Determinarea activității

enzimatice a
transaminazelor
LP7
Introducere
 Transaminazele (aminotransferazele) sunt enzime intracelulare care catalizeaza transferul unei
grupări amino de la un aminoacid la un α-cetoacid. Transaminarea este un proces de degradare și
sinteză a aminoacizilor și are ca rezultat formarea unui nou aminoacid și a unui nou α-cetoacid.

 Transaminarea este procesul prin care grupările amino sunt îndepărtate din aminoacizi și
transferate la cetoacizi acceptori pentru a genera versiunea de aminoacid a cetoacidului și versiunea
de cetoacid a aminoacidului original.
 Reacțiile sunt reversibile, iar sensul in care aceasta se desfasoara depinde de concentrațiile de
substrat si/sau produs.
Introducere

 Două enzime au fost studiate în special în biologia clinică, acestea fiind: aspartat
aminotransferaza (AST) si alanin aminotransferaza (ALT), acestea fiind răspândite în țesuturi, în
principal în ficat și mușchii netezi (cardiaci) și striați (scheletici), dar și în pancreas, creier și rinichi.
 Transaminazele sunt enzime localizate strict intracelular și sunt eliberate în sânge prin citoliză.
Astfel, un nivel ridicat de transaminaze în ser reflectă o leziune celulară în general la nivelul ficatului,
inimii, rinichilor sau mușchilor.
Determinarea activității serice permite, prin urmare, demonstrarea leziunilor de citoliză.
Eliberarea în sânge are loc la câteva ore după leziune, iar timpul de înjumătățire al enzimei este
scurt.
Măsurarea paralelă a ALT și AST este efectuată pentru a distinge între leziuni hepatice, cardiace
sau musculare.
Alanin aminotransferaza (ALT)

 Alanin aminotransferaza (ALT) numită anterior glutamat piruvat transaminaza (GPT) este o
enzimă citoplasmatică care catalizează o reacție reversibilă care permite dezaminarea alaninei cu
formarea piruvatului. Acesta din urmă poate intra in calea gluconeogenezei sau a ciclului Krebs.
Această enzimă se găsește în hepatocite și celule musculare striate scheletice.

 ALT crește semnificativ în tulburările hepatobiliare. Orice creștere semnificativă a concentrației

ALT indică distrugerea celulelor sau creșterea permeabilității membranei.
La carnivore, alanin aminotransferaza (ALT sau GPT) este un marker major al suferinței hepatice, dar
o creștere a concentrației sale serice se găsește și în cazul unei patologii musculare severe.
Alanin aminotransferaza (ALT) - Recomandari

 Recomandari pentru determinarea ALT:

• diagnosticul bolilor hepatice;

• diagnosticul diferential al bolilor hepatobiliare si pancreatice;
• monitorizarea evolutiei si a tratamentului hepatitei virale;
• diagnosticul diferential intre icterul hemolitic si cel hepatic.
Interpretare - Valori crescute ale ALT

 Creșteri de 20-100 ori (>1000 UI/L): indică întotdeauna necroză hepatică severă, de obicei in hepatite
virale (infecția câinilor cu virusul hepatitei Rubarth) sau parazitare (produse de Leishmania,
Hepatozoon sau Neospora) si in hepatite toxice (medicamente: pesticide, tetraclorură de carbon,
acetaminofen)
 Cresterea rapida (>600UI/L), urmata de o scadere abrupta in decurs de 12-72h: în obstrucția acută a
ductelor biliare
 Creșteri moderate (<150UI/L): în metastaze hepatice (nu și în hepatomul primar), ciroză hepatică,
stare de șoc, arsuri severe, infarct miocardic, insuficiență cardiacă
 Cresteri ALT pot fi intalnite la pacientii cu traumatisme musculare, dar in aceste cazuri apar si niveluri
crescute de creatinkinaza care orienteaza spre o afectiune musculara.
 Interferente analitice – contaminarea probei cu eritrocite poate determina valori fals crescute sau
lipemia poate creste absorbanta probei, valoarea ALT neputand fi calculata
Interpretare - Valori scăzute ale ALT

 pot indica existența bolilor hepatice în stare gravă

 unele hepatotoxine inhibă transcrierea genelor sau interferă cu biosinteza ALT (de exemplu,
hepatotoxicitatea indusă de aflatoxina B1, hepatotoxicitatea dată de microcistină (o cianotoxină
produsă de bacteriile Cianoficea)
 malnutritie
 tulburări ale altor organe (de exemplu: insuficiența cardiacă congestivă poate duce la o circulație
sanguină slabă, stagnarea fluxului sanguin hepatic și o funcție hepatică slabă)
neoplazii
Determinarea activității enzimatice a ALT – principiul metodei
 Măsurarea activității catalitice a ALT utilizează
două reacții consecutive: ALT catalizează
transferul reversibil al unei grupari amino de
la alanină la ⍺-cetoglutarat cu formare de
piruvat și glutamat.

