Biochimie Lucrri practice medicin, vol.

Dozarea ureei
Ureea reprezint compusul prin care se elimin amoniacul din organism. Amoniacul rezult din dezaminarea aminoacizilor i din catabolismul altor compui azotai. Raportul dintre cantitatea de proteine catabolizate i ureea eliminat este de 3:1. Procesul biochimic de formare a ureei se numete ureogenez, este localizat la nivelul ficatului i constituie o cale eficient de detoxifiere a organismului, prin care amoniacul (produs toxic) este transformat n uree (compus netoxic) care se elimin prin urin. Nivelul ureei sanguine reprezint echilibrul dintre producia i excreia ureei. IX.1.1 Metoda de dozare enzimatic a ureei cu ureaz (metod specific) Principiul metodei Ureea este hidrolizat sub aciunea ureazei i este transformat n amoniac i dioxid de carbon. n mediu alcalin ionii de amoniu mpreun cu salicilatul i hipocloritul de sodiu, formeaz un compus de culoare verde, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia ureei. ureaz Uree + H2O 2NH3 + CO2 Ureaza este o amidaz, enzim care catalizeaz hidroliza legturilor C N, altele dect cele peptidice. Ea scindeaz hidrolitic legturile amidice din uree. Materiale necesare eprubete stativ pentru eprubete pipete de sticl pipete semiautomate conuri termostat 5

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I spectrofotometru cuve 1 cm vase cu soluie dezinfectant ap distilat tifon reactivi Reactivi Reactiv R1: ureaz soluie tampon fosfat salicilat de sodiu nitroprusiat de sodiu Reactiv R2: hipoclorit de sodiu NaOH Standard uree 8,325 mmol/l (50 mg/dl) Proba Ser sau plasm heparinizat (nu se utilizeaz anticoagulant ce conine fluorur sau ioni de amoniu) Urin diluat cu ap distilat 1:100 (rezultatul se nmulete cu 100) Tehnica de lucru Se pregtesc trei eprubete: martor, standard, prob. Se pipeteaz n eprubete conform tabelului XVIII.
Tabelul XVIII

Reactivi Martor Standard Proba Reactiv R1 1 ml 1 ml 1 ml Ap distilat 10 l Standard 10 l Prob 10 l Se agit i se incubeaz timp de 5 minute la 37C apoi se adaug Reactiv R2 1 ml 1 ml 1 ml Se agit din nou i se incubeaz timp de 5 minute la 37C. Se citesc extinciile probei (Ep) i standardului (Es) fa de martor la lungimea de und de 578 nm, n cuve de 1cm. 6

Biochimie Lucrri practice medicin, vol. I Calcul (pentru ser i plasm) C p = Ep / Es C s mg uree / 100 ml ser = Ep / Es Cs unde: Cp = concentraia probei Ep = extincia probei Es = extincia standardului Cs = concentraia standardului (50 mg/dl) Valori normale uree snge: 20 40 mg % (2,49 7,47 mmol/l) urin: 24 30 g / 24 ore Variaii fiziologice Concentraia sanguin a ureei are variaii strns legate de vrst, cu creteri pn la 50 mg/100 ml ser la subieci peste 60 de ani. Alimentaia bogat n proteine determin valori la limita superioar a normalului. n ultimul trimestru de sarcin se constat valori mai sczute, deoarece ftul crete rapid folosind aminoacizii materni. Variaii patologice ale ureei n snge Valori crescute cauze renale: glomerulonefrite acute i cronice; nefroangioscleroze benigne sau maligne; nefropatii tubulare toxice; TBC renal; tumori renale; rinichi polichistic; hidronefroze; hipertrofia prostatei; calculoz renal; 7

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I insuficien renal acut sau cronic (permite aprecierea gradului leziunilor parenchimatoase). cauze extrarenale: hipercatabolism proteic ce asociaz obligatoriu o component renal de origine ischemic; strile de toxicoz i oc datorate hemoragiilor, arsurilor, traumatismelor. Valori sczute insuficiena hepatic grav.

