Purificarea proteinelor prin precipitare

LP3
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

A. SOLUBILITATEA

 În general, pentru ca un solut (= substanța dizolvată într-o solutie) să fie solubil într-un solvent (= substanță
chimică, lichidă, care are proprietatea de a dizolva în masa ei alte substanțe; dizolvant) acesta trebuie să
poată stabili interacțiuni mai puternice cu moleculele solventului decât cele existente între moleculele de
solut.
 Interacțiunile intermoleculare precum legăturile de hidrogen, interacțiunile ion-dipol și forțele van
der Waals joacă un rol important în solvatare.
 Structura moleculară și caracteristicile solventului și solutului determină tipul de interacțiune dominantă care
se stabilește între solvent și solut.
Solubilitatea proteinelor într-un mediu de dispersie apos este influenţată de:
- distribuţia resturilor de aminoacizi hidrofili şi hidrofobi expuse la suprafaţa proteinelor
- pH-ul solutiei
- tăria ionică a mediului
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Dacă proteinele au la suprafaţa lor expuse un număr mare de grupări hidrofobe, stratul dublu electric
este extrem de instabil, iar forţele de repulsie sunt slabe. Astfel apare agregarea proteinelor datorită
faptului că forţele de atracţie (hidrofobe şi van der Waals) între macromolecule sunt puternice.
 Dacă proteinele au expuse la suprafaţă grupări ionice, stratul dublu electric este gros, ecranând forţele
de atracţie şi astfel proteinele au tendința de a se separa una de alta, fiind favorizate să rămână în soluție.
 Distanța dintre două particule aflate în echilibru stabil este dată de un minim al energiei lor
potențiale (energia minimă necesara ca 2 particule să se ciocnească). Dacă energia potențială depășește
acest prag minim, cele două particule formează un agregat labil, care poate fi ușor redispersat.
 Pentru ca forța de atracție van der Waals să fie dominantă, particulele trebuie să se apropie una de
alta la distanțe scurte, însă forța de repulsie electrostatică se opune acestei apropieri.
 Forța van der Waals este o interacțiune dependentă de distanța dintre atomi și molecule. Spre
deosebire de legăturile ionice și covalente, legăturile van der Waals nu constau din legături chimice
bazate pe modificarea distribuției de electroni, fiind mult mai slabe și labile.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Prezența electroliților în cantități mici în soluția de proteine contribuie la mărirea volumului efectiv
al particulelor, facilitând forțele de repulsie dintre particule și deci rămânerea acestora în dispersie.

Figura 1. Solubilitatea unor particule încărcate electric depinde de prezența electroliților

în soluție. Acești ioni vor constitui dublul strat electric și astfel vor crește distanța minimă la
care se pot apropia particulele, ceea ce duce la diminuarea forței de atracție van der Waals.
 LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Contraionii sărurilor solvatate migrează către

aminoacizii încărcați de pe suprafața proteinei,
formând o matrice rigidă a contraionilor atașați
la suprafața proteinei (stratul fix).
 Ionii din stratul de solvatare adiacent, care este
mai puțin rigid, este format din ioni cu sarcină
contrară celor care interacționează cu
aminoacizii polari ai proteinei, organizați după
un profil de concentraţie descrescător al
contraionilor (strat mobil).
 Un număr și mai redus de contra-contraioni se
vor poziționa în apropierea contraionilor din
stratul mobil, constituind stratul difuz. În
condițiile existenței unui dublu strat electric
bine reprezentat, proteinelor le va fi greu să Figura 2. Forțele de respingere electrostatice dintre
formeze agregate. proteine previn agregarea lor și facilitează dizolvarea.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