 Piruvatul produs este apoi redus la L-lactat,

reacție catalizată de enzima lactat
dehidrogenază (LDH) în prezența cofactorului
(NADH).

 NADH absoarbe în ultraviolet la 340 nm, în

timp ce NAD+ nu absoarbe la această lungime
de undă. Prin urmare, este posibil să se
măsoare activitatea enzimatică a reacției
secundare catalizate de LDH urmărind scăderea
absorbanței la 340nm (corespunzătoare
consumului de NADH) și astfel să se deducă
activitatea enzimatică din ALT.
Determinarea activității enzimatice a ALT – principiul metodei

- Tampon Tris-HCl pH 7,15 ……….................................140 mmol/L

Reactiv 1 - L-Alanina …..............................................................700 mmol/L
- LDH……………………………………………………………………….2300 mmol/L

- α-cetoglutarat…………………………………………….…….85 mmol/L
Reactiv 2
- NADH……………………………………………………………....85 mmol/L

Proba - Ser/plasma recoltat pe heparina sau EDTA 

Se realizează un reactiv de lucru - Se amestecă 4 volume de Reactiv 1 cu 1 volum de Reactiv 2
Determinarea activității enzimatice a ALT – principiul metodei

Probă (ser) Blank ∆ 𝐀/𝐦 𝐢𝐧 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦𝐫𝐞𝐚𝐜𝐭𝐢 𝒆

𝐀 𝐋 𝐓 [ 𝑈 𝐼 / 𝐿 ]=
3
Probă (µL) × ×10
100 - 𝛆× 𝐥 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐩𝐫𝐨𝐛𝐚
Apa (µL)
- 1000
Reactiv de ε - coeficientul de absorbție molară al coenzimei NADH la
lucru (µL) 1000
340 nm; ε = 6,3 L / mmol / cm
Se amestecă și se incubează 1 minut. Se citește l - lungimea traseului optic al celulei de măsurare utilizate
absorbanța inițială la 340nm și apoi absorbanțele
din minut în minut, timp de 3 minute. (aici 1 cm).

Specie Câine Pisică Cal Vacă Porc Oaie

Alanin
aminotransferaza 18-86 25-145 4-12 17-37 32-84 60-84
U/L
Aspartat aminotransferaza (AST)

 Aspartat aminotransferaza (AST) numită anterior glutamat oxaloacetat transaminază (GOT) este
o enzimă citoplasmatică și mitocondrială care catalizează o reacție reversibilă care permite
dezaminarea aspartatului cu formarea oxaloacetatului care poate intra în ciclul Krebs.
 Acestei enzime îi lipsește specificitatea, deoarece se găsește în cantități mari în diferite organe:
mușchii scheletici striați și inima, ficatul, rinichii, creierul și alte țesuturi, inclusiv eritrocitele.

AST

 Nivelurile ridicate de AST se pot asocia cu tulburări la nivelul inimii sau mușchiului scheletic,
precum și ale parenchimului hepatic.
 Durata și amploarea activității transaminazelor măsurate secvențial pot prezice activitatea și
severitatea bolii.
Interpretare - Valori crescute ale AST

 Creșterea AST insoțită de creșterea ALT, bilirubinei și fosfatazei alcaline indică de obicei leziuni
hepatice
 Nivelurile foarte ridicate de AST (1000 UI/L) se datorează de obicei hepatitei virale sau leziunilor
hepatice datorate unui medicament sau unei toxine
 O crestere si o scadere rapida a AST sugereaza obstructia biliara extrahepatica;
 Un nivel crescut a AST: în activitate fizică viguroasă la câini
 Cresteri marcate (peste 3000 U/l) pot aparea in infarctul miocardic acut, stari septice, interventii pe
cord. In cazul infarctului miocardic eliberarea enzimei din celule are loc la 6-12 ore de la declansare,
valorile maxime se obtin la 48 de ore, dupa care se revine la normal in 3-5 zile.
 Măsurarea paralelă a ALT și AST (raportul AST/ALT) se efectuează pentru a distinge între leziuni
hepatice, cardiace sau musculare. Dacă numai activitatea AST este crescută (fără creșterea ALT),
aceasta poate indica boli cardiace sau musculare (infarct miocardic).
 Valoarea normală a raportului AST/ALT este de aproximativ 0,8:
- AST/ALT<0,8 poate apărea in cazul hepatitei sau steatozei hepatice
- AST/ALT>0,8 poate apărea în cazul cirozei, metastazelor sau congestiei
- AST/ALT>3.0 poate apărea imediat după leziuni musculare, infarct.
Interpretare - Valori scăzute ale AST

