I.

STUCTURA CHIMIC A PROTEINELOR

I.1 Aminoacizii - uniti structurale de baz ale proteinelor Proteinele conin cei 20 (22) aminoacizi proteinogeni i doar n cazuri extrem de rare se pot ntlni i ali aminoacizi. Aminoacizii proteinogeni sunt -aminoacizi, cu excepia prolinei i hidroxiprolinei care sunt -iminoacizi:
R CH COOH NH2

Cu excepia glicinei, toi aminoacizii proteinogeni conin unul sau chiar doi atomi de carbon chirali, prezentnd deci izomerie optic. Ca i n cazul monozaharidelor, apartenena aminoacizilor la seria D sau L se face prin compararea configuraiei atomului de carbon care este asimetric, cu atomul de carbon chiral al aldehidei L-glicerice, respectiv D-glicerice. Aminoacizii naturali aparin seriei L deoarece organismele vii nu dispun de echipamentele enzimatice specifice D-aminoacizilor. n funcie de structura lor chimic, aminoacizii proteinogeni pot fi clasificai n urmtoarele grupe: 1. Aminoacizii monoamino-monocarboxilici:
CH2 COOH NH2 CH3 CH COOH NH 2 CH3 CH CH COOH CH3 NH2

glicocol

-alanin

valin
CH3 CH2 CH CH COOH CH3 NH2

CH3 CH CH2 CH COOH CH3 NH2

leucin
2. Aminoacizii monoamino-dicarboxilici:
COOH CH2 CH NH2 COOH CO NH2 CH2 CH NH2 COOH COOH CH2 CH2 CH NH2 COOH

izoleucin

CO NH2 CH2 CH2 CH NH2 COOH

acid aspartic

asparagin

acid glutamic

glutamin

3.Aminoacizii diamino-monocarboxilici:

2
NH NH2 ( CH2) 4 CH NH2 COOH NH2 ( CH2) 3 CH NH2 COOH NH C

lizin
4. Hidroxiaminoacizi:
CH2 OH CH NH2 COOH

arginin

H3C CH OH CH NH2 COOH

serin
5. Tioaminoacizi:
CH2 SH CH NH2 COOH CH2 S S CH2 CH NH2 CH NH2 COOH COOH

treonin

CH2 S CH3 CH2 CH NH2 COOH

cistein
6. Aminoacizi aromatici:

cistin

metionin

CH2 CH COOH NH2

HO

CH2 CH COOH NH2

fenilalanin
7. Aminoacizi heterociclici:
CH2 CH COOH N H NH2 HN

tirozin

CH2 CH COOH N NH2

triptofan
HO N H COOH N H

histidin

COOH

prolin

hidroxiprolin

n foarte puine cazuri, n afar de cei 20 (22) aminoacizi proteinogeni, pot fi ntlnite n structura catenelor polipeptidice resturi ale aa-numiilor aminoacizi rari. II.3.2 Structura proteinelor n procesul biosintezei proteice la nivelul ribosomilor are loc formarea de legturi peptidice ntre resturile de aminoacizi a cror succesiune n catena polipeptidic este determinat genetic. Acestea sunt legturi amidice secundare, cu caracter parial de dubl legtur:
H C O I N C O II H N

Datorit fenomenului de conjugare, atomii implicai n legtura peptidic sunt coplanari, n forma trans:
H C.... N O +

. .

Aceasta nseamn c legtura peptidic C N nu este simpl ci parial dubl, fiind astfel mpiedicat rotaia liber a substituenilor. Acest caracter de legtur parial dubl are o importan deosebit pentru structurile de ordin superior ale proteinelor. La nivelul legturilor peptidice se ntlnete izomeria de tip trans, iar rotaia liber este permis numai la nivelul celorlalte legturi covalente. Orientarea spaial a catenelor polipeptidice este datorat, n principal, acestor rotaii libere n jurul legturilor menionate:
H O C

O H I C I R

+ N

+ N I H

R' I C I H

Proteinele se caracterizeaz prin patru nivele de organizare structural, denumite structur primar, secundar, teriar i cuaternar. Structura primar este dat de numrul, natura i succesiunea resturilor de aminoacizi din catena polipeptidic. Acest nivel de organizare structural nu ine cont deci de aranjamentele spaiale ale catenei polipeptidice:
O O H2N CH C N CH C R1 H R2 capt N-terminal N CH COOH H Rn capt C-terminal

n structura primar, resturile de aminoacizi sunt unite prin legturi peptidice identice cu cele ntlnite n structura peptidelor:

4
legtur peptidic

...... NH CH CO NH CH CO ......
R1 R2

Studiul peptidelor sintetice cu ajutorul metodei difraciei de raze X prin cristale pure a permis determinarea distanelor interatomice ntr-o caten polipeptidic, precum i a unghiurilor dintre atomii componeni. Aceste determinri au demonstrat existena unei perioade de identitate de 7,2 pentru fiecare dou resturi de aminoacizi. Totodat s-a observat c distana interatomic C N este mai mic, iar distana C = O este mai mare dect cele normal ntlnite n ali compui (fig.18). innd cont de unghiurile optime de valen i de punile de hidrogen ce se stabilesc ntre componentele legturilor peptidice, se poate concluziona c moleculele polipeptidice nu sunt filiforme ci ocup un aranjament spaial care determin structura secundar. Acest nivel de organizare structural se poate materializa n dou moduri: structura helicoidal ( -helix) generat de formarea punilor de hidrogen ntre oxigenul carbonilic al unui rest de aminoacid i hidrogenul iminic al altui rest de aminoacid din aceeai caten polipeptidic i respectiv structura -pliat cnd legturile de hidrogen se formeaz ntre aceeai atomi, dar sunt intercatenare.
H R C
1,53 117 120 1,3 110 121 1,23

H
120

N
110

122 120 1,47

H R'

Fig 18. Reprezentarea schematic a distanelor interatomice i unghiurilor de valen n catenele polipeptidice

n acest din urm caz, straturile -pliate pot avea structur paralel (cnd o extremitate a moleculei conine capetele N-terminale, iar cealalt capetele C-terminale ale catenelor polipeptidice), sau antiparalel (fiecare extremitate conine att capete N-terminale ct i C-terminale). Structura -helicoidal. Studiul proteinelor fibrilare din clasa scleroproteinelor prin metoda difraciei razelor X a evideniat faptul c acestea se caracterizeaz prin prezena unor regulariti structurale ale moleculei, prin uniti care se repet i care sunt dispuse de-a lungul unui ax imaginar al moleculei. Aceste regulariti n structura moleculei au fost numite perioade de identitate i ele difer de la o protein la alta.

n funcie de mrimea perioadelor de identitate, proteinele se mpart n trei grupe: grupa keratinei, miozinei i fibrinogenului cu perioada de identitate 5,1 5,4

grupa keratinei i fibroinei cu perioada de identitate de 6,5 7,0 ; grupa colagenului cuprinde proteine a cror perioad de identitate este cuprins ntre 2,8 2,9 . Efectund experimente pe cristale peptidice, Pauling i Corey au stabilit cu rigurozitate condiiile formrii catenelor polipeptidice i au constituit modele experimentale care s ilustreze modul n care catenele polipeptidice sunt orientate n spaiu n funcie de natura i numrul legturilor peptidice, precum i de dimensiunile lor. Autorii au stabilit de asemenea, urmtoarele criterii care stau la baza formrii catenelor polipeptidice: aminoacizii constitueni trebuie s prezinte configuraie L i au n structura proteinelor aceeai valoare, deoarece catenele lor laterale nu influeneaz structura secundar; distanele interatomice i unghiurile de valen trebuie s prezinte aceleai valori, indiferent de mrimea catenei polipeptidice; atomii participani la legtura peptidic trebuie s fie coplanari, aceast aezare fiind favorizat energetic; modelul experimental elaborat pe baza datelor de laborator trebuie s permit formarea unui numr maxim posibil de legturi de hidrogen. Pe baza acestor postulate, Pauling i Corey gsesc c cel mai simplu aranjament corespunztor acestor cerine este modelul helicoidal sau spiralat, denumit -helix. Acesta rezult prin spiralizarea catenei polipeptidice n jurul unui cilindru imaginar (fig. 19). n funcie de direcia de spiralizare, -helixul poate s apar teoretic sub dou forme: -helixul de dreapta are sensul unui urub cu pasul spre dreapta; -helixul de stnga are sensul unui urub cu pasul spre stnga. Catenele laterale ale resturilor de aminoacizi ies n afara corpului propriu-zis al helixului i pot interaciona ntre ele sau cu solventul n care este dizolvat proteina. Dintre toi aminoacizii proteinogeni, prolina, hidroxiprolina i chiar glicocolul nu se ncadreaz perfect n -helix, determinnd o deranjare a structurii regulate a acestuia. Aceast structur helicoidal a macromoleculelor proteice a fost postulat cu 16 ani naintea lui Pauling i Corey de ctre biochimistul romn Haralamb Vasiliu.

Fig. 19. Reprezentarea schematic a modelului -helicoidal al structurii secundare a proteinelor (Koolman, J. et al. 2005).

Aezarea spaial, care confer moleculei o arhitectur structural special, este meninut datorit formrii unui mare numr de puni de hidrogen intracatenare la care particip oxigenul carbonilic din vecintatea unei legturi peptidice i hidrogenul iminic din vecintatea alteia, situat la o distan de 4 resturi de aminoacizi. Aceste puni de hidrogen sunt aproape paralele cu axul moleculei deoarece ntr-o spir intr 3,6 resturi de aminoacizi. Distana dintre dou spire succesive este de 5,41 , iar diametrul lor este de 0,101 . Dup un interval al -helixului care cuprinde 18 resturi de aminoacizi, adic 27 , -helixul este superpozabil, adic se repet identic dup fiecare 5 spire. Acest interval reprezint aanumita perioad mare de identitate (perioada mic de identitate fiind reprezentat de secvena NH *CH CO ). Modelul helicoidal a fost apoi confirmat experimental i reprezint una din variantele structurii secundare a proteinelor. Multe date experimentale demonstreaz ns faptul c proteinele native nu prezint o structur secundar total sau perfect spiralat. Cele mai multe proteine prezint o organizare structural parial helicoidal, n sensul c regiuni cu structur de -helix pot alterna cu regiuni ce prezint alt tip de structur secundar. Procentul de -helix n structura proteinelor oscileaz ntre: 0 10% n cazein, actin i -globulin, 10 20% n ribonucleaz, 20 30% la pepsin i histone, 30 45% la ovalbumin, muramidaz i fibrinogen, 60 80% la mioglobin i hemoglobin i respectiv 80 100% n tropomiozin. Structura -pliat. Datorit structurii lor chimice, prolina i hidroxiprolina nu se nscriu n structura -helicoidal. Aceti doi aminoacizi heterociclici, dar i glicocolul, tind s confere catenelor polipeptidice un alt tip de structur secundar, denumit -conformaie, care corespunde modelului straturilor pliate. Conform acestui model, dou sau mai multe catene polipeptidice, sau fragmente ale aceleiai catene se orienteaz spaial sub form pliat, n zig-zag (fig. 20). Modelul straturilor pliate se poate prezenta n dou variante:

modelul straturilor pliate paralele (caracteristic de exemplu pentru -keratin) se ntlnete atunci cnd la o extremitate a moleculei sunt orientate capetele C-terminale, iar la cealalt, capetele N-terminale ale catenelor polipeptidice; modelul straturilor pliate antiparalele (ntlnit de exemplu la fibroin) se caracterizeaz prin faptul c la ambele extremiti ale moleculei capetele C-terminale ale catenelor polipeptidice alterneaz cu cele N-terminale. n mod automat, atunci cnd structura -pliat este format de diferite fragmente ale aceleiai catene polipeptidice, aceasta va fi de tip antiparalel.

Fig. 20. Reprezentarea schematic a modelului straturilor -pliate ale structurii secundare a proteinelor (a structura antiparalel; b structura papalel) (Koolman, J. et al. 2005).

