare utilitate clinicd este determinarea rapoftului cantitativ
uree/creatinind (mgll00 ml ser), care pentru un individ normal este de 12-16:
- un raport < 12 denotd o alimentalie proteici deficitard, o afectiune hepaticd cronicd. sinteza
sau

redusd de uree;
un raport > 16 denotd o afectiune renald.

Creatina qi creatinina. Metode de d,ozare a creatininei

Creatina (acid metilguanidoacetic) este un compus sintetizat in ficat din argininA, glicocol gi
.
metionine, care, uiterior sintezei este transportat, prin sange, in mugchi qi oeier. La aiest nivel,
creatina se transformd in fosfocreatind, una dintre cele mai importante substanle energogene,
necesard procesului de contracfie musculari qi de obtinere a energiei la nivelul creierului.
-.ls1
l]KNclcocxr*tr

Gl

-NH-PO}L

-+ FNE{(.
- - NatsoH
Gl

-ADp

crelnna
fcfiqeatina
O micd fracliune din fosfocreatinA, constanta pentru aceeagi masd musculard, pierde grupa
^ ^ qi formeazd creatina liberS. Creatina, fiind
fosfat
deosibit de instabila la pH-uri bazice iau acide, se
transformd in anhidrida sa, creatinina, ca"re trece in sdnge apoi este eliminatd pe cale renald. Din
$i
acest motiv, determinarea cantitativl a creatinei nu are valoare clinicd, ci se determina creatinina.
-,ML

'**c+mr
t'-rl(]
GL

--'-

-,}trIq{

\-&i

C}I,

Metoda cinetici colorimetrici

Principiu: Creatinina din ser sau plasm6. deproteinizatd reaclioneazd cu acidul picric, in mediu
alcalin, conform reactiei Jaff6, formdnd picrali de creatinind de culoare portocalie.

I9(_)*, .
ilo,6"

^..il[
ct

_l
[P' o
I C>"" ni*{ffj_"
*,.__l
L []

Reactivi:
1. Reactiv Rl : hidroxid de sodiu (400 mmol/l); fosfat disodic (25 mmol/l).
2. Reactiv R2: acid picric (17,5 mmoVl).
3. Standard de creatinini 2 ms/100 ml.
Pentru prepararea reactilr:lui de lu-cru se amestecd I parte de reactiv R1 cu o parte reactiv R2.
Mod de lucru: Se foloseqte ser nehemolizat, deoarece hemoglobina interferi in reaclia Jaffd. Urina
proaspdti se dilueazd 1i50 cu apd distilatb.
In doud eprubete se pipeteazd conform schemei:
Reactivi
Reactiv de lucru

Probi

Plasmd

100 ul

Standard

1ml

Standard
1ml
100

Ea

o=

r,',

2,32,? 81, =o1\o!

' c,1)i ;rr= o,311

ul

Se agitd qi se citegte ertincliala 492 (480-520) nm dupd 30 secunde (E1p

9i 815) qi 2 minute (E2p qi
E2s) de incubare la3lac.

l,;{- = Calcul: mg creatinin6/100

ml plasmd = lEap - Eap.l/1EX5 - E45)x2

Pentru cd urina este diluata 1i50, iar.eruiiutrli" rabofteazdla urina de 24 ore. se va calcula astf'el:
j:sfgl-!tle4{:(Ep - Ev)/(E' - Ev) x I o0

lL!j99!! n9!m!!!)
- creatinind sericd

b6rba{i 0,7 - 1,2 mg/100m1; femei 0,6 - 1,1 mg/100 ml

- creatinini urinard 1-1,8{24h sau birbali: l4-26mgkg/24h. femei: 1 1-20 mglkg/24h

Valoare semiologicd. Creatinna formatd este direct proporlionalS cu masa musculard, reprezentdnd
unul din cei mai obiectivi indici ai acesteia. La copii, nivelul creatininei este mai crescut decdt la
adulli. La bdrbali, concentralia sericd gi eliminarea urinarh sunt superioare celor de la femei, datorid
masei musculare mai mari.
Deoarece sinteza qi eliminarea din organism a creatininei sunt constante, fac din determinarea
sa o analizd utild in aprecierea clearance-tlui renal, metodd prin care se poate evalua viteza de
filtrare glomerulard gi se poate stabili capacitatea functionalb a rinichilor.
Fafd de uree, creatinina este un parametru mult mai exact pentru m5.surarea ratei de filtrare
glomerulard deoarece este mai pulin influenlat[ de integritatea lirncliei hepatice sau de aportul
proteic.
Va.rialii patologice Cregterea nivelului creatininei in sdnge qi eliminarea crescutd a acestui compus
prin urind implica urmatoarele mecanisme:
- cre$terea producliei de creatind;
- distrugereacelulelormusculare;
- o disproporlie intre produclia de creatind gi masa musculard diminuati, care nu mai poate capta

creatina produsd;
disfunctie in procesul de eliminare.