B. DENATURAREA PROTEINELOR

 Denaturarea reprezintă o alterare conformaţională extremă datorată acţiunii unor factori fizici
sau chimici, care conduce la deplierea catenei polipeptidice şi adoptarea unei structuri dezordonate.
 Agenţii denaturanţi acţionează prin modificarea interacţiilor necovalente (legături de hidrogen,
interacţiile van der Waals şi hidrofobe) care favorizează plierea proteinelor.
 În stare denaturată, proteinele formează alte legături de hidrogen între aminoacizi diferiți
decât în forma nativă a proteinei.
 Apa, ca şi ionii când sunt prezenţi în mediu, formează un gradient de concentraţie în jurul
proteinelor, atingând concentraţia maximă la suprafaţa acestora, având capacitatea de a ecrana
forţele de atracţie dintre proteine.
 Denaturarea poate fi:
- reversibilă = revenirea la starea nativă este posibilă și funcțiile sunt restabilite;
- ireversibilă = revenirea la starea nativă nu este posibilă și funcțiile nu sunt restabilite.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

Denaturarea proteinelor - agenți denaturanți:

a. Agenți fizici:
- Forțe mecanice
- Temperatura: crește vibrațiile și rotațiile moleculelor ceea ce conduce la creștere instabilității
interacțiunilor slabe. Procesul este reversibil până la o anumită valoare a temperaturii (sub 50° - 60°
C).
b. Agenți chimici:
- pH-ul: variațiile de pH produc modificări ale ionizării catenelor laterale și perturbări ale legăturilor de
hidrogen. Acțiunea sa este reversibilă, cu excepția cazurilor în care pH-ul este prea acid sau prea bazic.
- Sărurile anorganice foarte solubile în apă (NaCl, (NH4)2SO4, MgSO4) = SALIFIERE
- Agenții chaotropici (ureea): produc ruperea reversibilă a legăturilor de hidrogen
- Solvenții organici miscibili cu apă (etanol, acetonă): deshidratează proteinele datorită afinității mari
pentru apă.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

Figura 3. Nivele de organizare ale proteinelor

LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 La tării ionice mici, ionii sărurilor neutre (NaCl, KCl, K2SO4, NaNO3, KClO3, KClO4) ajută la solubilizarea
proteinelor, prin constituirea dublului strat electric al acestora și crescând distanţa dintre particule, ajutându-le
așadar să minimizeze forțele de atracție van der Waals, fenomen numit în biochimie „salting-in”.
 Păstrarea stratului dublu electric este motivul pentru care este important să nu se îndepărteze toţi ionii la
purificarea proteinelor prin dializă.
 Dializa este o tehnică de separare care facilitează îndepărtarea
compușilor mici, nedoriți din soluție, prin difuzie selectivă și pasivă
printr-o membrană semi-permeabilă. O probă și o soluție tampon sunt
plasate pe părțile opuse ale membranei. Moleculele de probă care sunt
mai mari decât porii membranei sunt reținute in interiorul membranei, iar
moleculele mici și sărurile trec liber prin membrană.
 Se introduce soluția proteică într-un sac realizat dintr-un material
semipermeabil (celofan) cu dimensiunea porilor controlată. Acesta este
introdus în apă sau într-o soluţie cu tărie ionică mai mică decât a soluției
din sac, care permite trecerea liberă prin porii săi a moleculelor şi ionilor
mici, dar nu a proteinelor mari. Ionii trec prin membrana semipermeabilă
până în momentul egalizării concentraţiei ionilor de o parte şi de alta a
membranei. Figura 4. Dializa
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Rolul ionilor asupra stabilităţii proteinelor şi a capacităţii de precipitare a acestora, prin fenomenul
de salting out, este descris Hofmeister  seriile Hofmeister:

 Anionii din stânga Cl– sunt bine hidratați, clasificați ca ioni cosmotropi. Aceștia tind să stabilizeze
structura nativă a proteinelor, scad solubilitatea acestora în apă și induc precipitarea proteinelor
prin fenomenul de salting-out. Precipitarea proteinelor cu acești ioni este reversibilă, iar
proteinele nu sunt denaturate.
 Anionii din dreapta Cl– sunt slab hidratați, numiți caotropi. În soluție apoasă, aceștia pot
destabiliza legăturile de hidrogen formate între molecule de apă învecinate și tind să faciliteze
denaturarea (deplierea) proteinelor, crescându-le solubilitatea, prin fenomenul salting-in.
 Cl– este la limita dintre cele două tipuri diferite de ioni, și nu are niciun efect evident asupra
stabilității proteinelor.
 LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Cationii din stânga Na+ sunt numiți ioni cosmotropi și sunt slab hidratați, scad solubilitatea
proteinelor, având tendința de a le precipita, fara a le denatura (= salting-out).
 Cationii divalenți din dreapta Na+ sunt ioni caotropi și cresc solubilitatea proteinelor dar le
denaturează (= salting-in).