IX.2 Dozarea creatininei

Creatinina reprezint un deeu metabolic care se gsete n cantitate mai mare n urin dect n plasm. Ea se formeaz la nivelul ficatului i rinichiului i se elimin prin urin. Creatinina este cel mai constant constituent azotat din snge, deoarece nu este influenat de regimul alimentar, efortul fizic sau starea altor organe; variaz doar n funcie de eliminarea sa renal. Concentraia seric a creatininei este un bun indicator al filtrrii glomerulare i crete atunci cnd mai mult de 50% din funcia renal este pierdut. Determinarea creatininei serice (metoda Jaff) Principiul metodei Creatinina, n mediu puternic alcalin, reduce acidul picric la acid picramic de culoare galben portocalie, fotometrabil. Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia creatininei. Materiale necesare eprubete de centrifug stativ cu eprubete pipete de sticl pipete semiautomate conuri vase cu dezinfectant 8

Biochimie Lucrri practice medicin, vol. I centrifug spectrofotometru cuve 1 cm tifon reactivi Reactivi Soluie saturat de acid picric 1,2 g % NaOH 10% Soluie standard stoc de creatinin 100 mg % ml HCl 0,1N Soluie standard de lucru de creatinin 1mg/100 ml. Se dilueaz 1 ml stoc de creatinin la 100 ml de ap distilat. Proba Ser nehemolizat Tehnica de lucru Deproteinizarea Se pipeteaz n dou eprubete de centrifug conform tabelului urmtor:
Tabelul XXII

Reactivi Sol acid picric Standard de lucru Ser

Proba 3 ml 1

Standard 3 ml 1 ml

Se omogenizeaz coninutul eprubetelor i se centrifugheaz timp de 5 minute la 3000 turaii/minut. Reacia de culoare Se pregtesc trei eprubete: martor, standard, prob Se pipeteaz n eprubete conform tabelului urmtor:
Tabelul XXIII

Reactivi Supernatant prob

Martor 9

Standard

Proba 2 ml

Supernatant standard Ap distilat Sol acid picric Sol NaOH 10%

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I 2 ml 0,5 ml 1,5 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,1 ml

Se agit i dup 20 de minute se citesc extinciile probei (Ep) i standardului (Es) fa de martor la lungimea de und de 530 nm, n cuve de 1cm. Calcul C p = Ep / E s C s mg creatinin /100 ml ser = Ep / Es 1 unde: Cp = concentraia probei Ep = extincia probei Es = extincia standardului Cs = concentraia standardului (1mg/100 ml) Valori normale creatinin n snge: brbai 0,6 1,1 mg % femei 0,5 0,9 mg % n urin: 1 1,5 g / 24 ore ntruct eliminrile de creatinin sunt n legtur cu greutatea corporal (i mai ales cu masa muscular), valorile normale pot fi exprimate sub form de coeficient creatininic, reprezentnd eliminrile de creatinin pe kg corp i pe 24 de ore. Calculate astfel, valorile normale ale creatininei urinare devin: brbai: 20 26 mg/kg/24 ore femei: 14 22 mg/kg/24 ore copii: 6,4 21 mg/kg/24 ore Variaii patologice Valori crescute: 10

Biochimie Lucrri practice medicin, vol. I Creatinemia rmne constant att timp ct factorul renal de eliminare nu este afectat. Modificrile acesteia, chiar minore, pot fi semnificative pentru diagnostic deoarece creterea acestor valori este direct proporional cu severitatea bolii. cauze prerenale: insuficiena cardiac congestiv; deshidratri masive prin: vrsturi incoercibile; diaree; administrare excesiv de diuretice; transpiraii abundente; diabet zaharat; diabet insipid; gut; afeciuni hepatice; miopatii; polimiozite, etc. cauze renale: insuficien renal acut sau cronic; cauze postrenale: obstrucii ale cilor urinare: neoplasm; litiaz renal; adenom de prostat. n cazul transplantului renal, creteri ct de mici ale creatininei fa de valorile normale ne indic respingerea grefei. Valori sczute: insuficien renal cronic.

IX.3 Dozarea acidului uric

Acidul uric reprezint la om produsul final al catabolismului oxidativ al bazelor purinice (ureea este produsul final al eliminrii bazelor pirimidinice). Uricopoeza (biosintezei acidului uric) are loc la nivelul ficatului. Acidul uric este transportat n plasm sub form de urat de sodiu i este excretat prin urin. 11

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I IX.3.1 Metoda de dozare a acidului uric cu uricaz (metod specific) Principiul metodei Acidul uric este transformat de uricaz n alantoin i ap oxigenat, care sub aciunea peroxidazei oxideaz 2,4diclorfenolsulfonatul i 4aminoantipirina formnd un derivat de chinon de culoare rou-violet. Intensitatea culorii derivatului obinut este direct proporional cu concentraia acidului uric. Uricaza este o enzim cu specificitate absolut de substrat, acionnd numai asupra acidului uric.
uricaza acid uric + 2H2O + O2 alantoina + CO2 + H2O2 peroxidaza 2H2O2 + 2,4diclorfenolsulfonat + 4aminoantipirina derivat chinon