Structura -pliat este stabilizat de puni de hidrogen care se formeaz n mod similar ca n cazul structurii helicoidale, dar care sunt intercatenare i perpendiculare pe axul moleculei. Dac la -helix radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi sunt orientai spre exterior, n structura -pliat ei se orienteaz de o parte i de alta a planului legturii peptidice, perpendicular pe acesta. Exist foarte puine proteine a cror structur s fie exclusiv -helicoidal sau exclusiv -pliat. Marea majoritate a proteinelor prezint structuri secundare n care unul sau mai multe fragmente -helicoidale alterneaz cu unul sau mai multe fragmente -pliate. De regul, punctele de trecere de la fragmentele helicoidale la cele pliate i invers sunt reprezentate de resturile de prolin i hidroxiprolin i uneori de cele de glicin, aminoacizi care, din cauza structurii lor chimice, nu se nscriu n nici una din aceste dou forme structurale. n funcie de numrul de fragmente helicoidale i pliate, structurile secundare ale proteinelor pot fi de mai multe tipuri: , , , etc. (fig. 21).

Fig. 21 .Reprezentarea grafic a structurii secundare a proteinelor: a structur de tip , b structur de tip , c structur de tip , d structur de tip (Branden, C. et al. 1999)

Structura teriar a macromoleculelor de proteine este dat de superspiralizarea catenei (catenelor) polipeptidice ntr-o structur spaial complex sub form de ghem (globul). Superspiralizarea este generat de formarea punilor disulfidice ntre resturi de cistein aflate n locuri total diferite ale catenei polipeptidice. Majoritatea proteinelor native au o structur spaial compact determinat de dimensiunile i polaritatea resturilor de aminoacizi precum i de succesiunea acestora n catenele polipeptidice componente. Acest nivel de organizare structural reprezint deci rezultatul interaciunilor dintre resturile aminoacizilor din catenele polipeptidice. Structura teriar este definit ca fiind forma structural ce rezult prin superspiralizarea a dou sau mai multe catene polipeptidice ce conin fragmente -helicoidale i -pliate ntr-o arhitectur spaial complex sub form de ghem sau globul, fiind deci direct dependent de nivelul primar i secundar de organizare structural (fig. 22).

Fig. 22. Reprezentarea schematic a modului de spiralizare i superspiralizare a unei catene polipeptidice cu formarea structurii secundare i teriare (Rayment, I. 2003)

Formarea unei structuri globulare native, caracteristic pentru o protein dat este un proces complex ce are la baz formarea unei multitudini de legturi slabe, necovalente. Principalele proteine ale cror structuri teriare au fost bine studiate sunt hemoglobina,

mioglobina, muramidaza, ribonucleaza, papaina, chimotripsinogenul, carboxipeptidaza A, subtilizina i altele. Meninerea i stabilizarea structurii teriare se realizeaz prin forele de atracie ce apar ntre radicalii aminoacizilor componeni care se pot orienta n aa fel nct s ajung n poziii favorabile formrii diferitelor tipuri de legturi. Dintre acestea, cele mai importante sunt urmtoarele: legturile de hidrogen se formeaz ntre gruprile fenolice ale resturilor de tirozin i respectiv grupele COOH aparinnd resturilor de acid aspartic i glutamic, sau ntre nucleul imidazolic al histidinei i grupa OH a serinei; legturile ionice se formeaz ntre grupele COOH ale acizilor aspartic i glutamic i grupele NH2 ale lizinei i argininei. Numrul legturilor ionice este relativ mic, deoarece majoritatea grupelor funcionale ionizate interacioneaz cu dipolii apei. Conformaia proteinelor n soluie este de aa natur nct un numr ct mai mare de grupri polare s fie expuse la suprafaa arhitecturii moleculare, cu gruprile hidrofobe orientate, de regul, spre interiorul moleculei; legturile van der Waals se formeaz ntre resturile hidrocarbonate ale aminoacizilor. Aceste interaciuni sunt date, n principal, de resturile de alanin, fenilalanin, leucin, valin, izoleucin etc. Majoritatea radicalilor nepolari, hidrofobi ai acestor aminoacizi se orienteaz spre interiorul moleculei asigurnd stabilitatea structurii acestora. Radicalii polari, ionizai, ai unor aminoacizi (n primul rnd cei de arginin, lizin, acid aspartic i acid glutamic) sunt orientai spre exteriorul moleculei proteice unde interacioneaz cu dipolii apei din mediu. Datorit apariiei interaciunilor enumerate mai sus este asigurat pe de o parte stabilitatea structurii tridimensionale i, pe de cealalt parte, conformaia optim din punct de vedere termodinamic. Pe de alt parte, diversitatea tipurilor de legturi ntlnite n structura teriar a proteinelor, precum i valorile energiilor de legtur, explic marea labilitate a proteinelor sub aciunea diverilor factori fizico-chimici cum ar fi pH-ul mediului, temperatura, presiunea osmotic, prezena sau absena unor substane chimice etc. Observaie!Dezorganizarea structurii teriare, care este foarte complex i variat, determin pierderea proprietilor biologice ale proteinelor! Deseori se pot produce modificri foarte mici n conformaia determinat de structura teriar prin legarea ntr-un mod oarecare (de exemplu adsorbie) a unui compus chimic cu mas molecular mic. Aceste modificri conformaionale poart numele de efect alosteric i joac un rol extrem de important n reglarea activitii enzimelor. n ceea ce privete forma moleculelor proteice care este dat de structura secundar i teriar a acestora, se cunosc dou tipuri extreme (proteine fibrilare i respectiv proteine globulare), majoritatea proteinelor avnd ns structuri intermediare. Forma moleculelor proteice nu depinde numai de factorii ce in de nsi structura proteinelor ci i de factorii de mediu. Replierea i superspiralizarea catenelor polipeptidice depind de pH-ul mediului, de salinitatea acestuia, de prezena sau absena anumitor compui chimici, de presiunea osmotic, de temperatur etc., ceea ce explic marea variabilitate funcional a proteinelor n raport cu mediul de reacie, precum i faptul c unele proteine fibrilare pot trece n form globular i invers, odat cu modificarea caracteristicilor mediului. Structura cuaternar este cel mai nalt nivel de organizare structural, ntlnit doar la unele proteine. Prin structura cuaternar se nelege asocierea a dou sau mai multe catene polipeptidice (monomeri, protomeri), fiecare cu structura ei primar, secundar i teriar, ntro arhitectur spaial complex (oligomeri). Subunitile componente ale unei macromolecule proteice cu structur cuaternar pot fi separate prin metode specifice, relativ blnde, fr ruperea vreunei legturi covalente.

10

Stabilizarea structurii cuaternare se realizeaz prin formarea de interaciuni ntre subuniti, pe seama grupelor funcionale libere ionizate, gruprilor hidrofobe, grupelor sulfhidrilice etc. Molecula tinde s formeze, att n interiorul ei ct i cu moleculele solventului, un numr de legturi ct mai mare posibil, deci tinde spre un nivel minim al energiei libere i o stabilitate maxim. Pentru majoritatea enzimelor, acest nivel minim de energie este atins spontan i corespunde conformaiei lor biologic active (fig. 23).

Fig 23. Reprezentarea schematic a interaciunilor ce stabilizeaz structura cuaternar a proteinelor (Koolman, J. et al. 2005).

Stuctura cuaternar este extrem de important pentru enzimele ce prezint o astfel de structur. Unele enzime cu structur cuaternar prezint activitate catalitic doar n forma oligomer, n timp ce la altele, activitatea catalitic este decelat att la forma nativ ct i la subunitile separate. ntr-o enzim oligomer, subunitile pot fi identice sau diferite. n general, enzimele sunt compui macromoleculari, cu mas molecular extrem de variat care oscileaz ntre 10.000 i cteva milioane de daltoni (1 dalton = 1/12 din masa atomic a 12C, adic 1,66.10-24 g). Proteinele prezint numeroase proprieti fizico-chimice importante pentru extracia i purificarea lor din diferite surase biologice printre care i capacitatea de a precipita sub aciunea unor factori specifici. n funcie de comportarea moleculelor dup ndeprtarea agentului precipitant, aceasta poate fi de dou tipuri: precipitare reversibil i ireversibil sau denaturare. Precipitarea reversibil are loc atunci cnd, dup ndeprtarea agentului precipitant (de exemplu prin dializ), enzima redevine solubil. Aceast proprietate este utilizat frecvent n tehnicile de separare i purificare a enzimelor din cele mai diferite surse biologice. n aceste tehnici, aproape ntotdeauna se realizeaz n prima faz o precipitare fracionat a enzimelor prin utilizarea unor concentraii succesive ale agentului precipitant (sulfat de amoniu, etanol, aceton, alcool izopropilic etc.). Enzimele astfel precipitate se separ apoi prin centrifugare sau filtrare dup care se nltur agentul precipitant prin diferite metode (dializ, diluie etc.) pentru a le redizolva. Precipitarea ireversibil sau denaturarea are loc atunci cnd enzima rmne n stare solid chiar i dup ndeprtarea agentului precipitant (uree, guanidin, dodecilsulfat de sodiu, valori extreme de pH, temperaturi ridicate etc.). De regul, precipitarea este nsoit de

11

pierderea complet a activitii catalitice, motiv pentru care, denaturarea reprezint principala modalitate de stopare a activitii enzimatice in vitro n enzimologia practic.

IV. ACIZII NUCLEICI

Acizii nucleici sunt substane macromoleculare greu solubile n ap rece, puin solubile n ap la cald i uor solubile n soluii alcaline diluate. Sunt insolubile n etanol i n numeroi ali solveni organici care, adugai peste soluiile de acizi nucleici, determin denaturarea lor. Degradarea hidrolitic succesiv a nucleoproteinelor n mediu acid sau alcalin, sau n prezena unor enzime proteolitice specifice numite nucleaze realizeaz clivarea celor dou componente: acidul nucleic (ARN sau ADN) i componenta proteic. Hidroliza n continuare a acizilor nucleici conduce la formarea nucleotidelor care reprezint unitile lor structurale e baz. La rndul lor, nucleotidele pot fi hidrolizate n continuare sub aciunea unor fosfoesteraze cu formare de nucleozide i fosfor anorganic. Degradarea nucleozidelor conduce la obinerea unui amestec de baze azotate i pentoze. Din cele afirmate mai sus rezult c prin condensarea unei baze azotate cu o pentoz se formeaz un nucleozid. Nucleozidele se pot fosforila la nivelul grupelor hidroxilice libere ale restului de pentoz cu formare de nucleotide, iar polimerizarea (sau mai exact ncatenarea) nucleotidelor conduce la formarea acizilor nucleici. Deci, din punct de vedere structural, acizii nucleici sunt polinucleotide care, n funcie de natura pentozei se clasific n poliribonucleotide (n ARN) i respectiv polideoxiribonucleotide (n ADN).