Scad solubilitatea Cresc solubilitatea

Stabilizează structura Destabilizează structura
Reduc denaturarea Cresc denaturarea
proteinelor proteinelor
SALTING OUT SALTING IN
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

 Proteinele sunt alcătuite din aminoacizi hidrofobi și

hidrofili. După plierea proteinelor în soluție apoasă,
aminoacizii hidrofobi formează de obicei zone
hidrofobe protejate, în timp ce aminoacizii hidrofili
interacționează cu moleculele de solvent și permit
proteinelor să formeze legături de hidrogen cu
moleculele de apă din jur. Dacă o cantitate suficientă
din suprafața proteinei este hidrofilă, proteina poate fi
dizolvată în apă.
 Când se adaugă sare în soluție, există o interacțiune mai mare între moleculele de solvent și ionii
de sare. Ca rezultat, proteinele și ionii de sare concurează pentru a interacționa cu moleculele de
solvent, scăzând numărul moleculelor de solvent disponibile pentru interacțiunea cu proteinele.
Interacțiunile proteină-proteină devin astfel mai puternice decât interacțiunile solvent-solut și
moleculele proteice se asociază formând interacțiuni hidrofobe între ele.
 Fenomenul de precipitare are loc datorită faptului că la concentrații mari, ionii acestor săruri,
induc progresiv scăderea stratului de hidratare a proteinei, formându-şi propriul strat de hidratare.
Scăderea acestui strat conduce la agregarea proteinelor prin creşterea forţelor de atracţie van der
Waals.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

C. Fracționarea proteinelor dintr-un extract proteic total prin precipitare cu sulfat de amoniu

 În cazul unei proteine date, solubilitatea ei crește cu creșterea concentrației unei sări neutre
(salting–in), atinge o valoare maximă, după care scade treptat până când precipită din soluție
(salting–out). Fiecare proteină, în funcție de structura sa, precipită la o anumită concentrație dintr-o
sare, deci teoretic este posibilă precipitarea fracționată, treptată, a proteinelor dintr-un amestec și
separarea lor.
 Precipitarea proteinelor cu ajutorul concentrațiilor mari de sare se datorează faptului că ionii sării
îndepărtează mare marte din moleculele de apă care în mod obișnuit hidratează suprafața
proteinelor, fenomen care duce, în final, la precipitarea acestora din soluție.
 Fenomenul de precipitare, în special în prezența concentrațiilor mari de săruri care prin dizolvare
formează ioni cosmotropi este reversibil. Prin reluarea precipitatului într-un volum limitat de apă,
acesta de redizolvă – semn că nu a fost alterată structura terțiară a macromoleculei proteice.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

C. Fracționarea proteinelor dintr-un extract proteic total prin precipitare cu sulfat de amoniu

 Pentru ca o sare neutră să fie utilizată ca agent de precipitare fracționată, aceasta trebuie:
- să prezinte o foarte bună solubilitate în apă, pentru a permite obținerea unei game largi de concentrații
la care să precipite diferite proteine dintr-un amestec;
- prin dizolvarea sării să nu aibă loc procese exoterme, care pot provoca denaturarea termică a
proteinelor;
- să nu modifice pH-ul;
- să nu interacționeze chimic cu proteinele, pentru a putea fi îndepărtată din fracțiile proteice
precipitate
 Sărurile utilizate frecvent în precipitarea fracționată a proteinelor sunt: (NH4)2SO4 – sulfatul de
amoniu, MgSO4 – sulfatul de magneziu, NaSO4 – sulfatul de sodiu, NaCl – clorura de sodiu.
 Sulfatul de amoniu este cel mai des utilizat agent de precipitare fracționată a proteinelor, fiind o sare
deosebit de solubilă, manifestând un efect stabilizator al structurii proteinelor, inclusiv al enzimelor
(prin dizolvare produce doi ioni cosmotropi).
 Utilizarea sulfatului de amoniu prezintă dezavantajul că interferă în dozarea proteinelor prin metoda
Lowry, iar prin solubilizare au loc mici variații de temperatură și de pH.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

