Biocataliza

Istoria biotehnologiei
Dezvoltarea unor domenii ca biologia sau microbiologia, biochimia,
enzimologia i genetica precum i necesitatea aplicrii n practic a noilor
cunotine dobndite au condus la apariia i dezvoltarea unei noi tiinte cunoscute
astzi sub numele generic de biotehnologie.
nc de la nceputuri, datorit caracterului su complex i multidisciplinar,
biotehnologia a creat o serie de dificulti n definirea i localizarea sa ca tiin de
sine stttoare. Astfel, dei oamenii au utilizat nc din cele mai vechi timpuri
organismele vii n sinteza i obinerea de produse sau servicii, noiunea de
biotehnologie este de dat recent, mai precis din 1910 cnd termenul a fost
utilizat pentru prima dat de Thomas H. Morgan. Din punct de vedere etimologic,
cuvntul i are originea n limba greac i este compus din trei termeni: bios =
via, technos = tehnic i logos = tiin, astfel c nelesul imediat al
biotehnologiei este acela de tiin a folosirii vieii.
O alt manier de a privi biotehnologia este ca tiina ce utilizeaz materia
vie n scopul degradrii unor produse sau producerii unor materiale i procese de
interes specific.
Dei n literatur exist numeroase definiii, totui o prim definiie
complet a biotehnologiei a fost enunat n 1978 de ctre Federaia European de
Biotehnologie conform creia biotehnologia reprezint integrarea tiinelor naturii
i inginereti n scopul realizrii unor aplicaii ale organismelor, celulelor i
componentelor acestora precum i ale unor analogi moleculari n obinerea de
produse i servicii. Ulterior,

Convenia Naiunilor Unite vine i comleteaz

aceast definiie afirmnd c orice aplicaie tehnologic ce utilizeaz sisteme

biologice, organisme vii sau derivate ale acestora pentru a crea sau modifica
produse sau procese bine determinate poart numele de biotehnologie.
1

O parte vast i extrem de important a biotehnologiei se concentreaz

asupra domeniului biocatalizei. Ca definiie general, biocataliza poate fi privit ca
procesul de utilizare a moleculelor biologice (n special a enzimelor) pentru a
cataliza diverse reacii chimice. n cadrul acestui proces de cataliz se pot utiliza
enzime ntrapate n celule vii, enzime izolate sau enzime sintetizate artificial.
Ca i n cazul biotehnologiei, apariia termenului de biocataliz este una
relativ recent, datnd din a doua jumatate a secolului XX. Cu toate acestea,
biocataliza ii are rdcinile nc din antichitate cnd omenirea utiliza n mod
incontient ns organisme vii (ndeosebi microorganisme) n obinerea de
produse alimentare (pine, brnz), buturi (bere, vin, oet) i produse vestimentare
(esturi, n tratarea pielii). Dovezi scrise din secolele II-I .e.n. arat c
babilonienii i sumerienii utilizau orzul i ovzul pentru obinerea buturilor
alcoolice. De asemenea, n Egiptul antic se utiliza maia pentru prepararea pinii, iar
vechii greci produceau brnz sau iaurt folosind cheag din stomac de capr sau
oaie. n Europa primele produse obinute prin fermentaie, e.g. produse lactate,
dateaz n jurul anilor 800 .e.n., iar primul compus chimic pur sintetizat prin
biocataliz a fost etanolul, n secolul al XIV-lea. Bioetanolul obinut avea rolul de a
fortifia buturile alcoolice.
n pofida multitudinii proceselor fermentative existente, nimeni nu a reuit
ns s explice natura mecanismelor ce stteau la baza acestor procese de
fermentaie. Un prim pas n nelegerea reaciilor de biocataliz dar i n
dezvolatrea biocatalizei ca domeniu a fost fcut abia n anul 1814 de Kirchhoff.
Acesta a observat c o anumit component glutinoas a grului este capabil s
transforme amidonul ntr-un zahr solubil, cu numele de maltoz.
Un alt punct de referin n dezvoltarea biocatalizei a fost atins n 1830
cnd Payen i Persoz reuesc s izoleze, prin precipitare cu etanol, prima enzima,
amilaza. Enzima se prezenta sub forma unei publeri albe i avea capacitatea de a
hidroliza amidonul pn la stadiul de dextrin i zahr. Munca celor doi a fost

aprofundat apoi de Berzelius, care n 1835 recunoate caracterul catalitic al

reaciei de hidroliza a amidonului sub aciunea diastazei.
Anul 1857 este dedicat lui Louis Pasteur ce evideniaz rolul
microorganismelor n natur i pune bazele microbiologiei contemporane. Acesta
demonstreaz c transformarea amidonului n zahr i apoi n etanol se face printrun proces de fermentaie sub aciunea drojdiei. De asemenea, Pasteur evideniaz
faptul c alterarea ulterioar a buturilor alcoolice are loc prin reducerea etanolui la
acid acetic sub aciunea microorganismelor. Pasteur pune astfel bazele procesului
de pasteurizare prin care bacteriile existente n mediu sunt distruse fr a afecta
ns gustul buturilor.
Un an important a fost i 1874 cnd Christian Hansen pune bazele
companiei Christian Hensens Laboratory n Copenhaga, Danemarca, ce avea ca
domeniu de activitate comercializarea preparatelor enzimatice, n special a
cheagurilor pentru producia de produse lactate.
Dei se cunoteau deja circa 10 compui cu activitate catalitic enzimatic,
abia n 1878 Khne atribuie acestei clase de substane, denumirea de enzime.
Esenial n dezvoltarea domeniului biocatalizei a fost i anul 1894 cnd
Emil Ficher, dup o lung investigare a proceselor enzimatice, elaboreaz aa
numitul mecanism lact-cheie (Figura 1). Acest mecanism unic de asamblare
fcea ca procesele enzimatice s se caracterizere printr-un grad foarte nalt de
selectivitate.