IV.1. Bazele azotate purinice i pirimidinice

Bazele azotate din structura nucleozidelor i nucleotidelor sunt compui heterociclici ce deriv de la dou cicluri de baz numite pirimidin i purin prin substituirea unor atomi de hidrogen:
4 5N 6 N 1 3 2 1N 2 6 5 7 N 8 N 4 3 N9 H

Pirimidin

Purin

Principalele baze azotate purinice sunt adenina i guanina, iar cele pirimidinice sunt citozina, timina i uracilul:

NH2
N N N N H HN

O
N N N H

Adenin

H2N

Guanin

12
NH2
N HN N H

O
HN N H

O CH 3
N H

Citozin

Uracil

Timin

Compoziia n baze azotate a acizilor nucleici este urmtoarea: moleculele de ADN conin adenin, guanin, citozin i timin, iar cele de ARN au n compoziia lor adenin, guanin, citozin i uracil. Deci, din punctul de vedere al compoziiei n baze azotate, cele dou tipuri de acizi nucleici difer doar printr-o baz azotat pirimidinic (timin n ADN i respectiv uracil n ARN). n afara acestor baze azotate care intr constant n structura acizilor nucleici, mai exist i alte baze purinice i pirimidinice naturale. Astfel, unii derivai naturali ai purinelor se gsesc n stare liber n cteva plante tropicale i au o puternic aciune farmacologic. De exemplu, boabele de cacao conin teobromin, frunzele de ceai conin teofilin, iar boabele de cafea conin cafein:
O
N N N N H HN

H3C O

CH3
N

H3C O

O
N N

CH3
N N

CH3 Teofilin

CH3 Teobromin

CH3 Cafein

Toate aceste substane sunt diuretice, iar cafeina este un excitant al sistemului nervos central i un puternic stimulator al muchiului cardiac. Datorit importanei lor practice pentru medicin, muli derivai ai bazelor azotate purinice i pirimidinice cu aciune farmacologic se obin i prin sintez chimic. n organismele vii se mai ntlnesc i alte baze azotate care sunt produi intermediari de degradare a celor ce intr n structura acizilor nucleici sau ai degradrii altor biomolecule. Astfel, prin dezaminarea guaninei se formeaz xantina. Dezaminarea adeninei sub aciunea xantin-oxidazei conduce la formarea hipoxantinei. La rndul ei, hipoxantina constituie precursorul xantinei n care trece prin oxidare enzimatic sub aciunea aceleiai xantin-oxidaze. Prin oxidarea n continuare a xantinei se formeaz acidul uric care este principalul produs de excreie a azotului acizilor nucleici la reptile i psri:
O
HN N N H N H HN N

O
N N H HN

H N

O
N H N H

Xantin

Hipoxantin

Acid uric

O alt baz azotat natural este acidul orotic care este precursorul acidului orotidilic din calea de biosintez a bazelor azotate pirimidinice. Ali derivai ai bazelor pirimidinice sunt

13

acidul barbituric care are o aciune sedativ i hipnotic, tiouracilul care prezint proprieti antitiroidiene i este folosit ca medicament n hipertiroidism i tireotoxicoz i alii:
O
HN N N H

OH I
HN N

COOH

HO

OH

N H

Acid orotic

Acid barbituric

Tiouracil

n organismele vii se ntlnesc uneori i unele baze azotate neobinuite, numite baze minore. Astfel, n ARNt din plante i animalele superioare se gsesc 5-metilcitozina, dihidrouracilul etc., iar la unii fagi se ntlnete 5-hidroximetil-citozina:
NH 2
N

O
HN N N H

NH 2 CH 2OH
N H

CH 3
N H

5-Metilcitozin

4,5-Dihidrouracil

5-Hidroximetilcitozin

Principalele baze azotate purinice minore sunt 1-metil-adenina, 2-metil-adenina, 7metil-guanina, 6-dimetil-amino-purina, 6-hidroxi-2-metil-amino-purina etc.:
NH2 H3CN
N N N H N

NH2
N N N H HN

CH3
N

H3C

H2N

N H

1-Metiladenina

2-Metiladenina

7-Metilguanina

H3CNCH3
N N N N H N

OH

N N

H3CNH

6-Dimetilaminopurina

6-Hidroxi-2-metilamino-purina

14

Bazele azotate purinice i pirimidinice prezint o serie de proprieti fizico-chimice comune. Astfel, cu excepia uracilului, toate bazele azotate sunt greu solubile n ap. Pentru toate bazele azotate este caracteristic existena formelor tautomere. Tautomeria acestora conduce la modificarea structurii electronice i, implicit, la modificarea proprietilor fizicochimice. Molecula adeninei neutre prezint dou forme tautomere (amino imino i prototrop), iar guanina are cea mai mare capacitate de a forma tautomeri datorit prezenei grupei carbonil n poziia 6 care d i tautomerie ceto-enolic. n soluii apoase neutre, citozina poate da att tautomerie amino imino ct i tautomerie ceto-enolic, iar pentru uracil i timin sunt mai stabile formele dicetonice. Datorit faptului c bazele azotate purinice i pirimidinice conin n molecul un heterociclu cu caracter aromatic ele sunt capabile s absoarb radiaiile electromagnetice din domeniul ultraviolet. Fiecare baz azotat din structura acizilor nucleici prezint un spectru specific de absorbie la lungimi de und cuprinse ntre 200 300 nm, cu un maximum de absorbie la 260 280 nm.

IV.2. Pentozele din structura acizilor nucleici

n structura acizilor ribonucleici intr riboza sub forma sa furanozic, anomer . Moleculele de ADN conin un derivat al acesteia (2-deoxiriboza) sub forma anomerului al ciclului furanozic:

CH 2OH

CH 2OH

-D-ribofuranoza

-D-2-deoxi-ribofuranoza

Resturile de pentoz se leag de bazele azotate prin legturi Nglicozidice la nivelul atomului N1 al bazelor pirimidinice, respectiv N9 al bazelor azotate purinice.

IV.3. Nucleozide
Nucleozidele sunt Nglicozide ale bazelor azotate purinice i pirimidinice n care gliconul este reprezentat de riboz, respectiv 2-deoxiriboz. Restul de pentoz, sub form D-furanozic, este legat de baza azotat printr-o legtur -glicozidic astfel: hidroxilul glicozidic (deci cel legat de atomul de carbon C1) se condenseaz cu hidrogenul iminic al atomului de azot din poziia 9 a bazelor purinice, respectiv din poziia 1 a celor pirimidinice. DOAR ADENOZINA

15
NH 2
N N N
5'

O
HN N N N

N
1' 2'

CH 2OH
4' 3'

H2N

CH 2OH

Adenozin

Guanozin

NH 2
N HN N

CH 2OH

CH 2OH

Citidin
NH2
N N N N HN

Uridin
O
N N N

CH2OH

H2N

CH2OH

Deoxiadenozin
NH2
N HN N

Deoxiguanozin
O CH3
N

CH2OH

CH2OH

Deoxicitidin

Deoxitimidin

Pentru evitarea oricror confuzii legate de numerotarea atomilor n nucleozide, aceasta se face astfel: 1, 2, 3,.. pentru atomii ce alctuiesc baza azotat i respectiv 1, 2, 3,.. pentru atomii restului de pentoz. Denumirea nucleozidelor ce intr n structura acizilor nucleici se face n funcie de numele bazelor azotate (tab. VI). Tabelul VI Nucleozidele din structura acizilor nucleici Baza azotat Ribonucleozide Deoxiribonucleozide Adenina Adenozina Deoxiadenozina Guanina Guanozina Deoxiguanozina Citozina Citidina Deoxicitidina Timina Deoxitimidina Uracilul Uridina

16

n organismele vii exist i alte nucleozide ce ndeplinesc diferite funcii biochimice. Un exemplu concret n acest sens l reprezint nucleozidele ce intr n structura coenzimelor piridin-nucleotidice (NAD+ i NADP+), a celor flavinice (FMN, FAD) i a coenzimei A. n esuturile vegetale i animale, precum i la microorganisme, se ntlnesc i alte nucleozide ce nu intr n structura acizilor nucleici; acestea sunt intermediari n biosinteza i catabolismul acizilor nucleici. Unele dintre ele, cum ar fi inozina i xantozina, se ntlnesc i n stare liber n celule:

OH
N N N N N

OH
N N N

CH2OH

HO

CH2OH

Inozina

Xantozina

Se cunosc de asemenea numeroase nucleozide de sintez sau naturale care au o puternic aciune bactericid i respectiv antitumoral. Dintre acestea, cele mai importante sunt nebularina, nucleocidina, psicofuranina, puromicina, angustimicina i cordicepina.

IV.4. Nucleotide
Nucleotidele sunt esteri ai nucleozidelor cu acidul fosforic. Ele conin n molecula lor restul unei baze azotate purinice sau pirimidinice, un rest de riboz sau deoxiriboz i unul pn la trei resturi de acid fosforic. n funcie de restul de pentoz pe care l conin, nucleotidele sunt de dou tipuri: ribonucleotide i deoxiribonucleotide. n funcie de numrul resturilor de acid fosforic din molecul ele pot fi mono-, di i trifosforilate (nucleozidmonofosfai, nucleozid-difosfai i respectiv nucleozid-trifosfai). Teoretic, esterificarea nucleozidelor se poate face n poziiile 2, 3 i 5 n cazul ribonucleozidelor i respectiv 3 i 5 la deoxiribonucleozide. n structura acizilor nucleici sunt esterificate doar grupele alcoolice din poziiile 3 i 5 att la ribonucleotide ct i la deoxiribonucleotide. Nucleotidele monofosforilate (nucleozid-monofosfaii) se gsesc n stare liber n drojdia de bere i n esutul muscular i se deosebesc ntre ele prin poziia restului de acid fosforic. Astfel, acidul adenilic din muchi este acidul adenozin-5-monofosforic (5-AMP), iar cel din levuri este acidul adenozin-3-monofosforic (3-AMP). Mai exist i acidul adenozin3,5-monofosforic ciclic (cAMP) cu rol de mesager secundar n aciunea hormonilor:

DOAR ACID ADENOZIN 5 MONOFOSFORIC

17
NH2
N N N N

NH2 O II CH2OPOH I OH
N N N N

CH2OH

Acid adenozin-5'-monofosforic (5'-AMP)

O II O POH I OH Acid adenozin-3'-monofosforic (3'-AMP)

NH2
N N N N

CH2 O O O POH

cAMP

Nucleotidele celorlalte baze azotate se formeaz n mod similar. Adenina mai st la baza structurii a numeroi derivai nucleotidici ce joac un rol important n procesele de activare a acizilor grai i a aminoacizilor. Dintre acetia, cei mai importani sunt aminoaciladenozin-monofosfaii, acil-adenozin-monofosfaii, acidul adenozin-5-fosfo-sulfuric i acidul adenozin-3-fosfat-5- fosfo-sulfuric. Adenina st de asemenea la baza structurii familiei de compui cunoscui sub denumirea de acizi adenilici care sunt substane macroergice larg rspndite n toate celulele vii (acidul adenozin-difosforic ADP i acidul adenozin-trifosforic ATP). SI FORMULA DE MAI JOS
NH 2
N N N N

O O O II II II CH 2 O PO ~ P O ~ P OH I I I OH OH OH

AMP ADP ATP

Rolul acestora este de a acumula i de a ceda energia, n funcie de necesitile de moment ale celulei. Resturile de acid fosforic din moleculele de ADP i ATP sunt unite ntre

18

ele prin legturi speciale, numite legturi macroergice. La acest nivel, energia de legtur este de 3 4 ori mai mare dect n cazul celorlalte legturi fosfoesterice. Toate bazele azotate purinice i pirimidinice pot forma nucleotide trifosforilate, structura lor asemnndu-se cu cea a ATP-ului cu deosebirea c difer baza azotat, dar dintre derivaii trifosforilai ai nucleozidelor, n afar de ATP, numai GTP i ITP intervin n unele procese energetice celulare. n afar de rolul lor energetic, nucleozidtrifosfaii sunt utilizai n celul i pentru biosinteza acizilor nucleici. Un rol deosebit n procesele metabolismului intermediar l ndeplinesc ns i nucleoziddifosfaii ADP, GDP, UDP i CDP. n toate organismele vii, n afara nucleotidelor ce intr n mod frecvent n structura acizilor nucleici se mai ntlnesc i alte nucleotide ce ndeplinesc diferite funcii biochimice: cofactori enzimatici, precursori sau intermediari n diferite ci de biosintez, donori de grupri fosfat sau sulfat, activatori ai monozaharidelor n vederea biosintezei poliglucidelor etc.

