Platforma Moodle

Biochimie-Capitole speciale

https://bioc.gnomio.com/
Creare cont!
Cheie de inrolare: bioc-bbtc

Proprieti chimice ale aminoacizilor determinate de

prezena simultan a celor dou grupri funcionale COOH i
NH2
- reacia de condensare intermolecular cu formare de dipeptide,
tripeptide, etc.
- doi sau mai muli aminoacizi reacioneaz ntre ei cu eliminare
intermolecular de ap ntre o grupare COOH a unui aminoacid i o
grupare NH2 a altui aminoacid.
- legtura peptidic format
-CO-NH-R''st la baza structurii peptidelor,
R'
R'
O
polipeptidelor i proteinelor.
CH
CH
H

Aminoacid

OH H
+

OH

H
-H2O

CH

HN

CH

R''

Aminoacid

OH

Dipeptida

R
CH

OH

Aminoacid
-H2O

R'
Polipeptida

CH

CH

HN

CH

R''
Tripeptida

HN

OH
C
O

Peptidele sunt substane naturale sau sintetice

constituite dintr-un numr restrns de aminoacizi care se
condenseaz intermolecular la nivelul gruprii -carboxil
a unui aminoacid i a gruprii -amino a altui aminoacid,
cu formare de legturi peptidice.

Peptidele reprezint
aminoacizi i proteine.

compui

intermediari

ntre

Peptidele

constituite din 2-10 aminoacizi se numesc

oligopeptide.
Cele

a cror structur este format

aminoacizi se definesc ca polipeptide.

din

10-100

La capetele lanului peptidic rmne o grupare amino liber i o

grupare carboxilic liber.
Aceste dou grupri neimplicate n fomarea legturilor peptidice se
numesc grupri carboxil C-terminale (aminoacid C-terminal) i
respectiv grupri amino-N-terminale (aminoacid N-terminal).
Prin convenie aminoacidul N-terminal dintr-un lan polipeptidic sau
proteic se consider ca fiind primul aminoacid din structura
respectiv.

Denumirea

peptidelor se formeaz din numele radicalilor

aminoacizilor constitueni, cu excepia aminoacidului care are
OH
gruparea carboxilic liber, ultimul din lanul polipetidic.
CH3

H3C
CH

Seril-glicil-tirozil-alanin-leucina
SER-GLY-TYR-ALA-LEU
H-SER-GLY-TYR-ALA-LEUOH

H3N

CH2OH

Serina

CH2

C
O

Glicina

CH2

C N

Tirosina

CH3

H CH2

Alanina

N C COOH
Leucina

Proprieti fizico-chimice ale oligopeptidelor

Peptidele prezint proprieti intermediare
aminoacizilor i cele ale proteinelor.

ntre

cele

ale

Peptidele cu mas molecular mare sunt solubile n ap i insolubile

n alcool, solubilitatea scznd odat cu creterea masei moleculare.
Sub aciunea cldurii nu coaguleaz i nu sunt denaturate.
Hidroliza enzimatic a peptidelor (sub influena enzimelor
peptidaze) conduce, n cazul homopeptidelor, la aminoacizii din care
s-au format, iar n cazul heteropeptidelor, se obine, pe lng
aminoacizi, i o component neproteic (component prostetic).
sunt rspndite att n regnul vegetal ct i n cel animal, unde
ndeplinesc un anumit rol fiziologic;
se formeaz n metabolism ca faze intermediare;
5

intr n compoziia unor hormoni, antibiotice, etc.

OH

COO-

CH CH2 CH2 C NH CH C NH CH2

COOCH2
H3N

CH

C
O

NH3+

CH2

H2N
CH(CH2)3CONH

COO-

CH2
SH

OCH3

Aspartam (esterul
metilic al aspartilfenilalaninei)

HOOC

Glutationul (glutamil-cisteinil-glicina)
-se gaseste in seminte si embrioni ai
plantelor
Important rol in procese redox,
antioxidant, rol de protectie a unor
substraturi
H H
S CH3

O
Penicilina

CH3
COOH

Proteidele
-sunt compui cu structur macromolecular, complex, eseniali
pentru organismele vii att din punct de vedere funcional ct i
structural.
-n aceast categorie intr holoproteidele (proteinele propriu-zise)
alctuite exclusiv din aminoacizi, ct i heteroproteidele (proteinele
conjugate) alctuite din aminoacizi i o component neproteic
(prostetic).

