Sunteți pe pagina 1din 29

Proteinele se caracterizeaz printr-o mare diversitate structural determinat de: -numrul aminoacizilor constitueni; -- tipurile aminoacizilor constitueni; - secvena

aminoacizilor componeni; spaial configuraional a macromoleculei respective. organizarea Structura proteinelor structura primar - structura secundar - structura teriar - structura cuaternar
-

structura primar

structura secundar

structura teriar

structura cuaternar

Structura primar - reprezint organizarea catenei macromoleculare, respectiv numrul i secvena aminoacizilor legai prin legturi peptidice. n proteinele naturale legtura peptidic se stabilete ntre gruparea carboxilic de la un aminoacid i gruparea aminic de la alt aminoacid, nct lanul peptidic va fi format dintr-o succesiune de uniti -CO-NH-CH-, legate cap-cap. -legatura amidica are caracter partial de dubla legatura si nu permite rotatia, de aceea ea se va afla totdeauna intr-un plan.
O C CH R' N H R'' CH CH R' O

R''

OC CH R' N H

R'' CH

CH

N H

-carbonul -CH- se poate roti, putnd s apar n planuri diferite. -datorit lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte i de alta a lanului proteic, astfel c lanul proteic nu este ramificat.

Structura secundar -se refer la forma i la lungimea lanurilor polipeptidice, proprieti induse de legturile de hidrogen. Cele mai ntlnite tipuri de structura secundar: Structura n foaie pliant (-pliat) -Plierea catenei are loc prin formarea legturilor de hidrogen ntre gruparea carboxilic a unui aminoacid i gruparea aminic a aminoacidului vecin. -Lanul polipetidic pliat se prezint ca o panglic ndoit alternativ la dreapta i la stnga, plierea avnd loc n dreptul atomilor de carbon metinici.

Antiparalel

Paralel

-In modelul paralel, caracteristic -keratinei (in piele, unghii, etc.) lanurile peptidice sunt situate paralel, cu resturile -R orientate n acelai sens. -in modelul antiparalel, caracteristic fibroinei din mtasea naturala lanurile peptidice sunt fa n fa (antiparalele), cu resturile -R orientate n direcii opuse.

2. Structura elicoidal -Modelul spiralat, helicoidal sau -helix, presupune rsucirea n spiral a lanului polipeptidic (grilajului peptidic). -Acesta este format din catene polipeptidice ntre care se stabilesc legturi de hidrogen (ntre grupa C=O) a unei legturi peptidice dintr-o caten i grupa NH a legturii peptidice din catena vecin) n jurul unui cilindru imaginar. -Numele de -helix a fost utilizat de Pauling care a recunoscut prima dat aceast structur n -keratin. -Sensul de orientare a -helixului poate fi spre dreapta sau spre stnga, ns toi aminoacizii participani n ambele cazuri aparin seriei L, iar resturile R ale aminoacizilor sunt proiectate spre exteriorul spiralei (-helixului).

n cazul L-aminoacizilor din proteinele naturale, rsucirea spre dreapta a helixului confer structurii mai mult stabilitate dect rsucirea spre stnga. Elicea are forma unei scri n spiral, n care fiecrei trepte i corespunde un aminoacid.

nlimea unei trepte este de 1,5 i fiecrei spire i corespund 3,6 aminoacizi (trepte), iar distana dintre spire este de 5,4 . (3,6 1,5).
Catenele laterale n modelul -helix sunt orientate n afar, putnd reaciona cu moleculele solventului sau cu alte catene polipeptidice. Natura radicalului -R legat la formarea -helixului, favoriznd sau nu, rsucirea lanului peptidic. De exemplu: valina, izoleucina, i treonina, datorit substituenilor voluminoi, nu favorizeaz rsucirea catenei polipeptidice iar prolina este un ntreruptor al helixului, datorit faptului c neavnd atom de H la atomul de N nu poate forma legturi de hidrogen. C influeneaz

5.4

1.5

Colagenul un grup de proteine ce se gaseste in organismul animal, in special in tesuturile de legatura, constituind cam 25-35% din totalul de proteine. -contine circa 35% glicina, 11% alanina si 21% prolina si 4-hidroxiprolina. -structura sa este repetitiva fiind formata majoritar din secvente Gly-Pro-HO-Pro. -are o structura formata din 3 -catene rasucite intr-o elice spre stanga.