Figura 1. Modelul enzimatic de asamblare lact-cheie

Dei era convins c enzimele sunt de fapt proteine i ii dedic urmtorii
ani cercetrii acestui fapt, Ficher nu a reuit s demontreze pn la sfritul carierei
sale structura proteic a compuilor enzimatici. Dovada a fost adus abia n 1926
3

cnd Summer reuete s cristalizeze o serie de enzime (ureaza, tripsina) i

evideniaz structura proteic a acestora.
Anii

urmtori

aduc

alte

progrese

semnificative

domeniul

biotehnologiilor:
are loc perfecionarea tehnologiilor de fermentaie;
se dezvolt procesele de obinere a etanolului, acidului acetic,
acetonei, etc. catalizate de microorganisme;
se dezvolt procesele de fermentaie pentru tratamentul apelor
reziduale i a deeurilor solide;
sunt descoperite vaccinurile i legile lui Mendel.
astfel c n zilele noastre biotehnologia este promovat ca o tehnologie
curat, prietenoas cu mediul fcnd ca atenia cercettorilor s se ndreapt din ce
n ce mai mult spre acest domeniu de activitate. Datorit avantajelor pe care le
prezint, procesele catalizate de enzime nlocuiesc tot mai mult procesele chimice
clasice, iar domeniile de aplicabilitate ale biocatalizei au devenit tot mai diverese n
ultimile decenii, de la industria alimentar i farmaceutic la industria textil i de
pielrie i la obinerea de produse papetare sau detergeni. Una dintre cele mai
importante caracteristici ale enzimelor o reprezint capacitatea acestora de a
deosebi ntre compuii enantiomerici, cataliza enzimatic prezintnd astfel un mare
interes n sinteza de compui chiralici, mai ales n preparearea unor medicamente
sau n obinerea de coloane de separare i purificare a moleculelor bioactive.
Pentru a ne putea forma o mai bun privire de ansamblu asupra domeniilor
enzimologiei i biocatalizei, dar i pentru a percepe ct mai corect rolul acestor
dou domenii n sinteza compuilor organici, n industria farmaceutic sau n
industria

biomedical,

este

necesar

mai

inti

prezentarea

succint

caracteristicilor i avantajelor pe care un biocatalizator le prezint. n continuare se

face o trecere n revist a principalelor caracteristici ale enzimelor ncepnd cu
definirea i clasificarea lor, trecnd la evidenierea modului de aciune al
biocatalizatorilor i finaliznd cu evoluia biocatalizei de la utilizarea enzimelor n
4

stare nativ drept catalizatori i pn la utilizarea lor sub form imobilizat pe

diverse suporturi organici i anorganice.
Enzime definire i caracteristici generale
Enzimele sunt substane chimice complexe de natur proteic, sintetizate
din plante, animale sau microorganisme, care posed capacitatea de a mri viteza
de reacie a proceselor chimice ce au loc n sistemele biologice. Acestea constituie
o clas special de proteinelor ce prezint activitate catalitic purtnd i denumirea
de biocatalizatori.
Originea cuvntului enzim se regsete n limba greac, en zima
nsemnnd n levur sau n drojdie. De fapt termenul de enzim a fost introdus
pentru prima dat de ctre Khne n anul 1878 deoarece primii compui enzimatici
au fost izolai din drojdii.
Dup cum am menionat i anterior procesele enzimatice au fost utilizate
nc din cele mai vechi timpuri ns bazele biocatalizei au fost puse abia n secolele
XIXXX, odat cu identificarea i izolarea primelor enzime. O trecere n revist a
principalelor momente de-a lungul istoriei n ceea ce privete cataliza enzimatic
este ilustrat n Tabelul 1.
Tabel 1. Principalele descoperiri n domeniul biocatalizei
1680

- van Leeuwenhoeck observ la microscop celulele drojdiei de bere

1789

- Lavoisier face un bilan de materiale i demonstreazc c O2, H2 i C

din zahr se regsesc i n alcoolul i CO 2 ce iau natere n urma

1814

fermentaiei

1831

- Kirchhoff izoleaz amilaza din mal

1835

- Leuchs izoleaz amilaza din saliva

- Berzelius demonstreaz c hidroliza amidonului la dextrin i zahr

1936

este catalizat de diastaz

1838

- Schwann izoleaza pepsina

5

1857

- Ktzing atribuie fermentaia alcoolic celulelor vegetale din drojdie

1878

- elaborarea procesului de pasteurizare de ctre Pasteur

1894

- Khne intoduce pentru prima dat termenul de enzima

1926

- Emil Ficher elaboreaz modelul enzimatic lact-cheie

- Summer demonstreaz structura proteic a enzimelor
Anii urmtori se caracterizeaz prin progrese semnificative n domeniile

biotehnologice, n special n biocataliz. Proprietile speciale ale enzimelor, (e.g.