IV.5. Acizii ribonucleici

Acizii ribonucleici (ARN) sunt compui biochimici informaionali prezeni n absolut toate organismele vii. Ei sunt substane macromoleculare alctuite din uniti structurale de baz numite ribonucleotide, deci sunt substane poliribonucleotidice. Raporturile molare dintre bazele azotate purinice i pirimidinice din ARN variaz ntre limite foarte largi, ns suma A+C este egal ntotdeauna cu suma G+U. n celulele vii exist mai multe tipuri de ARN. ARN ribozomal (ARNr) intr n structura ribozomilor i reprezint aproximativ 80% din totalul ARN-ului celular. Acest tip de ARN se caracterizeaz printr-o mare stabilitate metabolic i are masa molecular cuprins ntre 500.000 2.000.000 Da. ARN de transport (ARNt) reprezint aproximativ 15% din totalul ARN-ului celular, are masa molecular cuprins ntre 25.000 28.000 Da i are rolul de a activa i de a transporta n mod specific aminoacizii din citosol la nivelul ribozomilor n vederea biosintezei proteice. ARN mesager (ARNm) sau informaional (ARNi) reprezint numai 5% din totalul ARN-ului celular. Are o durat de via relativ scurt, este deosebit de activ i prezint o mas molecular de aproximativ 500.000 Da. Rolul biologic al ARNm este acela de a copia informaia genetic codificat n ADN-ul din cromozomi. n afar de aceste trei tipuri principale de ARN, mai exist i alte forme speciale, cu funcii biochimice specifice. ARN-ul virusurilor reprezint ntre 5 40% din nucleoproteinele ce intr n structura virusurilor. De exemplu, ARN-ul din virusul mozaicului tutunului (VMT) este o macromolecul cu masa molecular de 2.000.000 Da i reprezint aproximativ 5% din masa virusului. Se prezint sub forma unei singure catene spiralate, nconjurat de o protein oligomer de tip histonic, format din 2.100 subuniti dispuse, de asemenea, sub form spiralat. ARN-ul din virusul mozaicului tutunului este infecios i n stare pur, iar capacitatea sa de a infecta tutunul este anulat dup prelucrarea preparatului pur cu ribonucleaz. Virusurile gripei, ciumei i mieloblastozei aviare au o form sferic i conin ntre 1 3% ARN viral. Bacteriofagii pot conine, de asemenea, n celula lor numai ARN, fr a exista i ADN. Ponderea ARN-ului poate ajunge pn la 31% din masa fagului. Structura primar a ARN-ului. Analiza structurii produilor de hidroliz n mediu alcalin ai moleculelor de ARN a artat c legtura dintre monomerii ribonucleotidici se realizeaz prin intermediul gruprilor fosfodiesterice care unesc C3 i C5 din dou nucleotide vecine. Molecula de ARN se prezint astfel sub forma unei catene liniare, n care bazele azotate purinice i pirimidinice sunt localizate n calitate de radicali laterali (fig. 26) SI FORMULA DE JOS

19

. . .

O HO P = O O
N

NH 2 I
N N

CH 2 N O

O HO P = O O
N N

P
O
NH

5' 3' A

5' P
NH 2

CH 2 N O

G
O HO P = O O CH 2 O
N

P
NH 2
N

C P
O

5' P
O
NH N

3'

O HO P = O O CH 2 O

3'

O HO P = O O

. . . .

Fig. 26. Formula molecular i reprezentarea schematic a structurii primare a ARN-ului

Utilizndu-se o serie de enzime hidrolitice pure, cum ar fi fosfodiesteraza din veninul se arpe, ribonucleaza T, fosfataza alcalin i altele, s-a determinat structura primar a ARNului care este definit ca fiind dat de numrul, natura i succesiunea nucleotidelor n catena poliribonucleotidic a ARN. Structura secundar a ARN-ului. Pentru moleculele de ARN, structura secundar a fost studiat mai puin dect structura secundar a ADN-ului. n prezent, este cunoscut aceast structur numai pentru moleculele de ARNt i pentru ARN-ul izolat din Escherichia coli. n soluii cu trie ionic mic, moleculele de ARN se comport ca lanuri polielectrolitice tipice, iar prin creterea triei ionice a soluiei, catenele se scurteaz, acest fenomen fiind nsoit de micorarea densitii specifice i de modificarea constantei de sedimentare. Prin metoda difraciei de raze X s-a demonstrat c bazele azotate pot forma dou i respectiv trei puni de hidrogen astfel: SI RELATIA AU, G-C

20
A U G C

Numrul legturilor duble ce se formeaz ntre bazele azotate este determinat de structura chimic a acestora. Astfel, ntre adenin i uracil se formeaz dou puni de hidrogen, iar ntre guanin i citozin trei asemenea legturi conform schemei:
O
HN N H
HNH I

N N

N N

O Uracil
H I NH
HN

I H

Adenin
O H N HN I H
N N

N O

I H

Citozin

Guanin

S-a demonstrat c moleculele de ARN sunt reprezentate de cte o caten poliribonucleotidic care prezint segmente spiralate ce alterneaz cu regiuni nespiralate (fig. 27). Se presupune c la formarea regiunilor spiralate pot participa ntre 40 i 70% din resturile de mononucleotide ale moleculei. Aceast structur se explic prin aceea c n lanul polipeptidic al moleculei de ARN exist fragmente ale cror succesiuni de baze azotate sunt complementare cu succesiunile de baze azotate existente n alte fragmente ale aceleiai molecule, complementaritatea constnd n modul de formare a punilor de hidrogen i numrul acestora. Fragmentele moleculare nespiralate create de spiralizarea unor astfel de zone poart numele de bucle.
G C A U C U G ....... C ....... G ....... ....... U ....... A ....... G ....... C ....... ....... A ....... U U A C U G A

bucl

fragm ent dublu spiralat

A G C G U U A G C

Fig. 27. Reprezentarea schematic a fragmentelor spiralate i nespiralate din moleculele de ARN

Structura teriar a ARN-ului. n ultimele decenii, toate datele experimentale privind structura ARNt au indicat faptul c acest tip de ARN prezint i o structur teriar i c funciile sale biochimice pot fi mult mai numeroase dect s-a crezut. Conform acestor cercetri, moleculele de ARNt prezint dou stri conformaionale reversibile ce se deosebesc ntre ele din punctul de vedere al activitii biologice, precum i dup comportarea loc cromatografic. n cazul ARN-ului de transport, structura teriar este dat de una din aceste stri conformaionale care este forma superspiralizat.

IV.6. Acizii deoxiribonucleici

21

Acizii deoxiribonucleici (ADN), din punct de vedere structural sunt polideoxiribonucleotide, adic sunt compui macromoleculari alctuii dintr-un numr mare de uniti structurale de baz numite deoxiribonucleotide. ADN-ul are masa molecular cuprins ntre 106 109 Da i este localizat aproape exclusiv n nucleul celular. La eucariote, ADN-ul se gsete ntr-o cantitate de aproximativ 2 mg/gram de esut umed i poate fi gsit, n cantiti mult mai mici i n mitocondrii sau chiar n citoplasm. Bacteriile i unele virusuri conin ADN, dar n acest caz el nu este localizat ntr-o structur morfologic definit. Cantitatea de ADN n celulele unei specii de vieuitoare este ntotdeauna aceeai i depinde de numrul de cromozomi. n cursul diviziunii celulare, cantitatea de ADN se dubleaz pentru ca n mitoz s se reduc la jumtate n aa fel nct celulele fiice diploide s conin aceeai cantitate de ADN ca i celulele parentale caracteristice speciei. n celulele haploide (gamei) cantitatea de ADN este njumtit deoarece prin fecundare are loc restabilirea cantitii de ADN specific speciei respective, iar n celulele poliploide cantitatea de ADN corespunde gradului de poliploidie al speciei. Macromoleculele de ADN sunt alctuite din uniti monomere de baz care sunt mononucleotide ale 2-deoxiribozei i anume dAMP (deoxiadenozin-monofosfat), dGMP (deoxigu-anozin-monofosfat), dCMP (deoxicitidin-monofosfat) i dTMP (deoxitimidinmonofosfat) legate ntre ele prin puni 3,5fosfodiesterice. Compoziia macromoleculelor de ADN n baze azotate purinice i pirimidinice este caracteristic pentru fiecare organism n parte (deci nu pentru fiecare specie!) i rmne aceeai indiferent de vrst, de condiiile fiziologice sau de condiiile de mediu. n urma unui studiu referitor la coninutul n ADN al genomului a peste 1100 de plante superioare i peste 1300 de specii de plante inferioare s-a constatat c toate organismele cu o cantitate de ADN n genom mai mic de 5103 pg sunt considerate procariote, iar cele cu o cantitate mai mare de 3,610-2 pg sunt eucariote. Structura primar a ADN-ului este dat de numrul, natura i succesiunea deoxiribonucleotidelor n catenele moleculelor de ADN. Spre deosebire de ARN, macromoleculele de ADN sunt dublu-catenare. Una din catene este complementar cu cealalt din punctul de vedere al succesiunii bazelor azotate datorit specificitii formrii punilor de hidrogen ntre acestea: SI RELATA C-G T-A
C G
si

A
HNH I

sau

CH 3 I O
HN N H

N N

N N
I

O Timin

Adenin H

H I NH
HN

O H N HN I H
N N

N Guanin

O Citozin

I H

Structura dublu catenar este meninut datorit acestor puni de hidrogen. Structura primar dublu-catenar a macromoleculelor de ADN poate fi reprezentat n mod similar cu cea a ARN-ului (fig. 28). DE JOS NU

22

. . .
HO P = O O CH 2 O
N N

NH 2 I
N N

. . .
O HN O
N

HO P = O O CH 3 CH 2 O

O HO P = O O CH 2 O
N N N

O
NH

NH 2
N

O HO P = O O

NH 2

CH 2

O HO P = O O CH 2 O
N

O NH 2
N

O H N O H2N
N N N

HO P = O O O CH 2

O HO P = O O
H3C

O NH 2 I
N NH N N

HO P = O
N N

O O CH 2

CH 2 O

O O HO P = O O HO P = O O

. . . .

. . . .

Fig.28. Formula molecular a dubluhelix-ului de ADN

Schematic, un fragment tetranucleotidic al moleculei de ADN poate fi reprezentat astfel:

ASTA DA

23
3' 3' 5' P G P C P 5' P 5' 5' 3' 3' T A P 3' G P C P P 3' A T 3' P P 5' 5'

Cele dou catene polideoxiribonucleotidice au o orientare antiparalel. Aceasta nseamn c la fiecare extremitate a moleculei, una din catenele polinucleotidice este orientat cu captul 5OH, iar cealalt cu captul 3OH liber, la cealalt extremitate orientarea fiind invers. Cele dou catene ale dublu helix-ului de ADN se unesc prin puni de hidrogen dup regula de mperechere a bazelor azotate purinice i pirimidinice. Structura secundar a ADN-ului. Studiul structurii moleculare a ADN-ului s-a realizat cu ajutorul metodei difraciei razelor X aplicat pe preparate nalt purificate. n urma acestor studii, precum i prin determinarea unor proprieti fizico-chimice ale ADN-ului, Chargaff elaboreaz regula care i poart numele conform creia numrul bazelor azotate purinice este egal cu cel al bazelor pirimidinice (A = T i G = C sau, altfel spus, A + G = T + C). Regula Chargaff a fost apoi confirmat prin faptul c bazele azotate formeaz puni de hidrogen n mod specific, aa cum se ntmpl i n cazul moleculelor de ARN. Lund n calcul toate aceste date experimentale, Watson i Crick au elaborat modelul tridimensional al structurii secundare a ADN-ului. Conform acestui model, molecula de ADN reprezint un dublu helix de dreapta i este alctuit din dou catene polideoxi-ribonucleotidice rsucite una n jurul celeilalte i ambele n jurul unui cilindru imaginar, bazele azotate fiind unite ntre ele prin puni de hidrogen (fig. 29).