Holoproteidele (proteinele) reprezint substane complexe cu

caracter macromolecular i cu un nalt grad de organizare structural.
Proteinele sunt alctuite numai din aminoacizi, avnd mase
moleculare de 1x103 1x105 Daltoni.

Proteinele se caracterizeaz printr-o mare diversitate structural

determinat de:
-numrul aminoacizilor constitueni;
-- tipurile aminoacizilor constitueni;
- secvena aminoacizilor componeni;
-Structura
organizarea
spaial configuraional a macromoleculei respective.
proteinelor
-

structura
- structura
- structura
- structura

primar
secundar
teriar
cuaternar
structur
a
primar

structura
secundar

structu
ra
teriar

structura
cuaternar

Structura primar
- reprezint organizarea catenei macromoleculare, respectiv numrul i
secvena aminoacizilor legai prin legturi peptidice.
n proteinele naturale legtura peptidic se stabilete ntre gruparea
carboxilic de la un aminoacid i gruparea aminic de la alt aminoacid, ncat
lanul peptidic va fi format dintr-o succesiune de uniti -CO-NH-CH-, legate
cap-cap.
-legatura amidica are caracter partial de dubla legatura si nu permite rotatia, de
aceea ea se vaR''afla totdeauna intr-un
plan.
R''
R''

O-

CH

CH

CH

CH

CH

CH

R'

R'

R'

-carbonul -CH- se poate roti, putnd s apar n planuri diferite.

-datorit lungimii relativ mici a catenelor laterale, ele se pot aranja de o parte
i de alta a lanului proteic, astfel c lanul proteic nu este ramificat.

-prima structura elucidata a fost a insulinei in 1953 (51 de aminoacizi),

urmata de cea a ribonucleazei (124 aminoacizi)
-astazi se cunosc structurile primare a zeci de mii de proteine.

Structura secundar
-se refer la forma i la lungimea lanurilor polipeptidice, proprieti induse
de legturile de hidrogen intre gruparile peptidice.
Pauling a postulat existenta a doua astfel de structuri care permit formarea
unui numar cat mai mare de legaturi de hidrogen intre gruparile peptidice:
-structuri de tip elice (-helix)
-structuri de tip foaie pliat (-pliata)
A. Structura elicoidal
-Modelul spiralat, helicoidal sau -helix, presupune rsucirea n spiral a
lanului polipeptidic (grilajului peptidic).

-Acesta este format din catene polipeptidice

ntre care se stabilesc legturi de hidrogen
(ntre grupa C=O) a unui aminoacid si grupa
NH a altui aminoacid situat 4 reziduuri mai
incolo) n jurul unui cilindru imaginar.

-Numele de -helix a fost utilizat de

Pauling care a recunoscut prima dat
aceast structur n -keratin aproape
100% structura -helix .
-Sensul de orientare a -helixului poate fi
spre dreapta sau spre stnga, ns toi
aminoacizii participani n ambele cazuri
aparin seriei L, iar resturile R ale
aminoacizilor sunt proiectate spre
exteriorul spiralei (-helixului).
-Cele mai stabile structuri sunt cele

n cazul L-aminoacizilor din proteinele

naturale, rsucirea spre dreapta a helixului
confer structurii mai mult stabilitate dect
rsucirea spre stnga.
Elicea are forma unei scri n spiral, n
care fiecrei trepte i corespunde un
aminoacid.
nlimea unei trepte este de 1,5 i
fiecrei spire i corespund 3,6 aminoacizi
(trepte), iar distana dintre spire este de
5,4 . (3,6 1,5).
Catenele laterale n modelul -helix sunt
orientate n afar, putnd reaciona cu
moleculele solventului sau cu alte catene
polipeptidice.
Natura radicalului -R legat la C influeneaz
formarea -helixului, favoriznd sau nu,
rsucirea lanului peptidic.
De exemplu: valina, izoleucina, i treonina,

5.4

1.5

Un lant polipeptidic cu structura de elice are forma unui bastonas cu

diametrul de 10.1.
Problema:
Care este inaltimea unui segment proteinic cu cu structura de elice ce
contine 300 de aminoacizi?
R. nlimea unei trepte este de 1,5 i fiecrei spire i corespund
3,6 aminoacizi (trepte), iar distana dintre spire este de 5,4 . (3,6
1,5).
Pentru 300 de aminoacizi vom avea inaltimea: =numar aminoacizi x 1.5 =
450