selectivitatea ridicat, specificitatea) au condus la un interes tot mai crescut din
partea cercettorilor, astfel c n ultimile decenii s-a incercat nlocuirea tot mai
intens a catalizatorilor clasici din chimia organic cu biocatalizatori enzimatici sau
microorganisme.
Caracteristicile enzimelor se datoreaz n special structurii proteice pe care
acestea o prezint, cu un grad nalt de organizare pe patru nivele. Astfel, fiecare
enzim prezint:

structura primar;

structura secundar;

structura teriar;

structura cuaternar.

Structura primar este dat de secvena aminoacizilor n catenele

polipeptidice fundamentale, iar structurile secundar, teriar i cuaternar sunt
determinate de modul de aranjare n spaiu i de asociere a catenelor polipeptidice
ntre ele.
De asemenea, un numr foarte mare de enzime prezint o structur binar
fiind formate dintr-o component proteic apoenzima i o structur neproteic,
cunoscut sub numele generic de cofactor. n funcie de modalitatea de legare a
componentelor neproteice la gruprile proteice, exist dou categorii de cofactori:
- coenzimele ce sunt compui organici care se ataeaz temporar
la apoenzim prin legturi necovalente;
6

- gruprile prostetice compuii organici ce se leag de gruparea

proteic prin legturi covalente.
O categorie special a gruprilor neproteice o reprezint ionii metalici.
Acetia sunt indispensabili n exercitarea funciei catalitice i fie joac rolul de
cofactor fie fac parte din structura enzimelor.
Enzimele care prezint n structura lor doar lanuri polipeptidice simple
poart demnumirea de holoproteine, iar enzimele ce sunt alctuite att dintr-o
grupare proteic ct i o component neproteic, sunt cunoscute sub numele de
heteroproteine.
Principalele caracteristici pe care o enzim le ndeplinete sunt ilustrate n
figura 2

Figura 2. Caracteristicile enzimelor

Clasificarea enzimelor
Progresele dobndite n enzimoligie i biocataliz au condus la o cretere
exponenial a numrului de enzime disponibile comercial i o dat cu aceasta s-a
simit nevoia unei clasificri mai riguroase a acestor tipuri de compui. O prim
7

ncercare de clasificare s-a realizat n 1953 cnd Hpffmann Ostenhof propune

gruparea enzimelor n cinci clase distincte, astfel:
1. hidrolaze;
2. transferaze;
3. oxido-reductaze;
4. liaze i simpetaze;
5. izomeraze i racemaze.
n prezent se utilizeaz clasificarea propus de Comisia de Enzimologie a
Uniunii Internaionale de Biochimie, care n 1961 mparte compuii enzimatici n
ase mari clase, n funcie de tipul i mecanismul reaciei catalizate.
n funcie de tipul de reacie se pot distinge urmtoarele categorii:
1. Oxido-reductaze: sunt enzime ce prezint capacitatea de a cataliza
reaciile de oxido-reducere din mecanismele vii:
2. Transferaze: enzimele ce catalizeaz reaciile de transfer ale unor atomi
sau grupe de atomi de la un substrat la altul:

3. Hidrolaze: enzime ce catalizeaz reaciile de scindare a legturilor

covalente din moleculele substratului (scindarea se realizeaz cu participarea
moleculelor de ap):

4. Liaze: catalizeaz reaciile de adiie a unor atomi sau grupe de atomi la

moleculele substratului:

5. Izomeraze: au rolul de a cataliza diverse reacii de izomerizare a

substraturilor:

6. Ligaze sau sintetaze: enzimele ce catalizeaz reaciile de formare a unor

noi legturi CC sau Cheteroatom.

Fiecare din aceste clase se mparte n subclase i sub subclase, n funcie de

tipul legturii asupra crei acioneaz, n funcie de natura cofactorului (n cazul

heteroproteinelor) i a mecanismului de reacie. O prezentare a fiecrei clase cu

subclasele aferente precum i o cteva exemple este ilustrat mai jos (Schema 1).