C. Fracționarea proteinelor dintr-un extract proteic total prin precipitare cu sulfat de amoniu

 Principiul metodei: Într-un extract proteic se introduce sulfat de amoniu (cristale) până la 30% din
saturație, valoare la care unele proteine din amestec precipită – fracția 1 (F1) saturație 30%.
Acestea sunt separate prin centrifugare. În supernatantul rămas este crescută concentrația de sulfat
de amoniu până la 60% din saturație, concentrație la care alte proteine rămase în supernatant
precipită, și sunt separate prin centrifugare – fracția 2 (F2) saturație 30-60%. În supernatantul
rămas este crescută concentrația de sulfat de amoniu până la 90% din saturație, concentrație la care
aproape toate proteinele rămase în supernatant precipită, și pot fi separate prin centrifugare – fracția
3 (F3) saturație 60-90%. Fracțiile proteice F1, F2, F3 sunt reluate în volume minime de apă
distilată/soluții saline izotonice pentru determinarea concentrației proteice/dozarea activității
catalitice a enzimelor.
 Reactivi și materiale necesare:
1. Extract proteic total
2. Sulfat de amoniu cristalizat
3. Tuburi de centrifugă (cu volum de 15 mL)
4. Balanță analitică
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

C. Fracționarea proteinelor dintr-un extract proteic total prin precipitare cu sulfat de amoniu

Modul de lucru:
 Se începe fracționarea cu 9,8 mL de extract proteic total.
 Pentru a obține F1 cu saturația de sulfat de amoniu de 30%: 9.8mL extract proteic total se adaugă
1,76 g sulfat de amoniu cristalin  omogenizare până la dizolvarea sării și incubare 30 min. la 4 ℃,
centrifugare la 3000×g, 15 min, la 15 ℃. Sedimentul se resuspendă în 2mL de mediu de extracție
(apă distilată, NaCl 0,9% sau tampon fosfat), se notează F1 și se păstrează la -20 ℃ în vederea
dozării ulterioare a concentrației proteice.
 Pentru a obține F2 cu saturația de sulfat de amoniu de 60%: supernatantul obținut la F1 se transferă
în alt tub și se adaugă 1,95 g de sulfat de amoniu  omogenizare până la dizolvarea sării și incubare
30 min. la 4 ℃, centrifugare la 3000×g, 15 min, la 15 ℃. Sedimentul se resuspendă în 2 mL de
mediu de extracție atribuit, se notează F2 și se păstrează la -20 ℃ în vederea dozării ulterioare a
concentrației proteice.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare

C. Fracționarea proteinelor dintr-un

extract proteic total prin precipitare cu
sulfat de amoniu

Modul de lucru:
 Pentru a obține F3 cu saturația de sulfat de
amoniu de 90%: supernatantul se transferă
în alt tub de aceeași capacitate și se adaugă
2,15g sulfat de amoniu  omogenizare
până la dizolvarea sării și incubare 30 min.
la 4 ℃, centrifugare la 3000×g, 15 min., la
15 ℃. Supernatul (soluție salină saturată
90% de sulfat de amoniu) se aruncă iar
sedimentul se resuspendă în 2 mL de mediu
de extracție, se notează F3 și se păstrează la
-20℃ în vederea dozării ulterioare a
concentrației proteice.
LP3 Purificarea proteinelor prin precipitare
C. Fracționarea proteinelor dintr-un extract proteic total prin precipitare cu sulfat de amoniu
Rezultatele experimentale obținute în urma dozării proteinelor se vor consemna într-un tabel de tipul
Tabelului 3.1. Metoda de fracționare prin precipitare este utilizată pentru purificarea unor enzime,
anticorpi și hormoni proteici etc.
Pentru a identifica fracția care con’ine proteina de interes, fracțiile obținute sunt testate pentru activitatea
biologică specifică acesteia. Fracțiile care nu prezintă această activitate nu vor conține proteina de interes.