STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

Principiile fundamentale ale ADN

Proprietăţile fizico-chimice ale ADN
 Structura acizilor nucleici
 Cele mai însemnate progrese in biologia moleculara au fost realizate în
ultimele cinci decenii, mai ales dupa stabilirea structurii ADN de catre
Watson si Crick în 1953.

 A devenit evident ca toate sistemele biologice contin doua tipuri de acizi

nucleici – acidul deoxiribonucleic (ADN) si acidul ribonucleic (ARN) -
stabilindu-se rolul si functiile lor în procesele ereditare si în variabilitate.

 ADN şi ARN sunt polimeri, molecule complexe formate prin unirea

unui număr mare de unităţi monomere numite nucleotide.

O nucleotidă reprezintă unitatea structurală fundamentală a acizilor

nucleici, fiind alcătuită din trei componente:

• o bază azotată purinică sau pirimidinică

• o moleculă de pentoză, riboză, pentru ARN şi deoxiriboză pentru ADN

• un rest de fosfat anorganic.

Structura unei nucleotide
Fiecare tip de acid nucleic conţine patru tipuri de nucleotide, care se deosebesc
după natura bazelor azotate care intră în compoziţia lor:

 adenina (A), guanina (G), timina (T) şi citozina (C), în structura ADN,

 adenină (A), guanină (G), uracil (U) si citozina (C), în structura ARN.

Reprezentarea tipurilor de baze azotate purinice (derivate de la inelul purinic) si

pirimidinice (derivate de la inelul pirimidinic)
 Adenina (6-aminopurina) şi Guanina (2-amino-6-oxipurina) sunt baze
purinice.

 Timina (5-metil-2,6-dioxipirimidina), Citozina (2-oxi-6-aminopirimidina) şi

Uracilul (2,6- dioxipiri-midina) sunt baze pirimidinice.

• În afara acestor baze “comune” sau “obişnuite”, în structura ADN al unor

bacteriofagi au mai fost semnalate baze azotate modificate

(2-aminoadenina, 5-hidroximetilcitozina, 5-hidroximetiluracil, 5-

hidroxipentiluracil, 5-metilcito-zina şi altele).

• In mod convențional, pentru a desemna nucleotidele ce alcătuiesc acizii nucleici,

se utilizează prima literă a fiecărei baze azotate specifice:
 A, T, C, G pentru ADN, respectiv
 A, U, C, G pentru ARN.
 Pentozele ce intră în alcătuirea acizilor nucleici sunt reprezentate de:
deoxiriboxă, în structura ADN şi riboză în structura ARN.

 Cei cinci atomi de carbon ai pentozei sunt numerotați cu: 1’, 2’, 3’, 4’ si 5’.
 Deoxiriboza are un oxigen mai puțin decât riboza

Denumirea celor două tipuri de acizi nucleici reflectă de fapt natura

pentozei prezentă în structura lor.
• Combinarea dintre o bază azotată şi pentoză se realizează între carbonul 1'
al pentozei şi atomul de azot din poziţia 9 sau 1 din structura bazelor
purinice, respectiv pirimidinice printr-o legatura denumită β-N-glucozidică.
In urma acestei legături se formează nucleosidele.

Structura nucleosidelor
Acidul fosforic se află sub formă de ortofosfat conferind moleculei caracterul
acid şi numeroase sarcini negative.
• Datorită acestor sarcini, acizii nucleici sunt molecule puternic ionizate.
In vivo, la eucariote sarcinile negative sunt neutralizate de histone în timp ce la
procariote neutralizarea se face cu ajutorul unor proteine asemănătoare
histonelor (“histone-like proteins”).

Radicalul fosforic se ataşează la nivelul carbonului 5’ al pentozei unei

nucleozide ceea ce are ca rezultat formarea nucleotidelor.
 Structura primară a ADN
Structura primară a ADN rezultă din
succesiunea celor patru tipuri de
deoxinucleotide, care intră în
alcătuirea lui.