Fig. 29. Reprezentarea schematic a dublu helix-ului de ADN

Fiecare tur de spir cuprinde 10 baze azotate i are o lungime de 3,4 . Cele dou catene polinucleotidice sunt complementare i orientate n sens contrar, adic sunt antiparalele. Bazele azotate purinice i pirimidinice din fiecare caten polinucleotidic se gsesc situate n planuri paralele ntre ele i perpendiculare pe axul moleculei. Bazele ce aparin unei catene sunt perechi cu bazele catenei polinucleotidice complementare i sunt situate n aceleai planuri. Structura moleculei de ADN prezint un ax de simetrie n jurul cruia se rsucete elicea. Aceast structur se caracterizeaz prin faptul c permite formarea unui numr maxim posibil de puni de hidrogen i c aceste legturi confer moleculei un maximum de stabilitate.

24

Wilkins a adus unele mici modificri modelului propus de Watson i Crick preciznd c exist dou tipuri de fose (concaviti) ntre dou spire succesive ale helixului fose mari i fose mici care dau posibilitatea moleculei de ADN s se combine sau s intre n contact cu diferii constitueni celulari cum ar fi histonele, unii hormoni, antibiotice, enzime etc. Aceasta nseamn c fosele confer acestor interaciuni o anumit specificitate. Structura de dublu helix a moleculei de ADN, confirmat de studiile de difracie a razelor X pe preparate de ADN de diferite proveniene, este n concordan cu numeroase proprieti fizice i chimice ale ADN-ului i poate explica rolul pe care acest acid nucleic l ndeplinete n celul unde particip la stocarea i transmiterea informaiei genetice. Modelul elaborat de Watson i Crick a fost confirmat experimental ntr-o serie de experiene efectuate pe E. coli n care s-a folosit metoda ultracentrifugrii n gradient de clorur de cesiu (CsCl). Tulpina E. coli a fost cultivat pe un mediu nutritiv ce coninea 15 NH4Cl n calitate de unic surs de azot. Colonia obinut sintetizeaz ADN marcat cu 15N. Ea a fost apoi rensmnat pe alt mediu nutritiv care coninea 14NH4Cl ca surs de azot i a fost lsat s se divid o singur dat. Din cele dou culturi de E. coli s-a extras i purificat ADN-ul i s-a msurat densitatea lui prin ultracentrifugare n gradient de CsCl. ADN monocatenar i ADN circular. n 1959 s-a reuit izolarea dintr-un bacteriofag ce infecteaz celulele de E. coli, a unui ADN format dintr-o singur caten polinucleotidic liniar ce conine 5.000 nucleotide. Acest tip de ADN se caracterizeaz prin A + G T + C, ceea ce nseamn c nici teoretic nu poate exista sub form de dublu helix. n acelai timp el d o reacie pozitiv cu formaldehida datorit faptului c gruprile amino ale bazelor azotate sunt libere i nu formeaz puni de hidrogen. De asemenea, este foarte sensibil fa de fosfodiesteraz care l hidrolizeaz imediat. Studii ulterioare au demonstrat faptul c aceast molecul de ADN poate exista sub dou forme: o form liniar, care este componenta S2 fr proprieti virulente i o form circular care este componenta S1 virulent i care rezult din forma liniar prin formarea unei legturi covalente ntre extremiti. Numeroi bacteriofagi conin ADN dublu spiralat n timp ce ali fagi au ADN monocatenar.
Tabelul VII.
Coninutul n ADN al nucleelor celulelor din diferite esuturi ale unor animale, n pg (1012 g)/nucleu(* Organul obolan Gin Bou Broasc Crap Ficat 6,4 2,6 6,4 15,7 3,3 Rinichi 6,7 2,3 6,3 Splin 6,5 2,6 Plmni 6,7 Leucocite 6,6 Eritrocite 2,6 15,0 3,5 Pancreas 7,3 2,7 Inim 6,5 2,5 Creier 2,3 Sperm 1,3 2,8 1,6
*)

Wolkenstein, M. W. 1965

Forma circular a moleculei de ADN a fost descoperit i n celulele de E. coli. Macromolecula de ADN extras din E. coli are o mas molecular de 2,81010 Da, conine peste 4 milioane de perechi de baze azotate i are o lungime care depete de 1.000 de ori conturul celulei de E. coli. Existena ADN-ului circular la acest microorganism este n concordan cu faptul c harta lui genetic este, de asemenea, circular. ADN-ul circular se ntlnete i n mitocondrii ntr-o concentraie de 4 6 molecule per mitocondrie. Acest tip de ADN se deosebete ns de cel nuclear prin compoziia n baze azotate. Masa sa molecular este de 1 milion sau un multiplu de 1 milion de daltoni i poate exista sub form circular ca monomer sau ca dimer, dar i sub form de dimer catenat.

25

Dat fiind faptul c principala funcie biologic a ADN-ului o constituie stocarea informaiei genetice, precum i faptul c fiecrei specii de vieuitoare i este specific un anumit numr de cromozomi, ponderea ADN-ului n nucleu difer de la o specie la alta. Experimental s-a demonstrat c exist diferene i n cadrul aceleiai specii, de la un organ la altul (tab. VII). Proprietile ADN-ului. Moleculele native de ADN de origine animal, vegetal sau microbian au dimensiuni i mase moleculare mari i nu pot fi obinute n stare intact din cauza instabilitii lor. Chiar i o simpl agitare sau precipitare determin depolimerizarea moleculei native cu formarea unor fragmente cu mase moleculare cuprinse ntre 5 i 10 milioane de daltoni. Determinarea exact a masei moleculare a ADN-ului prin metodele clasice este prejudiciat i de faptul c n celul se gsesc mai multe tipuri de ADN ce difer ntre ele din punctul de vedere al succesiunii bazelor lor azotate. Prin utilizarea metodelor clasice, cum ar fi determinarea vitezei de sedimentare, a densitii, a vscozitii etc., s-a obinut o mas molecular a ADN-ului de 106 Da. S-a demonstrat ns c ADN-ul din cromozomul bacteriofagului T2, care reprezint doar un fragment din molecula nativ, are o mas molecular de aproximativ 1,2108 Da i conine aproximativ 200.000 perechi de baze azotate, molecula avnd o structur spiralat. Metoda cea mai adecvat pentru determinarea masei moleculare a ADN-ului este autoradiografia. Pentru aplicarea acestei metode, bacteriile sau virusurile sunt cultivate pe un mediu cu timidin marcat radioactiv (un atom de hidrogen este nlocuit cu tritiu), obinnduse astfel molecule de ADN marcate cu tritiu. Preparatele electronomicroscopice sunt apoi montate pe o plac fotografic i se msoar dup developare, cu ajutorul microscopului electronic, lungimea urmelor rmase pe placa fotografic. Cunoscnd faptul c o baz azotat ocup 3,4 i cunoscnd masa molecular a mononucleotidelor, se calculeaz masa ntregii molecule de ADN. Pentru bacteriofagul T2 s-a determinat prin aceast metod masa molecular real care s-a dovedit a fi de 108 Da. Rezultate similare s-au obinut i pentru ADN-ul din E. coli care s-a dovedit a avea o mas molecular de 2109 Da. ADN-ul nativ prezint un spectru de absorbie n UV cu un maximum la 260 nm. Dac soluiile de ADN sunt nclzite sau sunt supuse unor variaii mari de pH, sau se modific constanta lor dielectric prin adugarea n soluiile lor apoase de cetone, alcooli, uree, amide, sruri ale metalelor grele etc., structura regulat a ADNului este distrus i are loc fenomenul de denaturare. n timpul denaturrii, legturile covalente din molecula ADN-ului rmn intacte, dar sunt distruse att punile de hidrogen dintre catenele polinucleotidice ct i interaciunile de natur hidrofob dintre bazele azotate. n asemenea situaii, molecula de ADN i pierde structura sa dublu helicoidal i trece ntr-o form dezordonat. Aceast modificare atrage dup sine schimbarea unor proprieti fizice cum ar fi creterea absorbiei la 260 nm, modificarea rotaiei optice, diminuarea vscozitii, creterea coeficientului de densitate etc. Creterea absorbiei la 260 nm pentru soluiile de ADN denaturat a fost definit ca fiind un efect hipercrom i el este reprodus n laborator ndeosebi sub aciunea temperaturii. Temperatura la care absorbia preparatelor de ADN crete brusc a fost denumit temperatur de fuziune Tm. Explicaia efectului hipercrom const n aceea c bazele azotate purinice i pirimidinice, n stare liber sau sub form de nucleozide i nucleotide, absorb la 260 nm dar valoarea absorbiei la aceeai lungime de und de ctre preparatele native de ADN nu reprezint o nsumare aritmetic a absorbiilor pariale ale bazelor azotate, ci este mai mic. Acest fenomen a fost denumit efect hipocrom. Dup denaturarea ADN-ului, efectul hipocrom dispare i absorbia la 260 nm crete direct proporional cu coninutul bazelor azotate perechi A T. Temperatura de fuziune a ADN-ului depinde liniar de coninutul bazelor azotate perechi G C, fapt justificat de existena a trei puni de hidrogen ntre aceste dou baze care aparin la dou catene polinucleotidice diferite, fa de dou puni de hidrogen care se formeaz ntre timin i adenin.

26

Diferite specii moleculare de ADN izolate din surse diferite au temperaturi de fuziune diferite datorit coninutului procentual diferit n guanin i citozin. Cu ct acesta este mai mare, cu att temperatura de fuziune este mai nalt, ceea ce demonstreaz nc o dat c perechea de baze guanin citozin confer moleculei de ADN o mai mare stabilitate. Dac preparatele de ADN sunt nclzite brusc la temperaturi mai mari dect temperatura de fuziune, cele dou catene polinucleotidice se despart. Rcirea lent, progresiv a unei astfel de soluii conduce la recombinarea specific a celor dou catene, cu refacerea dublei spirale. Acest fenomen este un proces de renaturare i conduce la obinerea unui ADN cu o densitate optic normal, iar n CsCl prezint aceeai densitate ca i ADN-ul nativ. Dac acest procedeu se aplic soluiilor care conin catene polinucleotidice provenite din molecule diferite de ADN, se obin hibrizi de ADN. Prin ultracentrifugare n gradient de CsCl s-a demonstrat c forme hibride de acizi nucleici se pot obine i ntre o caten poliribonucleotidic de ARN i una polideoxiribonucleotidic de ADN Posibilitatea formrii de hibrizi ADN ARN prezint un interes deosebit pentru studiul mecanismului de transcripie a informaiei genetice. Hibridarea este o metod universal utilizat n toate studiile referitoare la acizii nucleici, fiind folosit pentru reperarea i identificarea unei molecule de ARN sau ADN sau pentru compararea secvenelor a dou molecule de ADN sau ARN. n mod practic, molecula sau ansamblul de molecule de ARN sau ADN se marcheaz radioactiv naintea determinrii, obinnd aa-numita sond. n etapa urmtoare, att sonda ct i moleculele ce urmeaz a fi studiate, se amestec i se incubeaz la temperatura de fuziune. Prin scderea temperaturii, catenele polinucleotidice complementare se pot reasocia. Moleculele non-hibride se elimin apoi fie prin metode fizico-chimice (de exemplu prin cromatografie), fie prin hidroliz sub aciunea nucleazelor specifice acizilor nucleici monocatenari. Moleculele hibride pure astfel obinute se studiaz apoi n funcie de gradul de radioactivitate prin metode specifice markerilor radioactivi. Metoda hibridrii se folosete pentru cercetarea poziiei taxonomice i nrudirii genetice a diferitelor specii, permind n felul acesta elucidarea unor probleme dificile ale taxonomiei i chiar ale evoluiei. Hibridarea molecular st la baza metodelor i tehnicilor de inginerie genetic prin care se urmrete construirea, n afara organismului, a unor molecule recombinate, adic hibride, de ADN biologic activ. Hidroliza acizilor nucleici. Hidroliza acid a ADN-ului la pH = 3,0 determin eliberarea selectiv a bazelor azotate purinice. n acest tip de hidroliz, nu sunt afectate legturile pe care le formeaz bazele pirimidinice cu deoxiriboza i nici legturile fosfodiesterice ale catenei polinucleotidice. Produsul rezultat n urma hidrolizei acide nu conine baze azotate purinice i poart numele de acid apurinic. ndeprtarea hidrolitic a bazelor azotate pirimidinice conduce la obinerea de acid apirimidinic. Determinarea structurii primare a acizilor nucleici are la baz un principiu asemntor cu cel utilizat la metodele de determinare a structurii primare a proteinelor. Acest lucru se realizeaz prin ruperea selectiv a legturilor fosfodiesterice internucleotidice prin metode enzimatice specifice sau prin metode chimice. Procesul enzimatic de degradare a acizilor nucleici are loc i in vivo. Astfel, acizii nucleici din hran sunt hidrolizai enzimatic n intestin de ctre o serie de enzime specifice numite nucleaze, sintetizate i secretate de ctre pancreas. Rolul biologic al acizilor nucleici. Rolul informaional al acizilor nucleici a fost clarificat relativ recent, doar dup clarificarea structurii chimice a acestor biomolecule. Primele cercetri n acest domeniu s-au realizat n deceniul 5 i au constat n izolarea ADN-ului din pneumococul virulent de tip S care a fost apoi injectat la oareci mpreun cu pneumococii neviruleni de tip R. n aceste experimente s-a constatat c oarecii infectai au fcut pneumonie i au sucombat.