Structura -helix a fost gasit in multe proteine in proportii mai mari sau mai m
-mioglobina -70%
-insulina 38%
-ovalbumina -31%

Colagenul un grup de proteine ce se gaseste in organismul animal, in

special in tesuturile de legatura, constituind cam 25-35% din totalul de
proteine.
-contine circa 35% glicina, 11% alanina si 21% prolina si 4-hidroxiprolina.
-structura sa este repetitiva fiind formata majoritar din secvente Gly-X-Prosi Gly-X-HO-Pro-, unde X este un alt aminoacid decat glicina si prolina.
-are o structura formata din 3 -catene rasucite intr-o elice spre stanga.
-nu se formeaza legaturi de hidrogen intre grupele peptidice din
acelasi lant.

O
O
NH

NH

O
N

O
N

O
NH

NH

NH

NH

O
R

R
HO

Structura n foaie pliat (-pliata)

-Plierea catenei are loc prin formarea legturilor de hidrogen ntre
gruparea carboxilic a unui aminoacid i gruparea aminic a
aminoacidului vecin din alta catena polipeptidica.
-Lanul polipetidic pliat se prezint ca o panglic ndoit alternativ la
dreapta i la stnga, plierea avnd loc n dreptul atomilor de carbon
metinici.
-distanta axiala intre 2 aminoacizi vecini este de 3.5 fata de 1,5 in -helix.

Antiparalel

Paralel

-In modelul paralel, caracteristic -keratinei (in piele, unghii, etc.) lanurile
peptidice sunt situate paralel, cu resturile -R orientate n acelai sens.
-in modelul antiparalel, caracteristic fibroinei din mtasea naturala lanurile
peptidice sunt fa n fa (antiparalele), cu resturile -R orientate n direcii
opuse.
18

- Structura teriar
Prin intermediul cristalografiei cu raze X s-a dovedit faptul c
macromoleculele proteice au o conformaie tridimensional, realizat
de obicei prin intermediul cuplrii mai multor lanuri polipeptidice
scurte ntre ele, cuplare care duce la formarea fibrelor proteice;
-reprezint rezultatul interaciilor dintre resturile R ale aminoacizilor
din catenele polipeptidice.
-se pot forma urmtoarele tipuri de legturi:
legturi de hidrogen (altele dect cele peptidice) ntre grupele
OH ale hidroxiaminoacizilor i restul imidazolic (de exemplu, al
histidinei) sau grupa OH fenolic a tirozinei i un rest carboxilic (COOH);
legturi covalente de tip disulfuric stabilite la nivelul grupelor
-SH din tioaminoacizii cistein, metionin;

19

-legturi fosfodiesterice, stabilite la nivelul grupelor -OH

esterificabile ale hidroxiaminoacizilor (de exemplu, serina) cu acid
fosforic:

-legturi ionice ntre resturile carboxilat (-COO-) de la aminoacizii

dicarboxilici (acidul aspartic, acidul glutamic) i gruprile amoniu (
NH3+) ale aminoacizilor diaminici (lisin, arginin);
- legturi nepolare prin fore van der Waals (legturi hidrofobe)
realizate ntre catenele laterale ale valinei, leucinei, izoleucinei,
fenilalaninei. Legturile hidrofobe apar i acioneaz mai ales n
interiorul moleculelor proteice, minimaliznd interaciile prilor
hidrofobe cu apa i maximaliznd forele van der Waals ntre grupele
hidrofobe.

Structura cuaternar
Structura cuaternar a proteinelor reprezint cel mai nalt grad de
organizare a acestora i rezult din interaciunea lanurilor polipeptidice
independente, care au deja o structur primar, secundar, i teriar
bine definit.
Suprastructura cuaternar are specific asocierea unor catene polipeptidice
individuale (protomeri) ntr-un agregat denumit oligomer (multimer sau
proteine multisubunitare).

Proteine care au structura

cuaternar: hemoglobina,
ADN polimeraza.