Hipercreati ninurii
Hipercreatininemii
AfecJiuni renale: insuficienli renalS. neffite -feiliuni musculare: atrofi e musculara, distrofi

musculard, miastenia gmvis

cronlce

Afecliuni musculare: distrofii

musculare,

atrofie musculara
Afectiuni endocrine: acromegalie, diabet
Hipocreatininemii
Sciderea masei musculare
Carente proteice in dieti
Afectiuni hepatice

in

cazul unor afec{iuni ca: tifos,

pneumonie, acromegalie, stiri febrile
Secundar

Hipocreatininurii
Insuficienld renali cronici
Caren{e proteice in dieti

Rata de filtrare glomerulard (RFG) este un parametru ce ofer6 informalii despre capacltatea
fimclionald arinichil&, considerandu-se a fi un marker sensibil $i specific al modifrcdrilor funcliei
renie globale. o scddere a RFG precede insuficienla renali in toate formele de boall renala
plogresivd.
Determinarea ppG se bazeazd frecvent pe stabilirea clearance-tltti renal pentru o ar.umltd
substantA ce trebuie sd indeplineascd unele condilii:
concentralia plasmaticd sa fie stabild;
sd se filtreze liber la nivelul glomerulilor;
sA nu fie secretatS, reabsorbitd, sintetizatd sau metabolizatd la nivel renal'
Clearqnce-ul renal al unei substanlei reprezintd volumul de plasmS din care o anumita
substanF este complet epuratd prin filtrare glomerulard pe unitatea de timp, fiind o mdsur[ a rater

de

lllrresloucndara
:
p*lIiRFG).
T

C*

0,1*

x V) I

unde C* = clearance-ul substan{ei (ml/min)

V = volumul winar ml/min
U : concentra{ia urinard a substanlei (mg/ml)
P - concentralia plasmatici a substanlei (mgiml)

Dimensiunea rinichilor gi RFG sunt aproximativ propo4ionale cu marimea corpului- Pentru o

persoanA sdndtoasd RFG are o valoare medie de 140 ml/min, insd, deoarece variazd mult in funcjie
de suprafaia corporald, valoarea oblinutd se corecteazd raportAnd-o la o suprafala corporald medie
de 1,73rl, deci RFG se exprimd in mVminll,73.
Inulina este o substanld exogend ce indeplinegte toate criteriile mentionate qi a fost muit timp
considerati ca fiind cea mai acr.riati modalitate de a aprecia RFG, dar este mai costisitoare 9i mai
greu de utilizat in mod uzual. De aceea, este preferat1 folosirea markerilor endogeni pentru
itabilirea RFG, ce necesitd doar recoltarea unor probe de sAnge qi urind in care se fac determindrile,
ce simplificd procedura pentru pacient, clinician qi laborator
creatinina este una dinhe substantele endogene uIllizatd in acest ssop. Deoarece simpla
determinare a concentraJiei plasmatice a creatininei nu se coreleazd perfect cu funcJia glomerulard
(creatininemia vaiazl frziilogic in funclie de sex, virst6, masd musculara, iar o valoare
semnificativ crescutd a creatininemiei apare atunci cAnd RFG este scdzutd ctt 50oh fa\d de normal),
ca mdsurd a RFG se determind fre cveri. clearance-ul de creatinind.
Valorile normale ale clearance-ului de creatinind sunt:
- 71-135 mVmin/l,73 pentru femei; u,"
- 78-116 mVminl1,73 pentru bdrbali.
Deoarece determinarea clearance-ului necesitd respectarea unor condilii bine stabilite, a fost
inlocuit cu formule de calcul pentru determinarea ratei de filtrare glomerulard estimatd (RFGe)'
Una dintre acestea este formula Cockcroft Gault ce line cont de vdrst6, greutate corporald qi
valoarea creatininemiei.
bdrbaJi RFG [ (140 - vArsta) x greutate Q<g] I 72x creatininemie
femei RFG = [ (140 - vdrsta) x greutate (kg)] I J2x cteatininemie x F(0,95)'