27

Ulterior s-au izolat din cadavrele lor pneumococii de tip S. Acest experiment a demonstrat faptul c a avut loc transformarea pneumococilor R n pneumococi de tip S care au rmas stabili. Aceste rezultate au stat la baza unor cercetri ulterioare care au demonstrat rolul ADN-ului n reproducerea virusurilor. Prin utilizarea metodei izotopilor radioactivi s-a stabilit c la parazitarea bacteriilor de ctre virusuri, n celula bacterian ptrunde doar ADN-ul, respectiv ARN-ul viral. Astzi se cunoate cu precizie faptul c acizii nucleici reprezint suportul material al genelor care sunt constituite din succesiuni oligonucleotidice localizate ntr-o ordine bine determinat n catenele polinucleotidice ale moleculelor de ADN. La unele virusuri, aceast funcie este ndeplinit de ctre ARN, dat fiind faptul c aceste virusuri nu conin ADN. Informaia genetic stocat n succesiunea bazelor azotate ale moleculelor de ADN poate fi transmis mai departe pe dou ci diferite. Una din ci const n transmiterea la urmai a informaiei ereditare datorit capacitii ADN-ului de a se replica semiconservativ. n acest proces, informaia genetic este transmis de la vechea molecul de ADN la cele dou molecule fiice de ADN nou sintetizate. A doua cale de transmitere se realizeaz prin transcripie cnd informaia codificat n ADN se transmite n succesiunea de baze azotate ale moleculelor de ARN ce se sintetizeaz utiliznd o caten de ADN drept matri i respectiv prin translaie, adic prin traducerea informaiei genetice stocate n ARN n succesiunea de aminoacizi din moleculele proteinelor nou sintetizate. Aceast circulaie a informaiei genetice reprezint dogma central a biologiei moleculare i poate fi reprezentat schematic astfel:
ADN transcriptie ARN translatie Proteine

Dup cum rezult din aceast schem, acizii ribonucleici joac un rol intermediar n acest mecanism al transmiterii informaiei genetice. Mecanismele prin care diferite tipuri de ARN ndeplinesc aceast funcie sunt oarecum diferite. ARN-ul mesager (ARNm) numit i informaional (ARNi) preia informaia genetic prin nsui mecanismul biosintezei sale. Acest proces se realizeaz prin utilizarea n calitate de matri a unei catene de ADN. Procesul biosintetic respect regula mperecherii bazelor azotate. Aceasta nseamn c succesiunea bazelor azotate din molecula de ARNm nou sintetizat este complementar cu succesiunea bazelor azotate din fragmentul de ADN utilizat drept matri. ARNr (ribozomal) reprezint suportul informaional al ribozomilor, organite subcelulare la nivelul crora se realizeaz procesul de biosintez a proteinelor. Informaia genetic la acest nivel nseamn o succesiune bine determinat a bazelor azotate n catena poliribonucleotidic a ARNr. ARNt (de transport sau de transfer) are drept rol principal captarea i activarea aminoacizilor solubili din citosol. Sub aciunea unor enzime specifice numite aminoacil ARNtsintetaze, moleculele de ARNt cu structuri diferite, formeaz cu aminoacizii solubili compleci activi de tipul aminoacilARNt. Pentru fiecare aminoacid exist un ARNt specific, cu o anumit succesiune a bazelor azotate. Odat format acest complex, el migreaz la nivelul ribozomilor. Aici se fixeaz la nivelul centrului activ n vederea ncatenrii n noua protein numai atunci cnd succesiunea de baze azotate a fragmentului de ARNr situat n acelai centru activ este complementar cu succesiunea bazelor azotate din ARNt care a transportat aminoacidul (vezi cap. IX). Revers-transcripia. n ultimii ani s-a descoperit faptul c exist situaii cnd ARN-ul se poate sintetiza fr a folosi catenele de ADN drept matri. Astfel, la retrovirusuri, ARN-ul servete drept matri pentru biosinteza ADN-ului monocatenar care, la rndul su, servete drept matri pentru biosinteza celei de a doua catene de ADN n celula gazd. Dup contaminare, moleculele de ADN astfel sintetizate n celula gazd vor servi drept matri

28

pentru biosinteza ARN-ului care va fi identic cu cel ce a iniiat ciclul. Acest fenomen poart numele de transcripie invers sau revers-transcripie:
revers-transcriptie translatie transcriptie

ARNretrovirus

ADNcelul gazd

ARNcelul gazd

Proteinecelul gazd

Aceast transmitere a informaiei genetice nspre napoi, de la ARN la ADN este posibil deoarece este posibil formarea moleculelor hibride ARN ADN dublu catenare. Revers-transcripia este posibil datorit existenei unor enzime specifice numite revers-transcriptaze. Se pare c n celulele normale, biosinteza acestei enzime nu are loc n absena retrovirusurilor. Gene discontinue. n celulele organismelor eucariote, genele sunt diferite de cele ale procariotelor. Aceste diferene sunt datorate repartizrii i utilizrii judicioase a nucleotidelor. De exemplu, secvenele nucleotidice care codific aminoacizii din hemoglobin sau din ovalbumin sunt frecvent ntrerupte prin fragmente nucleotidice care nu codific nici o informaie genetic. Aceste fragmente se numesc introni, n timp ce fragmentele care codific aminoacizii viitoarelor proteine se numesc exoni. Cele mai multe gene care codific ARNm la eucariote sunt ntrerupte de introni. nc n nucleu, nainte de migrarea ARN-ului n citosol, ele sunt transmise ntr-o molecul de ARN precursor care i pierde apoi intronii pe cale enzimatic. Exonii rmai sunt apoi sudai din nou formnd molecule de ARN care, migrnd n citoplasm, devin ARNm. Rezumnd cele de mai sus se poate spune c macromoleculele de ADN i ARN ndeplinesc funcii biologice bine determinate n toate organismele vii. Pentru ADN, principala sa funcie const n stocarea i transmiterea informaiei genetice. Prin intermediul codului genetic, n macromoleculele de ADN sunt nmagazinate toate caracterele ereditare ale organismului, toate informaiile referitoare la structura proteinelor, toate detaliile proceselor metabolice etc., sau, altfel spus, toate informaiile referitoare la fenotipul organismului. Toate fenomenele i procesele biochimice la care particip moleculele de ADN reprezint fundamentul molecular al geneticii. Acestea includ replicarea ADN-ului, mutageneza, recombinarea, repararea i respectiv transcripia. Obiectul geneticii moleculare const n analiza tuturor acestor procese care pot fi reacii enzimatice sau neenzimatice. Legat de aceasta, direciile principale de cercetare n genetica molecular sunt reprezentate de studiul acestor procese n aa fel nct acestea s poat fi apoi reproduse in vitro cu ajutorul preparatelor nalt purificate ale ADN-ului i ale enzimelor implicate. ARN-ul reprezint a doua categorie de biomolecule, dup ADN, ce ndeplinete funcii cibernetice n organismele vii, asigurnd circuitul informaiei n celul. Din acest punct de vedere se poate considera c rolul ARN-ului este chiar mai complex dect rolul jucat de ADN. Dac moleculele de ADN stocheaz informaia genetic n succesiunea bazelor azotate din catenele polideoxiribonucleotidice, informaie absolut necesar creterii i multiplicrii celulelor, ARN-ul particip direct la acest proces de multiplicare, asigurnd desfurarea normal a transcripiei, adic a biosintezei proteinelor. Din aceste motive, coninutul n ARN al celulelor este mult mai variabil comparativ cu ADN-ul, depinznd foarte mult de condiiile de mediu, elementele nutritive din alimente etc. Succesiunea de baze azotate din catenele dublu helix-ului de ADN conine informaii referitoare structura tuturor proteinelor din celul. n afar de aceasta ns, este extrem de important viteza cu care se sintetizeaz fiecare protein, aceasta depinznd de interaciunile

29

celulei cu mediul i de mecanismele de reglare a biosintezei proteice. De aceea, cantitatea de ARN total din celul depinde de viteza cu care se realizeaz procesul de biosintez a proteinelor n esutul din care face parte celula respectiv. Aceast interdependen este asigurat de un mecanism reglator complex care asigur declanarea biosintezei de ctre celul a anumitor enzime n care celula este deficitar n anumite condiii de mediu. Aceasta nseamn c, n condiii intrinseci i extrinseci date, cantitatea de ARN total reprezint materializarea funcionrii acestui mecanism, iar rezultatul acestor fenomene l reprezint biosinteza rapid a anumitor enzime, respectiv biosinteza lent a altora. Este cunoscut faptul c celula vie are propriul su mecanism de transcripie a ARN-ului pe molecula de ADN. Cu toate acestea, coninutul specific n ARN nu concord ntotdeauna cu coninutul n ADN. n ceea ce privete compoziia chimic a acestor dou tipuri de acizi nucleici, cel puin la bacterii exist o corelaie, dar nu o identitate. Acest fapt nu reprezint un paradox deoarece transcripia se realizeaz neuniform, la nivelul unor fragmente diferite ale moleculei de ADN. De aceea, funciile biologice ale ARN-ului sunt diverse, existnd din acest punct de vedere mai multe tipuri de ARN celular (ARNm, ARNt, ARNr). Organizarea ADN-ului n cromozomi. ADN-ul reprezint componenta funcional cea mai important a cromozomilor. Organizarea macromoleculelor polideoxi-ribonucleotidice de ADN n cromozomi este mult mai complex la eucariote comparativ cu procariotele. La procariote, cel mai adesea se ntlnete ADN-ul monocatenar circular. Din cauza mrimii moleculei, ADN-ul se superspiralizeaz puternic n celula procariot formnd o structur complex n care intr i molecule proteice de natur histonic. Pe lng ADN-ul cromozomial principal, n celulele bacteriene se ntlnesc i molecule circulare de ADN cu masa molecular de aproximativ 107 Da, numite plasmide. Acestea prezint o importan practic deosebit fiind utilizate n calitate de vectori n ingineria genetic. La eucariote, ADN-ul intr preponderent n structura cromozomilor unde este asociat cu ARN, proteine, cantiti mici de lipide i unii ioni metalici cu care formeaz o arhitectur spaial complex numit cromatin. Proteinele asociate cu ADN-ul n structura cromatinei sunt de tip histonic, dar i non-histonic. Indiferent de specie, raportul ADN/histone din cromatin este ntotdeauna egal cu unitatea. Prin studii de microscopie electronic s-a stabilit c fibra de cromatin din cromozomii interfazici are aspectul unui irag de mrgele, fiind format din uniti repetitive aproape sferice cu diametrul de 10 nm, unite ntre ele prin segmente flexibile. Aceste uniti structurale fundamentale ale cromatinei se numesc nucleosomi. Fiecare nucleosom este reprezentat de un ansamblu molecular alctuit dintr-un complex cilindric compus din histonele H2A, H2B, H3 i H4 grupate n octamer n perechi de cte dou molecule. n jurul acestui cilindru se nfoar lanul de ADN pe o lungime de 160 pn la 250 perechi de nucleotide. ntre doi nucleosomi succesivi se afl o poriune din aceeai macromolecul de ADN cu o lungime ce corespunde la 60 perechi de nucleotide, aceast poriune fiind complexat cu o molecul histonic. Extremitile N i Cterminale ale moleculei histonice se leag de nucleosomii adiaceni. Rolul ei este acela de superspiralizare, deci de scurtare a fragmentelor polinucleotidice internucleosomale. Prin hidroliza cromatinei sub aciunea nucleazei mitocondriale s-a reuit obinerea particulelor nucleosomale lipsite de histone, coninnd un fragment de ADN alctuit din aproximativ 15 perechi de nucleotide, numit miezul nucleosomului. Asamblarea celor 8 molecule histonice n miezul nucleosomic conduce la constituirea unui disc n care partea central este format dintr-un tetramer histonic, iar extremitile sunt alctuite din ceilali doi dimeri histonici. Octamerul histonic astfel alctuit se stabilizeaz prin interaciuni hidrofobe ce apar ntre capetele lor C-terminale, iar extremitile N-terminale sunt dispuse la suprafaa octamerului unde se leag de ADN-ul care nfoar miezul histonic.