21

Proprieti fizice ale proteinelor

Proteinele izolate din diferite surse sunt substane solide, n general amorfe,
care prin purificare avansat pot fi obinute n stare cristalin.
Solubilitatea proteinelor n ap
-este foarte diferit: proteinele globulare sunt mai mult sau mai puin
solubile, pe cnd cele fibrilare sunt insolubile.
-Solubilitatea n ap depinde de mai muli factori: natura, numrul i
aezarea n caten a aminoacizilor care compun macromolecula, de existena
grupelor funcionale hidrofile (carboxil, hidroxil), de pH i de concentraia n
sruri a soluiei.
-Prezena grupelor funcionale polare (-OH, -NH2, -COOH,-SH) favorizeaz
dizolvarea n ap, deoarece moleculele polare ale apei sunt atrase
electrostatic de grupele funcionale polare ale proteinei, ceea ce duce la
legarea moleculelor solvatului de moleculele solventului, adic la fenomenul
de solvatare (hidratare n cazul apei) indispensabil dizolvrii.
Natura solventului are un rol mare n procesul de solubilitate a proteinelor.
Solubilitatea proteinelor este influenat i de pH-ul mediului. La pH
izoelectric, moleculele proteinelor devin perfect neutre, nu mai leag
moleculele polare ale apei n jurul lor, n consecin, nu mai are loc

-La pHi (corespunzator punctului izoelectric), solubilitatea proteinei devine minim i

din aceast cauz proteina precipit uor, particulele proteice gsindu-se sub form de
amfioni. Prezena ionilor de semn contrar influeneaz solubilitatea proteinelor,
deoarece macromoleculele posed la suprafa grupri ionizate i rein selectiv diferite
substraturi cu molecule mici.
-Solvenii organici produc o scdere a constantei dielectrice a mediului apos i n
consecin, fenomenul de hidratare se reduce odat cu solubilitatea. O cantitate prea
mare de solvent organic poate produce pierderea sarcinilor electrice i o deshidratare a
proteinei care poate duce la denaturarea ei (modificarea structurii i proprietilor
Starea coloidal a proteinelor n soluie
iniiale).

-le confer proprietile caracteristice sistemelor

coloidale: presiune osmotic mic, putere de
difuziune redus, ultrafiltrare, efectul Tyndall
(fenomen de dispersie a luminii incidente de ctre
nite particule macroscopice avnd dimensiuni
comparabile cu lungimea de und a luminii), etc.
Din cauza dimensiunilor mari ale
macromoleculelor, proteinele nu difuzeaz prin
membrane ale cror pori sunt de ordinul
milimicronilor (membrane de celofan, pergament,
colodiu etc.), proprietate pe care se bazeaz
separarea lor de srurile prezente n soluie i ai
cror ioni trec prin membranele de dializ.

Formare de geluri
-Soluiile proteice pot forma geluri n care proteina i solventul formeaz o
mas omogen, cu particulariti specifice substanelor solide.
Fenomenul este important pentru realizarea reelei tridimensionale a
scheletului protoplasmei, care este insolubil n ap, pe care o reine datorit
procesului de imbibiie.
Imbibiia gelului, nsoit de creterea considerabil a volumului este utilizat
n industria alimentar (gelifierea alimentelor prin adugare de gelatin,
imbibiia proteinelor din fin la prepararea aluatului etc.).
Precipitarea proteinelor
-poate fi: reversibil si inreversibila;
-Precipitarea reversibila:
-are loc n prezena soluiilor concentrate de electrolii tari (sruri ale
metalelor alcaline, alcalino-pmntoase, (NH 4)2SO4 sau a solvenilor miscibili
cu apa (alcool, aceton).
-se explic prin fenomenul de salifiere, care const n deshidratarea parial
a proteinelor, datorit competiiei pentru moleculele de ap dintre ionii
electroliilor folosii la precipitare i grupele polare sau ionice ale
proteinelor.
-Macromoleculele proteice deshidratate parial, se aglomereaz i precipit.
La adugarea unui exces de ap, precipitatul se dizolv, ceea ce dovedete

Precipitarea ireversibil
-se produce n prezena srurilor metalelor grele (Cu, Pb, Hg, Fe, Ni etc.), a
acizilor tari (HCl, HNO3, H2SO4), a bazelor alcaline (NaOH, KOH), a acidului
picric, sau cu unii acizi anorganici compleci (acid fosfomolibdenic, acid
fosfowolframic etc.).
-mai poate avea loc la nclzire puternic (coagulare), sub aciunea razelor X,
UV, etc.
-la ncetarea aciunii agenilor precipitani, proteinele nu revin la forma
iniial, deoarece structura spaial a proteinelor (secundar, teriar) sufer
o depliere, o dezorganizare, care ns nu afecteaz i structura primar.
Caracterul amfoter al proteinelor
-se datoreaz prezenei n molecula lor a gruprilor acide (-COOH) sau bazice (-NH 2)
libere ale resturilor aminoacizilor dicarboxilici sau diaminici din constituia proteinelor.
-Caracterul amfoter al proteinelor este influenat i de resturile unor aminoacizi cu
grupri ionizabile (-OH din tirozin, resturile bazice ale histidinei, argininei). Datorit
sarcinilor electrice, proteinele migreaz n cmp electric spre anod n soluie bazic i
spre catod n soluie acid. Fenomenul st la baza separrii i purificrii proteinelor prin
metoda numit electroforez.
-Activitate optica
Proteinele prezint activitate optic, datorit att aminoacizilor constitueni care conin
atomi de carbon asimetrici, ct i asimetriei ntregului agregat macromolecular. Orice
modificare a structurii proteinei este nsoit de schimbarea rotaiei specifice, care