Schema 1. Clasificarea enzimelor pe clase i subclase

Mencanismul de reacie al enzimelor
Modul de aciune al compuilor enzimatici este similar cu cel al tuturor
catalizatorilor, atfel c i acestea trebuie s ndeplineasc trei condiii eseniale:
- s intervin doar n reaciile posibile din punct de vedere
termodinamic;
- s micoreze timpul necesar atingerii echilibrului de reacie ns s
nu modifice echilibrul reaciei;
- s nu se consume n timpul reaciei i s se poat recupera la
sfritul procesului catalizat.
Totui, pe lng aceste caracteristici comune tuturor catalizatorilor,
enzimele posed i o serie proprieti speciale:
10

- au o structur proteic ce le confer un grad nalt de specificitate;

- prezint capacitatea de a deosebi ntre compuii optic activ
cataliza enzimatic se utilizeaz n obinerea compuilor chiralici;
- activitatea enzimatic este supus unui control, acest lucru avnd
rol esenial n reglarea metabolismului celular;
- prezint capacitatea de a micora energia de activare a unei reacii
conducnd la viteze de reacie mari (mult mai mari ca n cazul catalizatorilor
clasici).
n mod normal pentru ca o reacie chimic s se desfoare este necesar ca
reactanii s fie activai. n sintezele organice activarea compuilor se face
ndeosebi prin ridicarea temperaturii de reacie, ns acest lucru nu este posibil i n
lumea vie. Astfel, n cazul organismelor vii utilitatea temperaturii ca adjuvant al
reaciilor chimice este una limitat deoarece majoritatea organismelor prezint o
temperatur de aproximativ 37 C. n aceste condiii, capacitatea enzimelor de a a
micora energia de activare a unei reacii la temperatur ambiant este esenial.
Cataliza enzimatic permite interacia moleculelor ce n mod normal nu ar
reaciona la temperaturi joase i mrete vitezele de reacie n metabolismul celular.
Modul n care o enzim acioneaz asupra unei reacii chimice precum i
determinarea vitezei de reacie i stabilirea afinitii dintre centrul activ al enzimei
i substrat pot fi explicate printr-o serie de studii cinetice. Deoarece simpla
calculare a vitezei de reacie nu relev mecanismul prin care reacia se desfoar
i nici stoechiometria acesteia, a fost nevoie de introducerea unei ecuaii care s
fac legtura ntre viteza iniial a reaciei chimice i concentraia reactanilor.
Dei cazurile enzimelor cu un singur substrat sunt destul de rare, cea mai simpl
modalitate de a nelege cinetica enzimatic este de a trata i a stabili o ecuaie
pentru enzimele monomerice. Viteza de reacie pentru acest tip de sistem este
calculat cu ajutorul urmtoarei ecuaii:
v

d S
dt

d P

11

dt

k S

Unde: [S] = concentraia substratului; [P] = concentraia de produs; t = timpul de

reacie; k = constanta de vitez; n = ordinul de reacie.
Pentru reaciile cu un singur substrat la care se menine constant
concentraia de enzim, viteza de reacie crete odat cu mrirea concentraiei de
substrat, pn la atingerea unui prag maxim al concentraiei. Dup acest prag orict
de mult s-ar mri cantitatea de substrat din sistem, aceasta nu va mai influena
viteza de reacie. Putem astfel observa dou tipuri de reacii:

reacii de ordin I, cnd viteza de reacie este dependent de

concentraia substratului (n cazul concentraiilor mici de substrat);

reacii de ordin 0 viteza de reacie este independent de

concentraia substratului (pentru concentraii mari de substrat).

Cele doua tipuri de reacii enzimatice precum i ecuaiile aferente utilizate pentru
determinarea vitezelor de reaciile sunt ilustrate n figura 3:

Figura 3. Cinetica reaciilor de ordin 0 i de ordin I

Studiind cinetica enzimatic, Michaelis i Menten propun n 1913
urmtorul mecanism pentru reaciile cu un singur substrat (Figura 3).

Figura 3. Mecanismul de aciune al enzimelor

12

Dup cum se poate observa mecanismul de reacie se desfoar n dou

etape. ntr-o prim etap enzima reacioneaz cu substratul corespunztor formnd
un complex activat, instabil, enzim-substrat (E-S). Specific acestei etape este
interacia reversibil dintre enzim i substrat, astfel c o oarecare parte din
complexul activat trece napoi n compuii de reacie. Totui, prin scderea energiei
de activare, echilibrul reaciei este deplasat spre dreapta iar cea mai mare parte a
complexului binar se transform n produi de reacie, enzima putnd fi recuperat
i utilizat ntr-un nou ciclu catalitic.

Imobilizarea de enzime
Ultimile decenii au adus un progres considerabil n domeniile biocatalizei i
enzimologiei astfel c astzi exist un numr de cteva sute de enzime disponibile
comercial, cu o palet foarte variat de aplicaii: de la industria alimentar la cea
textil i de pielrie i la industria detergenilor; de la industria chimic i
biochimic la domeniul biomedical, biotehnologic sau farmaceutic. i dei tendina
ultimilor ani a fost aceea de a nlocui tot mai mult catalizatorii organici obinuii cu
biocatalizatori, utilizarea enzimelor la nivel industrial este totui limitat de o serie
de impedimente. Dezavantajele utilizrii enzimelor n stare nativ sunt: (1)
sensibilitatea enzimelor la factorii externi, (2) dificultatea recuperrii enzimelor la
sfritul reaciei catalizate; (3) costuri ridicate pentru adaptarea instalaiei de lucru
n vederea folosirii biocatalizatorilor.
Deoarece marea majoritate a enzimelor prezint instabilitate la condiiile de
lucru (temperatur ridicat, variaii de pH, prezena de solveni organici sau ali
ageni de denaturare) s-au dezvoltat o serie de noi tehnici prin care se ncearc
mrirea stabilitii biocatalizatorilor i depirea acestor neajunsuri. Dintre aceste
metode menionm:

Adugarea de aditivi;

Modificarea chimic;

Ingineria proteinelor;
13

Imobilizarea de enzime.

n cele ce urmeaz capitotul de fa se va axa pe metoda imobilizrii de

enzime trecnd n revist definirea i clafisicarea tehnicilor de imobilizare, pentru
ca n final s se ilustreze cteva aplicaii la care se preteaz imobilizatele.
Definirea i caracteristicile imobilizarii de enzime
Imobilizarea biomoleculelor reprezint procesul de legare fizic sau
chimic a compuilor enzimatici pe suporturi insolubile, cu pstrarea capacitii
catalitice. Scopul procesului este de a mri stabilitatea enzimelor la condiiile de
lucru fr a afecta ns capacitatea enzimatic a acestora.
ns deoarece legarea la suport are drept consecin limitarea mobilitii
enzimelor,
De cele mai multe ori procesul de imobilizare conduce i la modificri ale
parametrilor reaciei catalizate. Astfel, pot s apar modificri ale vitezei de reacie
i a constantei de vitez, schimbri ale efectului inhibitorilor asupra reaciei
enzimatice i nu n ultimul rnd pot surveni varieri ale temperaturi optime de lucru
i/sau a pH-ului optim. Pe lng acestea, metoda de imobilizare poate afecta i
conformaia enzimelor conducnd la o form inactiv a acestora i la pierderea
activitii catalitice. n funcie de aplicaiile ulterioare, este esenial de gsit metoda
adecvat de imobilizare pentru a nu bloca centru activ al biocatalizatorilor i n
final a estompa caracterul lor catalitic.
Att gradul ct i natura acestor schimbri depind nu numai de metoda de
imobilizare aleas ci i de natura reaciei chimice ce urmeaz a fi catalizat.
Cerinele pe care un sistem enzim-substrat trebuie s le ndeplineasc
pentru a fi eficient sunt:
-

s fie rezistente la desprindere, desorbie;

s permit o bun accesibilitate analiilor chimici la centri activi;

s fie stabile la variaii de temperatur;

s fie stabile la valori extreme ale pH-ului;

14

s prezinte stabilitate n timp;

s aib activitate enzimatic ridicat;

s prezinte o densitate mare a biomoleculelor imobilizate;

s rspund rapid n timp.

Imobilizarea enzimelor pe suporturi insolubile conduce ns i la modificri

ai parametrilor reaciilor catalizate. Spre exemplu pot aprea modificri ale vitezei
de reacie sau a constantei de vitez pentru un proces dat, pot s apar varieri ale
temperaturii optime de reacie i bienneles modificri ale pH-ului optim. Aceste
modificri depind nu numai de metoda de imobilizare aleas ci i de natura reac iei
ce urmeaz a fi catalizat.
Trebuie menionat de asemenea c procesele de imobilizare pot conduce i
la modificri ale conformaiilor enzimelor ce pot determina pierderea capacitii
catalitice a acestora.
Toate aceste considerente trebuie luate n calcul nainte de a opta pentru o
anumit metod de imobilizare. De asemenea foarte important este de stabilit cu
exactitate domeniul de aplicabilitate a imobilizatelor.
Indiferent de metoda de imobilizare orice sistem enzim-substrat prezint
dou funcii, o funcie noncatalitic ce caracterizeaz substratul i o funcie
catalitic specific enzimei.
Funcia noncatalitic a unui complex enzimatic depinde de natura
suportului pe care enzima este imobilizat. Pentru ca un suport s fie considerat
bun, acesta trebuie s ndeplineasc o serie de proprieti:
-

permeabilitate;

regenerabilitate;

insolubilitate;

rezisten la atac microbian;

rigiditate ridicat;

stabilitate chimic;

stabilitate mecanic i termic;

15

hidrofilie.

Caracteristicile enzimelor ce determin funcia catalitic a unui sistem

enzimatic constau n:
-

activitate catalitic ridicat;

selectivitate crescut;

specificitate nalt n ceea ce privete substratul;

stabilitate la diveri solveni (n special organici);

termostabilitate;

stabilitate conformaionl.

Dei exist i o serie de dezavantaje precum costul ridicat al proceselor de

imobilizare sau riscul pierderii capacitii catalitice a enzimelor n urma legrii pe
suport, avantajele metodelor de imobilizare sunt numeroase:
-

separarea uoar a enzimelor la finalul reaciei catalitice prin

centrifugare sau filtrare;

reutilizarea enzimelor dup separarea din sistem ntr-un numr

ridicat de cicluri catalitice (cu aceeai cantitate de enzim poate
fi transformat o mare cantitate de substrat);

enzima nu se mai gsete n produs, eliminndu-se astfel faza de

inactivare termic a enzimei;

creterea stabilitii enzimelor ce permite desfurarea reaciilor

catalitice la temperaturi ridicate sau valori extreme de pH;

rezisten sporit la inhibitorii naturali i de sintez ai enzimelor

precum i la aciunea inhibitoare a unor metale grele.

Se cunosc trei metode generale de imobilizare a enzimelor prezentate n

figura urmtoare:
I.