- Structura teriar Prin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul c macromoleculele proteice au o conformaie tridimensional, realizat de obicei prin intermediul cuplrii mai multor lanuri polipeptidice scurte ntre ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice; -reprezint rezultatul interaciilor dintre resturile R ale aminoacizilor din catenele polipeptidice. -se pot forma urmtoarele tipuri de legturi: legturi de hidrogen (altele dect cele peptidice) ntre grupele OH ale hidroxiaminoacizilor i restul imidazolic (de exemplu, al histidinei) sau grupa OH fenolic a tirozinei i un rest carboxilic (-COOH); legturi covalente de tip disulfuric stabilite la nivelul grupelor -SH din tioaminoacizii cistein, metionin;

-legturi fosfodiesterice, stabilite la nivelul grupelor -OH esterificabile ale hidroxiaminoacizilor (de exemplu, serina) cu acid fosforic:

-legturi ionice ntre resturile carboxilat (-COO-) de la aminoacizii dicarboxilici (acidul aspartic, acidul glutamic) i gruprile amoniu (NH3+) ale aminoacizilor diaminici (lisin, arginin); - legturi nepolare prin fore van der Waals (legturi hidrofobe) realizate ntre catenele laterale ale valinei, leucinei, izoleucinei, fenilalaninei. Legturile hidrofobe apar i acioneaz mai ales n interiorul moleculelor proteice, minimaliznd interaciile prilor hidrofobe cu apa i maximaliznd forele van der Waals ntre grupele hidrofobe.

Structura cuaternar a proteinelor reprezint cel mai nalt grad de organizare a acestora i rezult din interaciunea lanurilor polipeptidice independente, care au deja o structur primar, secundar, i teriar bine definit.
Suprastructura cuaternar are specific asocierea unor catene polipeptidice individuale (protomeri) ntr-un agregat denumit oligomer (multimer sau

- structura cuaternar

proteine multisubunitare).

Proteine care au structura cuaternar: hemoglobina, ADN polimeraza.

11

Proprieti fizice ale proteinelor Proteinele izolate din diferite surse sunt substane solide, n general amorfe, care prin purificare avansat pot fi obinute n stare cristalin.
Solubilitatea proteinelor n ap -este foarte diferit: proteinele globulare sunt mai mult sau mai puin solubile, pe cnd cele fibrilare sunt insolubile. -Solubilitatea n ap depinde de mai muli factori: natura, numrul i aezarea n caten a aminoacizilor care compun macromolecula, de existena grupelor funcionale hidrofile (carboxil, hidroxil), de pH i de concentraia n sruri a soluiei. -Prezena grupelor funcionale polare (-OH, -NH2, -COOH,-SH) favorizeaz dizolvarea n ap, deoarece moleculele polare ale apei sunt atrase electrostatic de grupele funcionale polare ale proteinei, ceea ce duce la legarea moleculelor solvatului de moleculele solventului, adic la fenomenul de solvatare (hidratare n cazul apei) indispensabil dizolvrii. Natura solventului are un rol mare n procesul de solubilitate a proteinelor.

Solubilitatea proteinelor este influenat i de pH-ul mediului. La pH izoelectric, moleculele proteinelor devin perfect neutre, nu mai leag moleculele polare ale apei n jurul lor, n consecin, nu mai are loc fenomenul de hidratare i dizolvare.
-La pHi (corespunzator punctului izoelectric), solubilitatea proteinei devine minim i din aceast cauz proteina precipit uor, particulele proteice gsindu-se sub form de amfioni. Prezena ionilor de semn contrar influeneaz solubilitatea proteinelor, deoarece macromoleculele posed la suprafa grupri ionizate i rein selectiv diferite substraturi cu molecule mici. -Solvenii organici produc o scdere a constantei dielectrice a mediului apos i n consecin, fenomenul de hidratare se reduce odat cu solubilitatea. O cantitate prea mare de solvent organic poate produce pierderea sarcinilor electrice i o deshidratare a proteinei care poate duce la denaturarea ei (modificarea structurii i proprietilor iniiale).