 azotemie (concentrație anormal de mare de uree în sânge sau de alți compuși ce conțin azot)
 dializa
 deficit cronic de piridoxal fosfat (malnutritie)
 Conditii fiziologice – in sarcina pot sa apara valori scazute <10 U/L
 Tratamentul cu anumite medicamente: acid ascorbic, alopurinol, ciclosporina, clomipramina,
ibuprofen, metronidazol, penicilamina
Determinarea activității enzimatice a AST – principiul metodei
 Măsurarea activității catalitice a AST utilizează
două reacții consecutive: AST catalizează
transferul reversibil al unei grupări amino de COO- COO- COO- COO-
la aspartat la ⍺-cetoglutarat cu formare de ASAT
H3N C H + C O C O + H3N C H
oxaloacetat și glutamat.
CH2 CH2 CH2 CH2
 Oxaloacetatul produs este apoi redus la L- COO- CH2 COO- COO- CH2 COO-
malat, reacție catalizată de enzima malat L-Aspartate -Cétoglutarate Oxaloacétate L-Glutamate
dehidrogenază (MDH) în prezența cofactorului
(NADH).

 NADH absoarbe în ultraviolet la 340 nm, în

timp ce NAD+ nu absoarbe la această lungime
de undă. Prin urmare, este posibil să se
măsoare activitatea enzimatică a reacției
secundare catalizate de LDH urmărind scăderea
absorbanței la 340nm (corespunzătoare
consumului de NADH) și astfel să se deducă
activitatea enzimatică din AST.
Interpretare

 La carnivore, aspartat aminotransferaza (AST) nu este recomandata pentru a se măsura singură, ci

mai degrabă într-un set de markeri pentru explorarea hepatică.
 AST indică prezența unor daune mai recente/active.
 La rumegătoare și cai, AST este un marker mai bun decât ALT pentru confirmarea leziunilor
hepatocelulare.
 Testul de AST este indicat pentru a detecta necroza cardiacă sau afectarea ficatului. O valoare AST
serică crescută nu este specifică bolilor hepatice, de aceea trebuie interpretată împreună cu
valoarea ALT.
Determinarea activității enzimatice a AST – principiul metodei

- Tampon Tris-HCl pH 7,15 ……….................................140 mmol/L

Reactiv 1 - L-Aspartat ….............................................................700 mmol/L
- MDH………………………………………………………………………..2300 mmol/L

- α-cetoglutarat…………………………………………….…….85 mmol/L
Reactiv 2
- NADH……………………………………………………………....85 mmol/L

Proba - Ser/plasma recoltat pe heparina sau EDTA 

Se realizează un reactiv de lucru - Se amestecă 4 volume de Reactiv 1 cu 1 volum de Reactiv 2
Determinarea activității enzimatice a AST – principiul metodei

Probă (ser) Blank ∆ 𝐀 /𝐦 𝐢𝐧 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐫𝐞𝐚𝐜𝐭𝐢 𝒆

𝐀 𝐒 𝐓 [ 𝑈 𝐼 / 𝐿 ]=
3
Probă (µL) × × 10
100 - 𝛆×𝐥 𝐯𝐨𝐥𝐮𝐦 𝐩𝐫𝐨𝐛𝐚
Apa (µL)
- 1000
Reactiv de ε - coeficientul de absorbție molară al coenzimei NADH la
lucru (µL) 1000
340 nm; ε = 6,3 L / mmol / cm
Se amestecă și se incubează 1 minut. Se citește l - lungimea traseului optic al celulei de măsurare utilizate
absorbanța inițială la 340nm și apoi absorbanțele
din minut în minut, timp de 3 minute. (aici 1 cm).

Specie Câine Pisică Cal Vacă Porc Oaie

Aspartat
aminotransferaza 9-54 5-42 189-385 48-100 9-113 89-278
U/L