Legarea pe suport

1. Adsorbia pe suporturi solide

16

Adsorbia reprezint cel mai simlu procedeu de imobilizare a unei enzime.

Procesul const n ataarea pe suport a unei enzime prin legturi fizice de tipul:
legturi de hidrogen, legturi Van der Waals, interacii hidrofobe.
n cazul adsorbiei interaciile ce apar ntre suport i enzim depind de
natura suprafeei suportului i de tipul aminoacizilor existeni pe suprafaa
moleculei enzimatice.
Metoda este una extrem de simpl i const n prepararea unei soluii
apoase n care este dizolvat enzima i n care este imersat n final suportul solid.
Sistemul obinut este agitat un anumit timp la temperatura camerei pentru
definitivarea procesului de imobilizare, iar la finalul procesului, excesul de enzim
este ndeprtat prin splare cu ap.
Principalele avantaje ale adsorbiei constau: n simplitatea metodei de
imobilizare, suportul nu necesit activarea sa n prealabil; metoda are un efect
minor asupra conformaiei enzimei i activitii catalitice; metoda ofer
posibilitatea regenerrii enzimei inactive prin adugarea unei cantitii proaspete de
enzim nativ.
Dezavantajul major al metodei const n aceea c adsorbia are loc doar n
straturile superficiale ale suporturilor, zona intern a acestora nefiind utilizat,
acest lucru conducnd la o activitate specific redus a acestui tip de suporturi.
Pentru a rezolva acest neajuns suporturile sunt deseori mrunite cu scopul de a
mri suprafaa specific i implicit cantitatea de enzim prins pe suport. Trebuie
inut cont ns c procesul de mrunire poate cauza colmatarea rapid a
instalaiilor de lucru i de asemenea poate impiedica prelucrarea soluiilor vscoase
de substrat.
O alt deficien a metodei o reprezint faptul c legturile stabilite ntre
enzim i adsorbant sunt slabe, reversibile motiv pentru care enzima se poate
desprinde foarte uor de suport, n momente cheie ale reaiei. Aceste procese de
desorbie pot fi provocate fie de fluctuaii ale temperaturii, fie
respectiv ale triei ionice.
17

ale pH-ului,

Dac suportul este ncrcat electrostatic, vecintatea electric a moleculelor

de enzim se schimb i are ca rezultat modificarea pH-ului optim de aciune.
Acest lucru conduce de cele mai multe ori la mrirea stabilitii n timp, a
termostabilitii i la sporirea enzimelor proteolitice.
Pentru ca un suport s poat fi utilizat ca adsorbant, el trebuie s se
caracterizeze prin:
-

Porozitate;

Rezisten mecanic;

O anumit distribuie a porilor;

Polaritate la suprafa;

Siturile de legare s fie accesibile din punct de vedere steric;

O anumit ditribuie a sarcinilor electrostatice.

Majoritatea materialelor suport disponibile prezint proprieti de suprafa

adecvate pentru a putea fi utilizate n procesul de adsorbie. Dintre acestea
amintim:
-

Suporturi anorganice: materiale ceramice, kaolin, crbune activ,

bentonit, sticl poroas, alumin;

Suporturi organice sintetice: polistiren, nylon, rini sintetice;

Suporturi organice naturale: amidon, celuloz, gelatin,

dextran, chitosan.

2. Legarea ionic
Imobilizarea enzimatic prin legare ionic se bazeaz pe stabilirea de
interacii ionice ntre moleculele de enzim i suprafaa suportului. Cantitatea ce
poate fi legat precum i activitatea enzimei dup imobilizare depind exclusiv de
natura suportului.
Procesul de imobilizare prin legare ionic este identic cu el al adsorbiei
fizice: se prepar o soluie de concentraie cunoscut de enzim n care se introduce
o cantitate prestabilit de suport. Amestecul este agitat la temperatura camerei
pentru un anumit timp, dup care excesul de enzim este ndeprtat prin splare.
18

Similar cu legarea fizic, imobilizarea ionic depinde de pH, concentraia de

enzim, temperatur i/sau natura suprafeei suportului.
De asemenea ca i n cazul adsorbiei, fixarea ionic nu conduce la
modificri majore ale conformaiei enzimelor rezultnd n formarea unor sisteme
enzimatice cu puternic activitate enzimatic.
O alt asemnare ntre metode este conferit de rezistena relativ sczut a
legturilor ionice la modificri de mediu. Dei interaciile ionice sunt mai puternice
comparativ cu cele fizice stabilite n timpul adsorbiei, orice modificare a pH-ului
sau a triei ionice n sistem are drept consecin ruperea legturilor dintre suport i
moleculele de enzim.
Un alt dezavantaj este dat i de posibila prezen a altor ioni n masa de
reacie, ioni ce pot interveni n timpul procesului reacionnd cu enzimele i
blocnd centri activi ai acestora.
Materialele uzuale folosite n sinteza de suporturi ionice sunt:
-

Materiale anorganice: ambertit, alumina, bentonit, silica gel,

silicai;

Polimeri sintetici: derivai ai polistirenului, poli (alcool vinilic)

i derivai ai acestuia;

Polimeri naturali: derivai ai polizaharidelor (ex. chitosan,

dextran), derivai de celuloz (ex. carboximetil celuloz, dietil
aminometil celuloz).