Starea coloidal a proteinelor n soluie -le confer proprietile caracteristice sistemelor coloidale: presiune osmotic mic, putere de difuziune redus, ultrafiltrare, efectul Tyndall (fenomen de dispersie a luminii incidente de ctre nite particule macroscopice avnd dimensiuni comparabile cu lungimea de und a luminii), etc.
Din cauza dimensiunilor mari ale macromoleculelor, proteinele nu difuzeaz prin membrane ale cror pori sunt de ordinul milimicronilor (membrane de celofan, pergament, colodiu etc.), proprietate pe care se bazeaz separarea lor de srurile prezente n soluie i ai cror ioni trec prin membranele de dializ.

Formare de geluri -Soluiile proteice pot forma geluri n care proteina i solventul formeaz o mas omogen, cu particulariti specifice substanelor solide. Fenomenul este important pentru realizarea reelei tridimensionale a scheletului protoplasmei, care este insolubil n ap, pe care o reine datorit procesului de imbibiie. Imbibiia gelului, nsoit de creterea considerabil a volumului este utilizat n industria alimentar (gelifierea alimentelor prin adugare de gelatin, imbibiia proteinelor din fin la prepararea aluatului etc.).

Precipitarea proteinelor -poate fi: reversibil si ireversibila; -Precipitarea reversibila: -are loc n prezena soluiilor concentrate de electrolii tari (sruri ale metalelor alcaline, alcalino-pmntoase, (NH4)2SO4 sau a solvenilor miscibili cu apa (alcool, aceton). -se explic prin fenomenul de salifiere, care const n deshidratarea parial a proteinelor, datorit competiiei pentru moleculele de ap dintre ionii electroliilor folosii la precipitare i grupele polare sau ionice ale proteinelor.

-Macromoleculele proteice deshidratate parial, se aglomereaz i precipit. La adugarea unui exces de ap, precipitatul se dizolv, ceea ce dovedete c la precipitarea reversibil, proteinele sufer unele modificri fizico-chimice, dar nu se produce denaturarea structurilor moleculare.

Precipitarea ireversibil -se produce n prezena srurilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Fe, Ni etc.), a acizilor tari (HCl, HNO3, H2SO4), a bazelor alcaline (NaOH, KOH), a acidului picric, sau cu unii acizi anorganici compleci (acid fosfomolibdenic, acid fosfowolframic etc.). -mai poate avea loc la nclzire puternic (coagulare), sub aciunea razelor X, UV, etc. -la ncetarea aciunii agenilor precipitani, proteinele nu revin la forma iniial, deoarece structura spaial a proteinelor (secundar, teriar) sufer o depliere, o dezorganizare, care ns nu afecteaz i structura primar.

Caracterul amfoter al proteinelor -se datoreaz prezenei n molecula lor a gruprilor acide (-COOH) sau bazice (-NH2) libere ale resturilor aminoacizilor dicarboxilici sau diaminici din constituia proteinelor. -Caracterul amfoter al proteinelor este influenat i de resturile unor aminoacizi cu grupri ionizabile (-OH din tiroxin, resturile bazice ale histidinei, argininei). Datorit sarcinilor electrice, proteinele migreaz n cmp electric spre anod n soluie bazic i spre catod n soluie acid. Fenomenul st la baza separrii i purificrii proteinelor prin metoda numit electroforez. -Activitate optica Proteinele prezint activitate optic, datorit att aminoacizilor constitueni care conin atomi de carbon asimetrici, ct i asimetriei ntregului agregat macromolecular. Orice modificare a structurii proteinei este nsoit de schimbarea rotaiei specifice, care indic denaturarea proteinei.

Proprieti chimice ale proteinelor -Proteinele prezint (asemntor aminoacizilor) reacii chimice corespunztoare grupelor funcionale: -NH2 i -COOH libere, precum i reacii ale radicalilor -R pe care i conin. -Sunt caracteristice de asemenea o serie de reacii de culoare, care servesc la identificarea lor (reacia biuretului, reacia xantoproteic, reaciile: Millon, Liebermann, Sakaguchi etc.). Reacia biuretului-culoare violet

Reacia cu ninhidrina

Reactia Millon. HgNO3 in acid azotic cu urme de acid azotos reactioneaza cu tirozina conducand la precipitat rosu.
Reactia xantoproteica. Acidul azotic concentrat reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena. Reactia Hopkins-Cole. Acidul glioxilic (OHC-COOH) in H2SO4 reactioneaza cu triptofanul conducand la un precipitat violet. Reactia Folin-Ciocalteu. Acidul fosfomolibdowolframic reactioneaza cu tirozina rezultand un produs albastru. Reactia Sakaguchi : -naftolul si hipocloritul de sodiu reactioneaza cu arginina conducand la un produs rosu. Reactia Sullivan : sarea de sodiu a acidului 1,2 naftochinon-4-sulfonic si hidrosulfitul de sodiu reactioneaza cu cisteina rezultand un produs rosu.