30

Superspiralizarea dublu-helixului de ADN n jurul octamerului histonic este determinat doar de histonele H3 i H4. Toate histonele interacioneaz cu ADN-ul n aa fel nct sunt neutralizate sarcinile negative existente doar pe o parte a dublu-helixului. Pe partea opus sunt meninute forele de repulsie ntre sarcinile negative ale radicalilor fosfat care faciliteaz n felul acesta nfurarea moleculei de ADN n jurul miezului histonic. Nucleosomii constituie ns doar primul nivel de condensare a ADN-ului. Fibra de cromatin are, in vivo, un diametru de 2 3 ori mai mare dect cel al nucleosomului. Aceasta nseamn c filamentul nucleosomal din fibra de cromatin se mpacheteaz ntr-o structur mult mai compact, formnd fibra propriu-zis de cromatin de cca 30 nm. Pentru redarea arhitecturii moleculare s-au propus mai multe modele conform crora fibrele se spiralizeaz n structuri solenoide cu diametre de 25 30 nm i nlimi ale pasului de aproximativ 11 nm. Un alt model structural consider c unitatea repetitiv din structura fibrei de cromatin nu este nucleosomul ci un dimer denumit nucleodisom care este format din dou elemente ale fibrei, de 10 nm, aezate n zig-zag. Prin nfurarea acestei fibre n jurul axei se formeaz o spir cilindric cu diametrul de 25 30 nm. Pe suprafaa lateral a spiralei exist o concavitate unde se poate fixa o molecul de histon care, de asemenea, stabilizeaz structura general. Exist informaii conform crora formaiunile solenoide se organizeaz n structuri mai complexe ce pot conferi cromatinei o condensare suplimentar, determinnd o individualizare morfologic a cromozomilor.

VIII.4. Biosinteza acizilor nucleici

n ultima etap a biosintezei acizilor nucleici se realizeaz ncatenarea nucleozidtrifosfailor n polinucleotide. Acest proces se realizeaz n mod diferite pentru ARN i ADN. VIII.4.1. Biosinteza acizilor deoxiribonucleici n celulele vii, macromoleculele de ADN se sintetizeaz din unitile structurale de baz, adic din deoxiribonucleozid-5-monofosfaii corespunztori activai sub form de deoxiribonucleozid-5-trifosfai. n procesul biosintetic este implicat o enzim nalt specific numit ADN-polimeraza ce a fost evideniat att la eucariote ct i la procariote. n afara celor patru nucleozid-trifosfai precursori (adic dATP, dGTP, dCTP i dTTP), ADN-polimeraza mai necesit prezena ionilor de Mg2+ i a unei catene de ADN cu rol de matri. Formarea legturilor fosfodiesterice ntre resturile de deoxiribonucleotide se realizeaz sub aciunea ADN-polimerazei conform urmtoarei scheme:
Mg2+ ADN + x dATP + y dGTP + z dCTP + u dTTP ADN-polimeraz

ADN [dAMPx dGMPy dCMPz dTMPu] + (x + y + z + u)PP i

Succesiunea ncatenrii deoxiribonucleotidelor este determinat de matria de ADN, mai exact de succesiunea bazelor azotate purinice i pirimidinice din aceasta. Deoarece n reacia de mai sus particip ca matri o caten polinucleotidic preexistent, biosinteza ADNului este un proces de tip replicativ (sau de copiere) i poart numele de replicare a ADN-ului. Acest proces se realizeaz printr-un mecanism complex care presupune despiralizarea dublu-

31

helixului, desfacerea legturilor de hidrogen dintre bazele azotate complementare (sau pereche) ale celor dou catene i separarea acestora n cel puin o unitate de replicare. n felul acesta, la nivelul punctului de replicare, molecula de ADN are aspectul literei T, aceast structur fiind denumit bifurcaie de replicare. Despiralizarea dublu-helixului de ADN n bifurcaia de replicare necesit prezena aa-numitelor proteine de dezrsucire a ADN i respectiv a enzimelor de desfurare sau de relaxare. Catenele complementare astfel separate vor servi drept matri pentru formarea noilor molecule de ADN. n cadrul procesului biosintetic, elongarea catenelor de ADN se realizeaz numai n sensul 53 pe calea legrii radicalului ortofosfat din nucleozid-trifosfai cu grupele OH terminale ale catenelor polideoxiribonucleotidice aflate n cretere (fig. 66).
Caten nou I O I CH2 Caten veche

Baz

M A

OH .. O O O II II II HO P ~ O P ~ O P = O I I OH OH OH O I CH 2

T R I T O Baz

PP i ADN-polimeraza

OH

Caten nou I O I CH 2

Caten veche

Baz

M A

O HO P = O O I CH 2

T R I O Baz T

OH

Fig.66. Reprezentarea schematic a formrii legturilor fosfodiesterice n procesul ncatenrii deoxiribonucleotidelor (Vl. Artenie 1991 ) ADN-polimeraza catalizeaz formarea legturii fosfodiesterice numai dac deoxinucleozid-trifosfatul respectiv este complementar cu baza azotat din matri conform regulilor de mperechere a nucleotidelor n moleculele de ADN. Deoarece ntre bazele azotate

32

purinice i pirimidinice exist o coresponden strict, pe fiecare matri de ADN (deci pe fiecare din cele dou catene polinucleotidice ale moleculei mam) se sintetizeaz o caten nou, complementar. n felul acesta, dintr-o molecul de ADN iau natere dou noi molecule absolut identice ntre ele i identice cu molecula iniial. Fiecare molecul nou de ADN conine o caten polideoxiribonucleotidic veche (cea care a servit drept matri) i o caten nou sintetizat. Din aceast cauz, procesul de biosintez a ADN mai este cunoscut i sub numele de replicare semiconservativ a ADN-ului. Multe informaii referitoare la mecanismul intim al replicrii semiconservative a ADNului au fost obinute abia n ultimii ani. Cercetrile efectuate pe diveri mutani de Escherichia coli au condus la constatarea c de fapt exist trei AND-polimeraze distincte care au fost notate cu I, II i III. Acestea catalizeaz biosinteza ADN-ului din deoxinucleozid-trifosfai n prezena unei matrie i a unui poliribonucleotid ce joac rol de iniiator (ARN- primer) al sintezei noii catene. ADN-polimeraza I posed att activitate polimerazic ct i activitate 35exonucleazic, respectiv 53-exonucleazic (fig. 67 i 68).
Situs de hidroliz pentru activit.3'>5' exonucleazic P A A A OH 3'

5'

Caten n crestere ,

T 3'

Caten matrit ,

5'

Fig. 67. Reprezentarea schematic a activitii 35-exonucleazice a ADNpolimerazei I

Situs pentru activitate polimerazic Caten n crestere , A A A

5'

OH A

3'

5' A

P A A

3'

T 3'

T 5'

Caten matrit , Situs de hidroliz pentru activit.5'>3' exonucleazic

Fig. 68. Reprezentarea schematic a reaciei i a aciunii 53-exonucleazice a ADN-polimerazei I Activitile polimerazic i respectiv 5-3-exonucleazic ale ADN-polimerazei I se pot manifesta coordonat n sensul c poate avea loc cataliza simultan a polimerizrii unui nucleotid la captul 3 ntr-o singur caten rupt a ADN-ului bicatenar. Din aceast cauz, activitatea 5-3-exonucleazic joac un rol foarte important n excizia dimerilor pirimidinici

33

care se formeaz n urma iradierii cu raze ultraviolete a moleculelor de ADN. Deci, ADN-polimeraza I poate juca un rol esenial n repararea ADN-ului. Activitatea 35-exonucleazic, corelat cu activitatea polimerazic a ADNpolimerazei I poate cataliza excizia nucleotidelor nemperecheate cu bazele azotate ale matriei i s corecteze n felul acesta greelile care au fost comise n timpul ncatenrii. ADN-polimeraza II este foarte asemntoare cu ADN-polimeraza I din punct de vedere structural i funcional dar nu posed activitate 53-exonucleazic. ADN-polimeraza III are, de asemenea, unele trsturi comune cu ADN-polimeraza I dar este lipsit de activitate exonucleazic. La celulele de E. coli ea constituie adevrata ADNpolimeraz, ndeplinind un rol esenial n replicarea cromozomului bacterian. Celulele eucariote conin trei ADN-polimeraze n nucleu, notate cu , i i o ADN-polimeraz mitocondrial. Acestea nu posed activitate exonucleazic. Un interes deosebit a aprut n ultimul timp n legtur cu descoperirea n virusurile oncogene a unei ADN-polimeraze-ARN-dependente care se mai numete revers-transcriptaz. Aceast enzim este implicat n biosinteza ADN-ului prin utilizarea n calitate de matri a catenei de ARN. ADN-ul rezultat pe aceast cale poate servi drept matri pentru multiplicarea virusului sau se poate integra n genomul celulei gazd, reprezentnd cauza apariiei tumorilor. Transcrierea invers reprezint o violare a dogmei centrale a biologiei moleculare, deoarece revers-transcriptaza condiioneaz transferul informaiei genetice de la ARN la ADN. VIII.4.2. Mecanismul molecular al replicrii ADN Deoarece catenele din molecula parental de ADN sunt antiparalele, structura unei catene este orientat n direcie 53, iar structura celeilalte catene n direcia 35. Carena care, n bifurcaia de replicare are sensul 53 se numete caten matri conductoare, iar cealalt (care are sensul 35) reprezint catena matri ntrziat. Toate ADN-polimerazele realizeaz ncatenarea mononucleotidelor numai n sensul 53. Din aceast cauz, biosinteza ADN-ului se realizeaz n mod diferit pe cele dou catene matri. Astfel, pe catena matri conductoare, biosinteza ADN-ului se face n mod continuu, n direcia 53, iar pe catena matri ntrziat procesul se desfoar discontinuu, n fragmente scurte tot n direcia 53, fragmente ce se asambleaz ulterior. O serie de studii experimentale au demonstrat faptul c biosinteza ADN-ului pe catena matri ntrziat debuteaz prin formarea unor poliribonucleotide scurte, ce conin aproximativ 100 de ribonucleotide, fragmente denumite ARN-primer. Enzima care catalizeaz biosinteza ARN-primer se numete ARN-primaz i este o ARN-polimeraz-ADNdependent care direcioneaz biosinteza de la captul 5 spre captul 3 n catena de ADN aflat n cretere (fig.57). La captul 3 OH din ARN-primer, ADN-polimeraza III sintetizeaz un fragment de ADN complementar catenei matri. Atunci cnd acest fragment de ADN nou sintetizat ajunge la circa 1000 de deoxiribonucleotide (la eucariote aproximativ 200), intervine ADN-polimeraza I care, posednd i activitate 53-exonucleazic, hidrolizeaz i ndeprteaz ARN-primer din catena mixt ARNADN. ndeprtarea fragmentului de ARN din catena aflat n cretere las anumite goluri ntre fragmentele de ADN care poart numele de fragmente Okazaki (fig.69), dup numele autorului care le-a pus n eviden prima dat. Golurile dintre fragmentele Okazaki sunt apoi completate datorit activitii polimerazice a ADN-polimerazei I care alungete segmentele de ADN de la captul 3 aflat mai aproape. n final, fragmentele de ADN astfel sintetizate pe catena ntrziat se unesc formnd o copie complementar nentrerupt a catenei matri de ADN. Aceast asamblare are loc sub aciunea ADN-ligazei, o enzim ce catalizeaz formarea legturilor fosfodiesterice ntre fragmentele de ADN rezultate, pe seama energiei furnizate de NADH n celula bacterian i respectiv de ATP la bacteriofagi i n celulele animale. Din cele de mai sus rezult c replicarea ADN se face continuu pe o caten i discontinuu pe cealalt