3. Legarea covalent
Legarea covalent reprezint una dintre cele mai utilizate metode de
imobilizare a biocatalizatorilor. Procesul const n formarea unor legturi chimice
ntre enzim i suport, mai exact ntre grupele funcionale prezente pe suprafaa
suportului i grupele funcionale, terminale sau de pe catenele laterale, prezente la
suprafaa moleculelor de enzime.

19

Deoarece ntre cele dou componete se formeaz legturi chimice

puternice, n legarea covalent procesul de desprindere este foarte rar ntlnit i
numai n condiii foarte dure de lucru.
n ceea ce privete procesul de imobilizare, spre deosebire de legarea fizic
i cea ionic, legarea covalent poate presupune i o etap suplimentar de activare
a suportului. Etapa de activare se realizeaz prin grefarea pe suprafaa materialului
a unor grupe reactive ce prezint capacitatea de reaciona cu grupele funcionale ale
aminoacizilor de la suprafaa enzimelor.
Putem astfel spune c imobilizarea chimic poate avea loc fie ntr-o singur
etap, atunci cnd pe suprafaa suportului se gasesc grupe reactive capabile de a
reaciona cu enzimele, fie n dou etape, cnd o reacie de activare prin introducere
de grupe funcionale este necesar.
n cazul realizrii unui intermediar ce activeaz suportul, acesta joac i un
rol de spaiator oferind avantajul asigurrii unei mobiliti mai bune a enzimei.
Astfel, legarea covalent cu spaitor afecteaz mai puin conformaia enzimelor
asigurnd n final pstrarea proprietilor catalitice ale acestora.
Dintre grupele funcionale utilizate n legarea covalent a enzimelor se pot
aminti:
-

Grupa carbonilic;

Grupa cetonica;

Grupa formil;

Grupa sulfhidril (din resturile de cistein);

Grupa amino;

Grupa hidroxil;

Grupa diazo;

Grupa carbodiimidica.

Primele materiale utilizate ca suporturi n legarea covalent dateaz din

1949 cnd Michael i Ewers utilizeaz derivai celulozici n imobilizarea unor
proteine.
20

n zilele noastre o gam foarte variat de materiale poate fi utilizat n

obinerea de suporturi enzimatice. Unele dintre cele mai utizate materiale sunt
polimerii naturali deoarece acetia se caracterizeaz printr-o hidrofilie ridicat
datorat grupelor hidroxilice prezente n structur ce sunt ideale n interaciile
covalente. Totui, n funcie de aplicabilitate lor i de natura enzimei imobilizate, se
pot utiliza si o serie de materiale anorgnice sau materiale pe baz de polimeri
sintetici.
Suporturi anorganice
Majoritatea materialelor anogranice (cuar, sticl poroas, alumina, silicai,
kaolin) poate fi utilizat n imobilizarea covalent, ns este necesar activarea
acestora n prealabil. Cel mai cunoscut procedeu de activare l reprezint procesul
de silanizare a suporturilor anorganice conform reaciei:
Suporturi pe baz de polimeri sintetici
Pentru ca un polimer sintetic s poate fi utilizat ca suport pentru
imobilizarea de enzime acesta trebuie s:
-

Fie rezistent la aciunea microbian;

S poate fi utilizat sub diverse forme (particule, filme);

S prezinte rezisten mecanic;

S prezinte reactivitate chimic;

S aib un pre de cost sczut.

ntre compuii macromoleculi sintetici cel mai indicat material s-a dovedit a
fi nylon-ul. Acesta poate interaciona cu grupele funcionale ale enzimelor fie prin
gruparea carboxil fie prin gruparea amino prezente pe lan.
Ca alte materiale putem meniona:
-

Derivai ai polistirenului;

Compui acrilici i metactilici respectiv derivai ai acestora;

Poli acrilamida.

Suporturi pe baz de polimeri naturali

21

Cele mai utilizate suporturi naturale sunt cele pe baz de polizaharide:

-

Celuloz i derivai de celuloz;

Amidon i derivai ai acestuia;

Alginat;

Dextran i derivai ai acestuia;

Agaroz.

De asemenea, colagenul s-a dovedit a fi un suport ideal n legarea

covalent. Datorit caracterului su hidrofil i prezenei pe lan a unei mari
densiti de grupe reactive, colagenul se preteaz la procesele de imobilizare ca
atare sau poate fi modificat chimic pentru a-i crete rezistena mecanic i apoi
utilizat. Un alt avantaj l costituie i abundena sa n natur ceea ce l face uor de
procurat i cu un pre de cost foarte sczut.

II.