-Hidroliza Sub influena acizilor, bazelor sau a enzimelor proteolitice catena polipeptidic se scindeaz cu formarea unor fragmente polipeptidice, care n final hidrolizeaz, punnd n libertate toi aminoacizii constitueni.

Denaturarea. -Sub aciunea unor ageni fizici i chimici proteinele sunt modificate structural, cu pstrarea masei moleculare, si pierderea activitii fiziologice. Denaturarea poate fi reversibil sau ireversibil.
-Agenii denaturani pot fi clasificai astfel: ageni fizici: temperaturile ridicate, radiaii UV, razele X, ultrasunetele , etc.; ageni chimici: soluii concentrate de acizi i baze tari, srurile unor metale grele (Hg, Pb, Cd etc.), compui ai arsenului, solveni organici etc. -Denaturarea proteinelor reprezint un proces complex, care implic modificri ale structurii secundare i teriare a proteinelor (desfacerea sau modificarea legturilor de hidrogen, a legturilor disulfurice, ionice etc.), nsoite de deplierea catenelor i modificarea arhitecturii moleculare.

-Denaturarea determin scderea solubilitii i a capacitii proteinelor de a absorbi apa, modific viscozitatea, presiunea osmotic, activitatea optic i gradul de hidroliz, ca i activitatea fiziologic. Denaturarea ireversibil a proteinelor joac un rol important n fenomenele vitale, de exemplu, mbtrnirea seminelor i pierderea capacitii de germinare, fenomenul de mbtrnire la oameni, animale etc.

n industria alimentar denaturarea proteinelor este utilizat la prepararea produselor alimentare prin coacere, uscarea legumelor, fabricarea laptelui praf etc.

Proprieti biochimice ale proteinelor Organismele vii prezint proprietatea specific de a putea sintetiza proteine proprii din aminoacizii preluai prin alimentaie sau rezultai la hidroliza enzimatic a proteinelor alimentare. -Proteinele au proprietatea de a fi organ-specifice, deoarece fiecare organ al aceleiai plante sau al aceluiai animal conine proteine specifice, diferite de proteinele altor organe ale aceluiai individ.

-Proteinele sunt totodat i specie-specifice, deoarece acelai organ de la diferite specii, animale sau vegetale, conine proteine specifice, diferite de ale aceluiai organ al unui individ din alt specie. Specificitatea proteinelor se manifest i prin proprietile lor imunologice: inocularea unei proteine strine n organismul unui animal provoac apariia n serul acestuia a unei substane capabile s precipite numai proteina care a fost inoculat. Substanele inoculate se numesc antigeni i pot fi: proteine, poliglucide, asociaii complexe glucide-lipide-poliprotide, care sunt strine pentru organismul n care au ptruns i declaneaz n consecin biosinteza unor proteine specifice de aprare, denumite anticorpi. Antigenul reacioneaz cu anticorpii formai, determinnd reacia antigen-anticorp, prin care este anihilat aciunea nociv a antigenului. Formarea anticorpilor coincide cu instalarea n organism a unei rezistene specifice (imunitate) fa de agentul patogen. Reaciile imunologice stau la baza preparrii i utilizrii serurilor i vaccinurilor n vederea imunizrii organismelor contra infeciilor microbiene.

Analiza proteinelor
Analiza proteinelor incearca sa studieze modul cum secventele de aminoacizi conduc la o anume structura a proteinei, cum se leaga aceste proteine de substrat sau alte molecule pentru indeplinirea functiilor lor. Analiza proteinelor permite intelegerea rolului functional al acestora pe baza structurii.

Etape in analiza proteinelor Extractia proteinelor. Purificarea proteinelor. Caracterizarea structurala a proteinelor.