Materiale necesare stativ cu eprubete pipete de sticl pipete semiautomate conuri vase cu soluie dezinfectant termostat spectrofotometru cuve 1 cm tifon reactivi Reactivi Reactiv R1: tampon fosfatic 50 mmol/l; pH = 7,5 2,4diclorfenolsulfonat 4 mmol/l Reactiv R2: uricaz 80 U/l peroxidaz 660 U/l 4aminoantipirina 1 mmol/l Standard acid uric 60 mg/l (357 mol/l) 12

Biochimie Lucrri practice medicin, vol. I Preparare. Reactivul enzimatic se prepar prin dizolvarea unui flacon de reactiv R2 n cantitatea corespunztoare de reactiv R1. Stabilitatea soluiei este de 28 de zile la 2 8C i de 7 zile la 20 25C. Proba Ser sau plasm heparinizat Urin diluat cu ap distilat 1:10 Tehnica de lucru Se pregtesc trei eprubete: martor, standard, prob. Se pipeteaz n eprubete conform tabelului urmtor:
Tabelul XXIV

Reactivi Amestec R1+R2 Ap distilat Standard Prob

Martor 1 ml 20 l

Standard 1 ml 20 l

Proba 1 ml 20 l

Se agit coninutul eprubetelor i se incubeaz timp de 5 minute la 37C sau 10 minute la 25C. Se msoar extinciile probei (Ep) i standardului (Es) fa de martor la lungimea de und de 520 nm, n cuve de 1 cm. Calcul C p = Ep / E s C s mg acid uric/100 ml ser (plasm) = Ep / Es Cs unde: Cp = concentraia probei Ep = extincia probei Es = extincia standardului Cs = concentraia standardului Observaii

13

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I Metoda este linear pn la concentraia de 300 mg/l. Peste aceast valoare se dilueaz proba 1:5 sau 1:10 cu soluie fiziologic i rezultatul se nmulete cu 5 sau 10. Valori normale acid uric n snge: brbai 3,5 7,5 mg % femei 2,5 6,5 mg % copii 1 3 mg % n urin: aduli 0,25 0,8 g / 24 ore ( 3,5 10 mg/kg/24 ore) copii sub 1 an pn la 25 mg/kg/24 ore Variaii fiziologice Valorile normale ale acidului uric variaz n funcie de sex, vrst, alimentaie, efort fizic, ritm circardian. Alimentaia bogat n purine i efortul fizic duc la creteri ale valorilor uricemiei. Valorile acidului uric sunt mai sczute n timpul nopii. Variaii patologice Creterea concentraiei sanguine a acidului uric (hiperuricemia) se produce prin urmtoarele mecanisme: anomalii ereditare de eliminare a acidului uric, n parte sub form de urat alcalin; excesul de aport (nucleoproteine aduse prin alimentaie), creterea sintezei de novo a purinelor, catabolismul accentuat al nucleoproteinelor endogene; distrugerea insuficient a acidului uric n organism cu insuficienta lui eliminare. Hiperuricemii primare: enzimopatii; gut: acidul uric liber din plasm ajunge la o limit de concentrare la care precipit cu depunere n esuturi tofi gutoi (redizolvabili sub tratament); 14

Biochimie Lucrri practice medicin, vol. I forma cronic include artropatia gutoas, litiaza renal i chiar depunerea n miocard. Hiperuricemii secundare: supraalimentare proteic n special purinic; hiperproducia de acid uric prin catabolismul exagerat al nucleoproteinelor celulare: poliglobulii; leucemia acut i cronic; sindroame mieloproliferative; mielom multiplu; leucoza mieloid; intoxicaii cu plumb i mercur; toxicoze gravidice; mononucleaza infecioas; tulburarea excreiei renale din: insuficiena renal cronic; glomerulonefrita cronic; boala polichistic renal; pielonefrite; scleroza renal; nefropatia saturnian; hiperuricemia medicamentoas n cazul consumului crescut de: diuretice; saludiuretice; mercuriale; acetazolamid; salicilat de sodiu; alte afeciuni: diabet zaharat cu cetoacidoz; hiperparatiroidie; mixedem. Hipouricemiile sunt mult mai rare. primare: defect tubular renal ereditar; xantinuria eredidar (deficit de xantinoxidaz); secundare: consum inadecvat medicamente; leziuni tubulare renale; 15

Biochimie - Lucrri practice medicin, vol.I afeciuni hepatice severe; mielom multiplu; sindromul secreiei inadecvate de ADH.

16