Proprieti chimice ale proteinelor

-Proteinele prezint (asemntor aminoacizilor) reacii chimice
corespunztoare grupelor funcionale: -NH2 i -COOH libere, precum i reacii
ale radicalilor -R pe care i conin.

-Sunt caracteristice de asemenea o serie de reacii de culoare, care servesc

la identificarea lor (reacia biuretului, reacia xantoproteic, reaciile: Millon,
Liebermann,
Sakaguchi etc.).
eacia
biuretului-culoare
violet

Reacia cu ninhidrina
O
H2N

COOH
CH
R

O
OH

OH
O

RCHO

CO 2

H 2O

Reactia Millon. HgNO3 in acid azotic cu urme de acid azotos reactioneaza cu

tirozina conducand la precipita rosu.
Reactia xantoproteica. Acidul azotic concentrat reactioneaza cu inelul
benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.
Reactia Hopkins-Cole. Acidul glioxilic (OHC-COOH) in H2SO4 reactioneaza
cu triptofanul conducand la un precipitat violet.
Reactia Folin-Ciocalteu. Acidul fosfomolibdowolframic reactioneaza cu
tirozina rezultand un produs albastru.
Reactia Sakaguchi : -naftolul si hipocloritul de sodiu reactioneaza cu
arginina conducand la un produs rosu.
Reactia Sullivan : sarea de sodiu a acidului 1,2 naftochinon-4-sulfonic si
hidrosulfitul de sodiu reactioneaza cu cisteina rezultand un produs rosu.
-Hidroliza
Sub influena acizilor, bazelor sau a enzimelor proteolitice catena
polipeptidic se scindeaz cu formarea unor fragmente polipeptidice, care n
final hidrolizeaz, punnd n libertate toi aminoacizii constitueni.

Denaturarea.
-Sub aciunea unor ageni fizici i chimici proteinele sunt modificate
structural, cu pstrarea masei moleculare, si pierderea activitii fiziologice.
Denaturarea poate fi reversibil sau ireversibil.
-Agenii denaturani pot fi clasificai astfel:
ageni fizici: temperaturile ridicate, radiaii UV, razele X, ultrasunetele ,
etc.;
ageni chimici: soluii concentrate de acizi i baze tari, srurile unor metale
grele (Hg, Pb, Cd etc.), compui ai arsenului, solveni organici etc.
-Denaturarea proteinelor reprezint un proces complex, care implic
modificri ale structurii secundare i teriare a proteinelor (desfacerea sau
modificarea legturilor de hidrogen, a legturilor disulfurice, ionice etc.),
nsoite de deplierea catenelor i modificarea arhitecturii moleculare.
-Denaturarea determin scderea solubilitii i a capacitii proteinelor de a
absorbi apa, modific viscozitatea, presiunea osmotic, activitatea optic i
gradul de hidroliz, ca i activitatea fiziologic.
Denaturarea ireversibil a proteinelor joac un rol important n fenomenele
vitale, de exemplu, mbtrnirea seminelor i pierderea capacitii de
germinare, fenomenul de mbtrnire la oameni, animale etc.
n industria alimentar denaturarea proteinelor este utilizat la prepararea
produselor alimentare prin coacere, uscarea legumelor, fabricarea laptelui

