Laborator 4 Farmacie II

Semnificaţia clinică a compuşilor azotaţi neproteici: dozarea ureei în sânge şi urină

În lichidele biologice se găsesc şi o serie de compuşi azotaţi neproteici, rezultaţi din degradarea
proteinelor în procesele metabolice. Cataboliţii proteici sunt reprezentaţi de amoniac, uree, creatină
şi creatinină. Determinarea concentraţiei acestora este importantă pentru stabilirea diagnosticului
unor afecţiuni însoţite de un catabolism intens al proteinelor, de o sinteză deficitară a acestor
compuşi ca rezultat al unei funcţionări necorespunzătoare a organelor implicate în sinteza acestora
sau de o eliminare defectuoasă din organism.

Ureea. Metode de dozare a ureei

Ureea este principalul produs al catabolismului proteic, reprezentând circa 75% din compuşii
azotaţi neproteici ce se excretă prin urină.
Biosinteza sa este o consecinţă fiziologică pentru contracararea efectului toxic al amoniacului,
încorporat astfel într-o substanţă netoxică, solubilă în apă, forma de eliminare, în special pe cale
renală, a azotului aminic excedentar.
Biosinteza are loc în ficat prin procesul de ureogeneză, amoniacul provenind în cea mai mare
parte din acidul glutamic dezaminat oxidativ sub acţiunea glutamat dehidrogenazei.
Formarea ureei este dependentă într-o mare măsură de: dietă, acţiunea normală a enzimelor
implicate în ureogeneză şi integritatea funcţiilor hepatice.
Peste 90 % din uree se îndepărtează prin rinichi la nivelul glomerulului şi, în mod normal, 40 –
70 % din uree depăşeşte pasiv tubii renali.
Eliminare ureei este dependentă, în special, de buna funcţionare a rinichilor, astfel încât unele
afecţiuni, ca cele glomerulare, tubulare sau interstiţiale renale, vor induce tulburări de filtrare a
ureei şi, în consecinţă, vor determina creşterea concentraţiei sale în sânge.
Deoarece determinarea ureei s-a realizat la început pe un filtrat proteic deproteinizat al sângelui
total şi se măsura cantitatea de azot, analiza este numită deseori BUN (blood urea nitrogen). Pentru
a converti concentraţia azotului ureic în concentraţie de uree, se înmulţeşte valoarea obţinută la
determinare cu 2,14.
Dozarea ureei s-a realizat prin mai multe metode:
a) metoda azotometrică (Kowarsky) (mai puţin exactă);
b) metoda colorimetrică cu diacetilmonoxima (Kitamwa-Juky);
c) metode enzimatice.
În prezent, metodele cele mai folosite sunt cele enzimatice.
Metoda colorimetrică cu diacetilmonoxima
Principiu: Ureea condensează cu diacetilul formând un compus colorat, diazina. Se utilizează
diacetilmonoxima care, în mediu acid, generează diacetilul instabil, conform reacţiei:
H3C-C-C-CH3 + H2O H3C-C-C-CH3 + HO-NH2
HO N O OO
H3C-C=O H2N H3C-C= N
+ C=O C=O + HO
2 2
H3C-C=O H2N H3C-C= N

Metoda enzimatică Berthelot

Principiu: Ureea este hidrolizată sub acţiunea ureazei, amoniacul format fiind dozat prin reacţia
Berthelot, prin care ionul amoniu reacţionează cu hipocloritul de sodiu şi fenolul, în mediu alcalin şi
în prezenţa nitroprusiatului de sodiu ca si catalizator, rezultând indofenolul, substanţă colorată în
albastru. Intensitatea culorii este indirect proporţională cu concentraţia ureei din propa analizată.