1. Extractia proteinelor Implic extragerea eficient a proteinelor i peptidelor ntr-o form biologic activa din esut sau celulele microbiene. n timpul acestui proces, inactivarea enzimelor proteolitice (cele care scindeaza proteinele) este necesar ca s nu provoace degradarea proteinelor coninute n esut. Extractia proteinelor: se omogenizeaza tesutul in solutie tampon fiziologica (0.05M NaH2PO4, pH 7.4) in prezenta de inhibitori proteolitici (EDTA, Pepstatina).
Extractia

peptidelor: se fierbe tesutul cu solutie de acid acetic 1m timp de 5 min apoi se omogenizeaza tesutul in solutie etanol:sol. HCl 0.1M la 0C. Acest lucru va duce la deschiderea veziculelor si trecerea peptidelor in solutie.
Pepstatina Isovaleril-Val-Val-AAHMH-Ala-AAHMH unde AAHMH= acid (3S, 4S)-4-amino-3-hidroxi6-metil-heptanoic

2. Purificareaa proteinelor
Proteinele pot fi purificate avand in vedere proprietatile lor fizico-chimice. Aceste proprietati au condus la dezvoltarea unor tehnici specifice.

Proprietatea proteinelor
Solubilitate Marimea moleculei

Tehnica de purificare
Precipitare fractionata Cromatografia de excluziune molecular (de gel permeabil sau de filtrare cu gel). Cromatografia de schimb ionic HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa

Sarcina electrica a moleculei Hidrofobicitate

Activitate biologica

Cromatografie de afinitate

Precipitare diferentiata -se realizeaza prin adaos de saruri anorganice sau de solventi organici. Cel mai des se utilizeaza sulfatul de amoniu. -precipitatul obtinut se separa prin centrifugare; -cresterea concentratiei de sare conduce la cresterea cantitatii de precipitat.
Cromatografia de excluziune molecular (de gel permeabil sau de filtrare cu gel). -se realizeaza pe o coloana umpluta cu gel poros. Aceast tehnic separ moleculele dup mrimea moleculelor. Moleculele mici intra in gel in timp ce moleculele de dimensiuni mari raman in spatiile dintre particulele de gel si elueaza primele. Avantaje: permite separarea unor cantitati mari de proteine; Dezavantaje: -are o rezolutie de separare scazuta.

Cromatografia de schimb ionic Separa moleculele de proteine pe baza sarcinii electrice. -umplutura coloanei este incarcata electric la randul sau fie cu sarcini pozitive (dietilaminoceluloza), fie negative (carboximetilceluloza). -umplutura utilizata difera in functie de incarcarea electrica a proteinei ce se doreste a fi separata. De exemplu daca proteina de interes este incarcata negativ se utilizeaza o umpluta incarcata pozitiv (dietilaminoceluloza ). Proteina se va lega de centrii cationici ai umpluturii. Ea este apoi pusa in libertate prin utilizarea unei solutii saline (de obicei de NaCl), cand anionii de Clse leaga de centrii cationici iar proteina este eliberata. -modificarea incarcarii electrice a proteinei se poate realiza si prin utilizarea unor solutii cu pH diferit.

HPLC (cromatografie de lichide de inalta performanta) in faza inversa Aceasta tehnica purifica proteinele pe baza hidrofobicitatii lor. Faza inversa este o forma de cromatografie in care faza stationara este hidrofoba iar faza mobila este mult mai hidrofila decat faza stationara. Solutia de proteine este introdusa intr-o coloana ce contine silice substituita cu lanturi lungi de hidrocarbura (octacetil, butil, propil, fenildimetil). Grupele hidrofobe ale proteinelor se vor lega de umplutura. Proteinele hidrofile vor elua primele. Solventii utilizati: Apa+ 0.1% Acid trifluoracetic, acetonitril.

Cromatografia de afinitate -este cea mai performanta metoda de purificare a proteinelor -are avantajul unei afinitati ridicate a multor proteine pentru o molecula sau grupare chimica specifica. Exemplu: Concavalina A este o proteina care se leaga de obicei de un rest de glucoza. Ea poatge fi purificata prin trecerea pe o coloana ce are ca umplutura un polimer sintetic substituit cu resturi de glucoza. Concavalina A se leaga de umplutura in timp ce alte proteine nu. Prin eluarea cu o solutie de glucoza se poate separa concavalina A in stare pura.