Etraparea

Aceast metod de imobilizare difer de cele prezentate anterior prin aceea

c enzimele nu sunt legate fizic/chimic de suport ci se gsesc n stare liber n
soluie. Procesul de imobilizare const n limitarea micrii enzimelor la un spaiu
bine definit ochiurile unei reele macromoleculare (film, gel) sau pictura de ap
din interiorul unei capsule separate de mediul exterior printr-o membran
semipermeabil.
Entraparea unei enzime se poate realiza prin dou metode:
-

Incluziune/entraparea

matricea

unui

polimer

(reea

tridimensional);
-

Entraparea n microcapsule (proces cunoscut sub numele de

microncapsulare).

a) Entraparea n reea polimer

Exist dou modaliti de includere a unei enzime ntr-o reea polimer i
anume: (1) amestecarea enzimei cu un prepolimer n vederea obinerii unei
22

structuri de tip reea ce prinde enzima n interior; (2) amestecarea enzimei cu doi
sau mai muli monomeri ce polimerizeaz in situ formnd o reea n ochiurile
creia se gsesc moleculele de enzim.
O grij deosebit trebuie acordat raportului dintre monomer i agentul de
reticulare deoarece n cazul unei reticulri reduse ochiurile reelei sunt prea mari iar
enzima se poate pierde conducnd la un randament de imobilizare foarte mic.
Dimportiv, dac gradul de reticulare este foarte ridicat, ochiurile reelei pot fi prea
mici ngreunnd accesul substratului la centrii activi ai enzimei.
Trebuie deci gsit gradul optim de reticulare care s nu permit pierderea
enzimei dar care s nu blocheze centrii activi asigurnd astfel o activitate catalitic
bun.
Acest tip de imobilizare poate fi utilizat doar n cazul enzimelor ce posed o
mas molecular mai mare ca masa substratului.
Ca materiale n obinerea suporturilor reticulate, se pot utiliza polimeri
naturali: derivai de celuloz, amidon (carragenan-ul s-a dovedit ideal in obinerea
reelelor tridimensionale) sau polimeri sintetici: poliacrilamid, polietilenglicol
dimetacrilat, polialcool vinilic, poli acid lactic.
Dintre polimerii sintetici poliacrilamida s-a dovedit a fi cel mai indicat
material n obinerea de geluri cu rol de suport. Mecanismul de entrapare pentru
acest caz este ilustrat mai jos:
n ultimii ani s-a constatat c utilizarea suporturilor de natur anorganic
ofer o serie de avantaje: rezisten mecanic mbuntit, stabilitate chimic i
termic crescute, nu se degradeaz electrochimic, nu prezint toxicitate, sunt inerte
din punct de vedere biologic (nu pot fi degradate de microorganisme), se pot
prelucra uor sub diverse forme.
Literatura menioneaz o serie de materiale utilizate n obinerea de geluri
cu rol de suport. Cele mai utilizate sunt gelurile pe baz de silice ce folosesc n
obinere precursori de alcoxid tetrafuncionali, catalizai fie de un acid mineral
(HCl) fie de o baz (NH3).
23

Ali precursori utilizai n metoda sol-gel sunt precursorii oligomeri,

silicatul de etil, hexametoxi disiloxanul sau octametiletoxisiloxanul.
b) Microncapsularea
Metoda presupune nglobarea enzimelor n microcapsule cu perei
semipermeabili. Membranele ce delimiteaz microparticulele au proprietatea de a
menine n interior moleculele de enzim ns permit accesul moleculelor de
substrat la centrii activi ai enzimelor.
Exist dou metode de ncapsulare a enzimelor:
-

Prin coacervare: proces caracterizat printr-o separare de faz n

soluia de polimer. Datorit solubilitii mai mici a polimerului
la suprafaa picturii, rezult formarea la exterior a unei
membrane semipermeabile ce prinde n interior soluia de
enzim;

Prin polimerizare interfacial.

n obinerea microcapsulelor se pot utiliza polimeri sintetici (nylon 6-6,

polistiren) sau polimeri naturali (derivai de celuloz etilceluloz, nitrat de
celuloz).
III.

Reticularea

Imobilizarea prin reticulare se caracterizeaz prin formarea de legturi

covalente ntre enzime sau alte biomolecule. n acest caz nu este necesar prezena
unor suporturi insolubile deoarece legturile chimice se formeaz ntre enzime
conducnd la stabilizarea acestora. Interaciile se realizeaz prin intermediul unor
reactivi (ageni de reticulare) bi- sau multifuncionali.
Ca ageni de reticulare se pot folosi:
-

Glutaraldehida (cel mai utilizat);

Glutardialdehida;

Glioxanul;

Diizocianaii i derivaii acestora;

Bisdiazobenzidina;
24

iar reticularea poate avea loc la:

-

grupele -NH3 ale lizinei;

grupa sulfhidril din cistein;

grupele fenolice ale tirozinei; sau

grupele imidazol din structura histidinei.

Procesul de reticulare poate fi unul simplu n care sunt implicate doar

moleculele de enzim sau unul complex la care particip i un material inert cu rol
de liant ntre moleculele de enzim. Rolul inertului este de a mri rezistena
mecanic a sistemelor enzimatice. Unul din neajunsurile metodei este acela c
agentul de reticulare poate ataca centrul activ al biomoleculelor conducnd la
diminuarea sau chiar pierderea caracterului enzimatic (activitii catalitice).
Dup cum s-a menionat anterior glutaraldehida reprezint cel mai utilizat
agent de reticulare. Mecanismul reaciei de reticulare dintre enzim i
glutaraldehid este prezentat n schema de mai jos:

25