Proprieti biochimice ale proteinelor

Organismele vii prezint proprietatea specific de a putea sintetiza proteine proprii din
aminoacizii preluai prin alimentaie sau rezultai la hidroliza enzimatic a proteinelor
alimentare.
-Proteinele au proprietatea de a fi organ-specifice, deoarece fiecare organ al aceleiai
plante sau al aceluiai animal conine proteine specifice, diferite de proteinele altor
organe ale aceluiai individ.
-Proteinele sunt totodat i specie-specifice, deoarece acelai organ de la diferite
specii, animale sau vegetale, conine proteine specifice, diferite de ale aceluiai organ al
unui individ din alt specie.
Specificitatea proteinelor se manifest i prin proprietile lor imunologice:
inocularea unei proteine strine n organismul unui animal provoac apariia n serul
acestuia a unei substane capabile s precipite numai proteina care a fost inoculat.
Substanele inoculate se numesc antigeni i pot fi: proteine, poliglucide, asociaii
complexe glucide-lipide-poliprotide, care sunt strine pentru organismul n care au
ptruns i declaneaz n consecin biosinteza unor proteine specifice de aprare,
denumite anticorpi. Antigenul reacioneaz cu anticorpii formai, determinnd reacia
antigen-anticorp, prin care este anihilat aciunea nociv a antigenului.
Formarea anticorpilor coincide cu instalarea n organism a unei rezistene specifice
(imunitate) fa de agentul patogen. Reaciile imunologice stau la baza preparrii i
utilizrii serurilor i vaccinurilor n vederea imunizrii organismelor contra infeciilor
microbiene.

Analiza proteinelor
Analiza proteinelor incearca sa studieze modul cum secventele de aminoacizi
conduc la o anume structura a proteinei, cum se leaga aceste proteine de
substrat sau alte molecule pentru indeplinirea functiilor lor.
Analiza proteinelor permite intelegerea rolului functional al acestora pe baza
structurii.

Etape in analiza proteinelor

Extractia proteinelor.

Purificarea proteinelor.

Caracterizarea structurala a proteinelor.

1. Extractia proteinelor
Implic extragerea eficient a proteinelor i peptidelor ntr-o form
biologic activa din esut sau celulele microbiene.
n timpul acestui proces, inactivarea enzimelor proteolitice (cele care
scindeaza proteinele) este necesar, ca s nu provoace degradarea
proteinelor coninute n esut.
Extractia proteinelor: se omogenizeaza tesutul in solutie tampon
fiziologica (0.05M Na2HPO4, pH 7.4) in prezenta de inhibitori
proteolitici (EDTA, Pepstatina).
Extractia

peptidelor: se fierbe tesutul cu solutie de acid acetic 1m

timp de 5 min apoi se omogenizeaza tesutul in solutie etanol:sol. HCl
0.1M la 0C. Acest lucru va duce la deschiderea veziculelor si
trecerea peptidelor in solutie.
Pepstatina
Isovaleril-Val-Val-AAHMH-Ala-AAHMH
unde
AAHMH= acid (3S, 4S)-4-amino-3hidroxi-6-metil-heptanoic

2. Purificarea proteinelor
Proteinele pot fi purificate avand in vedere proprietatile lor fizico-chimice.
Aceste proprietati au condus la dezvoltarea unor tehnici specifice.

Proprietatea proteinelor

Tehnica de purificare

Solubilitate

Precipitare fractionata

Marimea moleculei

Cromatografia de excluziune
molecular (de gel permeabil sau
de filtrare cu gel).

Sarcina electrica a moleculei

Cromatografia de schimb ionic

Hidrofobicitate

HPLC (cromatografie de lichide de

inalta performanta) in faza inversa

Activitate biologica

Cromatografie de afinitate

Precipitare diferentiata
-se realizeaza prin adaos de saruri anorganice sau de solventi organici.
Cel mai des se utilizeaza sulfatul de amoniu.
-precipitatul obtinut se separa prin centrifugare;
-cresterea concentratiei de sare conduce la cresterea cantitatii de precipitat.
Cromatografia de excluziune
molecular (de gel permeabil sau de
filtrare cu gel).
-se realizeaza pe o coloana umpluta cu gel
poros.
Aceast tehnic separ moleculele dup
mrimea moleculelor.
Moleculele mici intra in gel in timp ce
moleculele de dimensiuni mari raman in
spatiile dintre particulele de gel si elueaza
primele.
Avantaje: permite separarea unor cantitati
mari de proteine;
Dezavantaje: -are o rezolutie de separare
scazuta.