34

caten matri, fapt ce poate explica creterea simultan n direcia 53 a ambelor catene n bifurcaia de replicare.
Helicaza o ooo 3'

5' 3'

Protein

ooo o 5'

3' 5' Caten matrit conductoare 5' 3' Caten matrit ntrziat oo oo 3' ARN-primer

5' oo oo 3'

5'

Fragmente Okazaki
3' 5' Caten matrit conductoare 5' 3' Caten matrit ntrziat

oo
oo

oo oo

3'

Fragment de ADN dup ndeprtarea ARN-primer

Punct de legare

5'

3' 5' Caten matrit conductoare 5' 3' Caten matrit ntrziat

oo
oo

oo oo

3'

5'

3' Legarea catenelor de ADN sub actiunea ADN-ligazei 5'

Fig. 69. Reprezentarea schematic a biosintezei catenelor polideoxi-ribonucleotidice pe catena matri conductoare i catena matri ntrziat (Vl. Artenie 1991) Dup realizarea replicrii intervine ADN-giraza, enzim ce confer moleculelor de ADN nou sintetizate starea superspiralizat necesar ndeplinirii rolului lor biologic. S-a

35

demonstrat c procesul replicrii semiconservative are un caracter universal, acest mecanism fiind specific att procariotelor ct i eucariotelor. Prin intermediul acestui proces, informaia genetic este transmis fidel celulelor fiice, fapt ce asigur att continuitatea fenomenului ereditar ct i reproducerea organismelor vii. La eucariote, replicarea ADN-ului se realizeaz n etapa S din interfaz, iar la procariote ea este potenial continu, pe tot parcursul ciclului celular, n condiii optime de cultivare. Replicarea ADN-ului se realizeaz sub un control celular strict, efectuat la mai multe niveluri. La nivel molecular exist mecanisme care asigur corecia replicrii prin ndeprtarea nucleotidelor mperecheate greit cu nucleotidele complementare din matri. n acest mecanism de corecie este implicat ADN-polimeraza I. Erorile de inserare a nucleotidelor datorate aciunii unor ageni mutageni sau ineficienei activitii de corectare a ADNpolimerazei I reprezint una din posibilitile de apariie a mutaiilor prin care, alturi de recombinare, se asigur variabilitatea necesar procesului evolutiv. VIII.4.3. Biosinteza acizilor ribonucleici Toate cele trei tipuri de ARN celular (ARNm, ARNt i ARNr) se sintetizeaz printr-un mecanism complex cunoscut sub numele de transcrierea ADN. Acest proces const n transmiterea informaiei genetice de la ADN la ARN pe calea reproducerii exacte a secvenei deoxiribonucleotidelor din molecula de ADN n succesiunea ribonucleotidelor din moleculele de ARN. Rolul principal n acest proces biosintetic l joac enzima ARN-polimeraza-ADNdependent care necesit n calitate de substrate cei patru ribonucleozid-5-trifosfai (ATP, GTP, CTP i UTP), a ionilor de Mg2+ i Mn2+, precum i prezena n calitate de matri a ADNului dublu catenar. Reacia general catalizat de ARN-polimeraza-ADN-dependent poate fi redat schematic astfel:

x ATP + y GTP + z CTP + u UTP

ADN Mg2+; Mn2+

AMP x GMP y CMP z UMP u + (y + z + z + u) PP i

Conform reprezentrilor actuale, biosinteza ARN-ului sub aciunea ARN-polimerazeiADN-dependente se desfoar n mai multe etape: legarea matriei; iniierea transcrierii; elongarea; terminarea transcrierii. Prima etap (legarea matriei) const n interaciunea ARN-polimerazei cu ADN-ul matriceal cnd se formeaz un complex binar ce poate lega n continuare ribonucleozidtrifosfatul pentru a iniia sinteza lanului polinucleotidic de ARN. Dei ARN-polimeraza manifest afinitate pentru toate segmentele din molecula de ADN, ea se ataeaz stabil numai la nivelul anumitor fragmente ce aparin uneia din cele dou catene ale ADN-ului matri. Aceste fragmente reprezint semnale de start ale matriei de ADN i se numesc promotori. Promotorii reprezint fragmente cu pn la 50 de nucleotide localizate imediat naintea genei sau grupului de gene a crei informaie genetic trebuie transcris n ARN. ARN-polimerazele sunt molecule proteice mari, unele din ele fiind oligomere (adic au molecula alctuit din mai multe subuniti). De exemplu, ARN-polimeraza din Escherichia coli este o enzim oligomer ce conine n molecul patru subuniti notate cu , , i i ioni de zinc. Masa sa molecular este de 495.000 Da, iar structura cuaternar a apoenzimei este de tipul [ 2 ] . Se presupune c aceast enzim recunoate secvena

36

nucleotidic a promotorului prin subunitatea . Ataarea ARN-polimerazei la promotor determin despiralizarea parial a dublu-helixului de ADN prin scindarea punilor de hidrogen dintre bazele azotate complementare ale catenelor matriei cu formarea aa-numitului complex deschis care este capabil s declaneze biosinteza ARN-ului (fig. 70). Succesiunea bazelor azotate din promotor nu este transcris n molecula de ARN nou sintetizat. La eucariote se cunosc trei tipuri principale de ARN-polimeraze: ARN-polimeraza I (A) este localizat preponderent n nucleol i catalizeaz biosinteza ARN-ului ribozomal; ARN-polimeraza II (B) este localizat n principal n nucleoplasm i este implicat n biosinteza ARN-ului nuclear heterogen care include i ARN-ul informaional; ARN-polimeraza III (C) este localizat n nucleoplasm i particip la biosinteza ARN-ului de transport i a altor tipuri de ARN cu mas molecular mic. n organismele superioare pot exista cte mai multe ARN-polimeraze aparinnd fiecruia din tipurile descrise mai sus.

Fig. 70. Reprezentarea schematic a mecanismului de aciune a ARN-polimerazei ADN-dependente (Bressler, S. E. 1973) A doua etap o reprezint iniierea biosintezei catenei de ARN sub aciunea ARNpolimerazei care debuteaz prin reacia dintre ATP sau GTP cu o a doua molecul de ribonucleozid-trifosfat cu formarea unui dinucleotid care mai conine un radical ortofosfat la captul 3:
A sau G X

3' P 5' OH

PPi + P ~ P ~ P OH ADN

37

A sau G

OH

Imediat ce biosinteza catenei de ARN a nceput, subunitatea se desprinde din complexul format cu ARN-polimeraza i se poate ataa la o alt molecul de miez-enzim sau polimeraz minimal (care are structura cuaternar de tipul 2 ). Catena polinucleotidic se lungete apoi sub aciunea miez-polimerazei. Iniierea transcrierii poate fi inhibat n mod specific la procariote de rifamicin, iar la eucariote de -amanitin care este o toxin puternic produs de ciupercile aparinnd genului Amanita. Elongarea catenei de ARN se realizeaz prin legarea succesiv a cte unui nou ribonucleotid la grupa OH liber din poziia 3 a dinucleotidului, respectiv polinucleotidului precedent. Formarea legturilor fosfodiesterice ntre ribonucleotide se realizeaz numai n direcia 53, ceea ce nseamn c ARN-polimeraza ncepe s acioneze la captul 3 al catenei de ADN ce urmeaz a fi transcris. Aceasta nseamn c matria i transcriptul su sunt antiparalele. ARN-polimeraza primete informaia pentru biosinteza ARN-ului de la ADN-ul matri. Catena acestuia formeaz cu catena de ARN aflat n cretere un hibrid molecular ADN ARN temporar prin intermediul punilor de hidrogen ce se stabilesc ntre bazele azotate complementare. Deci, catena de ARN ce se sintetizeaz este complementar din punctul de vedere al structurii sale primare cu catena de ADN utilizat drept matri (fig. 71). La un anumit nivel al genomului, numai una din catenele de ADN servete drept matri, cealalt caten nefiind transcris. Aceasta nseamn c transcrierea este un proces asimetric. Procesul de elongare a catenei de ARN este inhibat de antibioticul streptolidigin care este un inhibitor al ARN-polimerazei. Actinomicina D inhib att ADN-polimerazele ct i ARN-polimerazele. Antibioticele care blocheaz procesul de transcriere i manifest efectul de inhibiie acionnd asupra subunitilor ale ARN-polimerazei.

3' A G C T A G C T A

5' Matrit de ADN

NuTP ADN-polimeraza-ADN-dependent PPi

38

3' A G C T A G C T A

5'

Matrit de ADN

U 5'

U ARN nou sintetizat 3'

Separarea catenelor

3' A G C T A G + U 5' C G A U C G A U C T A

5' Matrit de ADN

ARN nou sintetizat 3'

Fig. 71. Reprezentarea schematic a mecanismului transcrierii ADN (Vl. Artenie 1991) Terminarea transcrierii are loc atunci cnd n procesul de elongare este ntlnit de ctre complexul ADN-matri ARN nou format ARN-polimeraz un aa-numit semnal de terminare care este reprezentat de un anumit bloc de baze azotate perechi din catena de ADN ce a servit drept matri. Cel mai adesea, semnalul de terminare este de tipul:
A A A A A..... T T T T T.....

n acest moment are loc eliberarea catenei de ARN nou sintetizat i dezorganizarea complexului de transcriere. Unele semnale de terminare sunt recunoscute de ARN-polimeraz, iar altele de aa-numitul factor care este o protein specific cu masa molecular de 200.000 Da. Din cele de mai sus rezult c biosinteza catenei de ARN are loc cu o despiralizare a dublu helixului de ADN n zona ce urmeaz a fi transcris i cu apariia aa-numitului ochi de transcriere:
Ochi de transcriere

Fragment de ADN ce urmeaz a fi transcris

39

Pe msur ce transcrierea se desfoar, n urm se reface structura dublu catenat a ADN-ului transcris. Aceasta nseamn c spre deosebire de replicarea ADN-ului, care este semiconservativ, transcrierea acestuia este un proces complet conservativ. Moleculele de ARN astfel sintetizate sunt apoi supuse maturrii post-translaionale care se poate realiza prin mai multe ci: clivarea catenelor lungi de ARN care pot fi n unele cazuri poligenice, deci conin mai mult de o secven codificatoare; adugarea de nucleotide la captul 3 al transcriptului; ataarea de nucleotide la captul 5 al transcriptului; unele modificri ale bazelor azotate (cum ar fi metilarea) n transcript, modificri ce se produc cel mai frecvent n ARNt. Numrul i profunzimea acestor modificri difer de la o specie la alta i condiioneaz existena unor nucleotide neobinuite n ARNt