1
 H2N ureazã + 2-
C=O + H2O 2NH3 + CO2 + H2O 2NH4 + CO3
H2N
OH
- OH
+ HO O
NH4 + 5NaOCl + 2 +5 NaCl +5 H2O
N

Metoda enzimatică cinetică

Principiu: Ureea este hidrolizată sub acţiunea ureazei formând amoniac şi dioxid de carbon.
Amoniacul rezultat va fi transformat în prezenţa unei oxidoreductaze, glutamat dehidrogenaza,
enzimă NAD - dependentă.
GlDH
+
2 NH3 + 2 NADH, H + 2 α-cetoglutarat 2 L-glutamat + 2NAD++ 2H2O
Se măsoară scăderea absorbţiei la 340 nm care este proporţională cu cantitatea de uree din proba
analizată.
Reactivi:
1. Reactiv R1: NADH,H+ (320 µmol/l)
2. Reactiv R2: tampon Tris (100 mmol/l), pH 7,6, α-cetoglutarat (9 mmol/l), ureaza (6500 U/l),
glutamat dehidrogenaza (1100 U/l), NADH, H+ (1,5 mmol/L), azida de sodiu 9,5 g/L;
3. Standard de uree: 48,2 mg/100 ml
Prepararea reactivului de lucru: se amestecă 3 părţi reactiv R1 cu 1 parte reactiv R2.
Mod de lucru:
Se pipetează conform schemei:
Reactivi Probă Standard
Plasmă 10 µl -
Standard de uree - 10 µl
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml
Se agită şi se citeşte absorbţia (E1P şi E1S) după 30 secunde de incubare la 37 oC, se incubează încă
un minut şi apoi se citeşte din nou absorbţia la 340 nm (E2P şi E2S).
Calcul: mg uree/100 ml = (E1P - E2P) / (E1S - E2S) x 48,2.
Testul este liniar până la 400 mg/100 ml
Valoare normală: uree serică (adulţi) 15 – 40 mg /100 ml (7-18 mg/dl - BUN);
uree urinară 23 - 43 g/24h (12-20 g/24h - BUN).
Nivelul ureei serice prezintă variaţii fiziologice dependente de o serie de factori:
- vârstă – nivelul ureei sanguine creşte odată cu vârsta;
- sex – se întâlnesc concentraţii mai mari la bărbaţi;
- dietă – o masă bogată în proteine creşte nivelul ureeei;
- sarcină – poate diminua nivelul ureei serice.
Variaţii patologice. Creşterea nivelului ureei peste valoarea de 40 mg/100 ml a primit denumirea
improprie de azotemie.
După originea lor, azotemiile pot fi renale sau extrarenale (prerenale şi postrenale). Nivelul
foarte crescut al ureei serice ce însoţeşte insuficienţa renală se numeşte uremie sau sindrom uremic.
Modificările prerenale apar în afecţiunile cu un flux renal redus: insuficienţă cardiacă, stări de
şoc, hemoragii, stări de deshidratare. Alte azotemii extrarenale sunt determinate de incapacitatea
rinichiului de a elimina un exces de uree rezultat printr-un proces de ureogeneză accentuat (dietă
excesiv proteică, febră, afecţiuni severe, stres).
Datorită rolului principal în eliminarea ureei, scăderea capacităţii funcţionale renale determină
o creştere a concentraţiei ureei plasmatice.

2
 Azotemii renale Azotemii extrarenale Nivel scăzut al ureei
Insuficienţă renală acută şi Insuficienţă cardiacă Aport proteic scăzut
cronică Boli infecţioase Afecţiuni hepatice severe
Glomerulonefrită acută şi Diaree, vărsături Sarcină normală
cronică Boala Addison
Calculoză renală Diabet zaharat
Necroză tubulară Hemoragii
Azotemii extrarenale pot fi – prerenale (insuf cardiacă, stări de şoc, hemoragii, deshidratare,
creşterea catabolismului proteic – dietă, febră, stres) şi postrenale (obstrucţia căilor urinare – tumori
ale vezicii urinare, calculi urinari, tumori ale prostatei, infecţii severe)
Modificarea nivelului ureei plasmatice este însoţită de alterări ale ureei urinare.
Hiperazoturii Hipoazoturii
Stări cu un catabolism proteic intens: Afecţiuni hepatice
stări febrile, afecţiuni endocrine Afecţiuni renale
(hipertirodism, diabet zaharat, diabet Administrare de hormoni ce cresc sinteza
azoturic), administrare de tiroxină proteică
Intoxicaţii cu plumb şi mercur Acidoze

Nivelul foarte crescut al ureei serice ce însoţeşte insuficienţa renală se numeşte uremie sau
sindrom uremic. Sindromul uremic este manifestarea clinică terminală a insuficienţei renale,
rezultat în urma incapacităţii rinichilor de a-si îndeplini adecvat funcţiile excretorii, reglatorii şi
endocrine. Simptomele clasice ale uremiei includ oboseală şi slăbiciune musculară, pierderea
apetitului, greaţă, vomă, tremor, acidoză metabolică, iar în cazul în care nu se intervine prin dializă
sau transplant renal evoluează spre comă şi moarte.
În concluzie, valoarea semiologică a nivelului ureei este dată de faptul că acumularea sa în
plasmă este un indice de insuficienţă renală, deşi există numeroşi factori extrarenali care-i
influenţează sinteza şi concentraţia sanguină.
Din aceste motive, de o mai mare utilitate clinică este determinarea raportului cantitativ
uree/creatinină (mg/100 ml ser), care pentru un individ normal este de 12-16:
- un raport < 12 denotă o alimentaţie proteică deficitară, o afecţiune hepatică cronică, sinteza
redusă de uree;
- un raport > 16 denotă o afecţiune renală.