Cromatografia de schimb ionic

Separa moleculele de proteine pe baza
sarcinii electrice.
-umplutura coloanei este incarcata electric la
randul sau fie cu sarcini pozitive (dietilamino
etilceluloza), fie negative
(carboximetilceluloza).
-umplutura utilizata difera in functie de
incarcarea electrica a proteinei ce se doreste
a fi separata.
De exemplu, daca proteina de interes este
incarcata negativ se utilizeaza o umpluta
incarcata pozitiv (dietilamino etilceluloza ).
Proteina se va lega de centrii cationici ai
umpluturii.
Ea este apoi pusa in libertate prin utilizarea
unei solutii saline (de obicei de NaCl), cand
anionii de Cl- se leaga de centrii cationici iar
proteina este eliberata.
-modificarea incarcarii electrice a proteinei

HPLC (cromatografie de lichide de

inalta performanta) in faza inversa
Aceasta tehnica purifica proteinele
pe baza hidrofobicitatii lor.
Faza inversa este o forma de
cromatografie in care faza
stationara este hidrofoba iar faza
mobila este mult mai hidrofila decat
faza stationara.
Solutia de proteine este introdusa
intr-o coloana ce contine silice
substituita cu lanturi lungi de
hidrocarbura (octacetil, butil, propil,
fenildimetil).
Grupele hidrofobe ale proteinelor se
vor lega de umplutura.
Proteinele hidrofile vor elua primele.
Solventii utilizati: Apa+ 0.1%Acid
trifluoracetic, acetonitril.

-este cea mai performanta metoda

de purificare a proteinelor
-are avantajul unei afinitati ridicate a
multor proteine pentru o molecula
sau grupare chimica specifica.
Exemplu:
Concavalina A este o proteina
care se leaga de obicei de un rest de
glucoza. Ea poate fi purificata prin
trecerea pe o coloana ce are ca
umplutura un polimer sintetic
substituit cu resturi de glucoza.
Concavalina A se leaga de
umplutura in timp ce alte proteine
nu.
Prin eluarea cu o solutie de glucoza
se poate separa concavalina A in
stare pura.

Caracterizarea proteinelor si peptidelor

-implica trei procese:

Determinarea compozitiei aminoacizilor (structura si numarul lor)

Determinarea secventei de aminoacizi (ordinea lor in lantul

macromolecular)

Determinarea masei moleculare a proteinei.

Determinarea compozitiei aminoacizilor
Peptidele sunt mai intai hidrolizate in aminoacizii constituenti prin
incalzire cu solutie de HCl 6M la 1100C timp de 24 ore, de obicei in
atmosfera de argon.
Aminoacizii sunt separati prin HPLC.
Analiza cantitativa se poate realiza prin masuratori
spectrofotometrice prin reactia cu ninhidrina (aminoacizii dau
culoare violet, iminoacizii-prolina, hidroxiprolina dau culoare
galbena).

Analiza structurala a proteinelor

Determinarea secventei de aminoacizi

-aminoacidul N-terminal se poate identifica prin tratare cu 2,4-dinitrofluorbenzen urmata de hidroliza

totala a proteinei si identificarea aminoacizilor constituenti prin HPLC.
R

NO 2
H2N

NH
R

NH

NH

OH

O 2N

NO2

R
O2N

NH
NO2

NH

NH

NH

NH

NO2

O
OH

H2N

O
OH

H2N
R

OH

+
O

H2N
R

OH

OH
O

Determinarea secventei de aminoacizi

- se realizeaza prin metoda Edman (elaborata de Pehr Edman).
-Metoda indeparteaza cate un rest de aminoacid o singura data de la capatul peptidei
ce contine restul aminic.
-Fenil izotiocianatul reactioneaza cu grupa amino terminala cu formarea unui derivat
fenil tiocarbamoil;
-In conditii acide acest derivat ciclizeaza la o fenil-tiohidantoina (PTH) si o peptida
mai scurta cu un rest de amino acid.
Fenil-tiohidantoina poate fi identificata prin HPLC.
Degradarea poate continua, fiecare aminoacid fiind identificat pe rand.
Se pot identifica lanturi de pana la 50 de aminoacizi, folosind un secventiator automat.

H2N

LYS

SER

TYR

LEU ALA COOH

N C

S
NH

HN

LYS

SER

TYR

LEU ALA COOH

H+
S

N
O

H2N

SER

TYR

LEU ALA COOH

NH
CH
CH2 CH2

N C
CH2

CH2

NH2
S

PTH-Lizina
NH

HN

SER

TYR

LEU ALA COOH

H+

S
N
O

+
NH
CH
CH2 OH

PTH-Serina

H2N

TYR

LEU ALA COOH

Lanturile lungi de polipeptide sunt rupte in lanturi mai scurte pentru analiza
prin utilizarea unor enzime specifice care rup lantul in anumite puncte.
Enzima

Punct de rupere a lantului

Tripsina

Lys, Arg (C)

Chimotripsina

Phe,Trp, Tyr (C)

Pepsina

Phe, Trp, Tyr (N)

CNBr

Met (C)

P o lip e p tid a

h id r o liz a to ta la
a n a liz a a m in o a c iz i

3 8 a m in o a c iz i

F
NO2

+
NO2

h id r o liz a c u tr ip s in a
s e p a ra re fra g m e n te
s e c v e n tie r e E d m a n

A m in o a c id N - te r m in a l G lu
G lu G ly A la A la T y r H is A s p P h e G lu P r o Ile A s p P r o A r g T 1
G ly A la S e r M e t A la L e u Ile L y s

T2

T y r L e u Ile A la C y s G ly P r o M e t T h r L y s T 3
A s p C y s V a l H is S e r A s p T 4

H id r o liz a c u C N B r
s e p a ra re fra g m e n te
s e c v e n tie r e E d m a n

G lu G ly A la A la T y r H is A s p P h e G lu P r o Ile A s p P r o A r g G ly A la S e r M e t
A la L e u Ile L y s T y r L e u Ile A la C y s G ly P r o M e t

C 1

C 2

T h r L y s A s p C y s V a l H is S e r A s p C 3

Concluzii:
-aminoacidul N-terminal este acidul glutamic
-dupa hidroliza cu tripsina:
-fragmentul T1 include N-aminoacidul terminal;
-fragmentul T4 include acidul C-terminal (acid aspartic Asp) pentru ca nu are
un rest de arginina sau lisina

-fragmentul C3 confirma ca acidul C-terminal este acidul aspartic

Structura peptidei este:
T r ip s in a

CN Br

T r ip s in a

C N B r T r ip s in a

G lu G ly A la A la T y r H is A s p P h e G lu P r o I le A s p P r o A r g G ly A la S e r M e t A la L e u Ile L y s T y r L e u Ile A la C y s G ly P r o M e t T h r L y s A s p C y s V a l H is S e r A s p

Tema de casa
1. Scrieti tripeptidele posibile ce se pot forma din glicina, cisteina si alanina, in care fiecare aminoacid apare o singura data.
2. Un grup de peptide care influenteaza transmisiile nervoase in unele parti
ale creierului a fost izolat din tesutul cerebral. Aceste peptide sunt cunoscute
ca opioide pentru ca se leaga de receptorii specifici care leaga de asemenea
si droguri opioide precum morfina si naloxona. Folosind informatiile de mai
jos determinati structura primara a neurotransmitatorului leucin-encefalina.
(a) Hidroliza completa cu HCl 6M la 1100C urmata de analiza aminoacizilor
rezultati indica prezenta Gly, Leu, Phe si Tyr, in raport molar 2:1:1:1.
(b) Tratarea cu 2,4-dinitrofluorbenzen urmata de hidroliza completa si
cromatografie indica prezenta derivatului 2-4-dinitrofenil al tirozinei. Analiza
cromatografica indica absenta tirozinei libere in amestecul de aminoacizi.
(c) Tratarea peptidei cu pepsina urmata de cromatografie indica prezenta
unei dipeptide ce contine Phe si Leu si a unei tripeptide ce contine Tyr si Gly
in raport molar 1:2.
3. Studiind enzimele ce se gasesc in celulele unei plante reusiti sa separati
un extract care contine enzimele A, B si C. Enzimele A si B au masa
moleculara de 60.000 Da iar enzima C de 100.000 Da. Enzima A are punctul
izoelectric la 6.5 in timp ce enzimele B si C au punctul izolelectric la 7.5.
Propuneti o schema de separare utilizand doua tehnici din cele prezentate

4. Solutia unei proteine se imparte in doua parti. Prima parte se trateaza cu

pepsina cand rezulta in urma analizei urmatoarele fragmente:
AsnThr Trp Met Ile Lys
Gly Tyr Met Gln Phe
Val Leu Gly Met Ser Arg
Cea de a doua parte se trateaza cu BrCN cand rezulta urmatoarele
fragmente:
Gln Phe
Val Leu Gly Met
Ile Lys Gly Tyr Met
Ser Arg Asn Thr Trp Met
Pe baza acestor teste determinati structura primara finala a proteinei
analizate.