. Intre nucleotide se stabilesc legături

fosfodiesterice covalente între
gruparea OH din poziţia 3' a moleculei
de deoxiriboză a unei nucleotide şi
gruparea OH din poziţia 5' a
deoxiribozei din nucleotida adiacentă,
prin intermediul grupării fosfat
(legaturi 3'-5').

Astfel, se formează monocatene liniare cu

o extremitate 5’-P (fosforilată) şi

o extremitate 3’-OH
 Această particularitate implică
existenţa unei polarităţi a catenei
polinucleotidice.
 Prezenţa legăturilor fosfodiesterice
internucleotidice conferă catenei un
grad important de flexibilitate care
permite realizarea structurilor
secundare şi terţiare ale moleculelor,
cu semnificaţie funcţională.
 Structura secundară a moleculei
ADN (modelul Watson-Crick)
• Rezultă din asamblarea coaxială a două catene
polinucleotidice prin înfăşurarea lor, una în jurul
celeilalte şi cu orientare spre dreapta.

• Cele doua balustrade ale scarii sunt reprezentate

printr-un schelet glucido-fosforic, treptele scarii
fiind reprezentate prin bazele azotate intre care se
stabilesc punti de hidrogen de tipul A=T, respectiv
G≡C.

• Elaborarea modelului structurii secundare a ADN

de către James Watson şi Francis Crick (1953) este
considerat ca unul dintre cele mai importante
evenimente care au stat la baza evoluţiei biologiei
moleculare.
Structura de dublu helix a ADN (format din două catene polinucleotidice
complementare și antiparalele) reprezintă STRUCTURA SECUNDARĂ A ADN
 Rosalind Franklin (a) şi Maurice Wilkins (2) în 1962,
alături de fotografia ADN rezultată prin difracţia razelor X

Cele două catene, denumite colocvial catena Watson,

iar cea complementară catenă Crick, sunt răsucite una
faţă de cealaltă formând o dublă elice regulată cu
diametrul de 2 nm, care prezintă o incizură mică de
1,2 nm şi o incizură mare de 2,2nm (1nm = 10-9 m).
Distanţa între două nucleotide este de 0,34 nm, iar
un tur complet de spiră are 3,4 nm.
• Modelul de structură propus de Watson şi Crick a permis înţelegerea mecanismelor
esenţiale care asigură transmiterea corectă a informaţiei genetice.
• Analizele efectuate de către Rosalind Franklin şi Maurice Wilkins asupra moleculelor de
ADN cu ajutorul difracţiei în raze X, au sugerat existenţa unei structuri paracristaline,
cu dimensiuni repetate la intervale precis determinate.
 Imaginile obţinute de Franklin cu diferite tipuri de ADN erau foarte asemănătoare,
indiferent de provenienţa lor, în felul acesta demonstrându-se existenţa unui model
molecular unic pentru macromoleculele de ADN.
 Datele obţinute a aceasta au reprezentat dovada experimentală necesară modelului
de structură al ADN elaborat de Watson şi Crick.
 O altă informație care a dus la descoperirea structurii cu dublă helix a venit odata cu
studiile lui Erwin Chargaff.
 Chargaff a analizat compoziția in baze azotate a ADN izolat de la mai multe specii
diferite, datele obtinute au dus la elaborarea aşa numitelor „legi ale lui Chargaff”
care din punct de vedere matematic se pot exprima astfel:

• numărul bazelor purinice este egal cu cel al bazelor pirimidinice,

• suma bazelor purinice este egală cu cea a bazelor pirimidinice: (A+G)=(T+C)
• rapoartele A/T = 1, G/C = 1 şi A+G/T+C = 1.

A formeaza legaturi duble de hidrogen cu T: A=T

G formeaza legaturi triple de hidrogen cu C: G≡C
Aceste combinatii se numesc perechi de baze (pb).
Din aceasta cauza, compozitia de baze din oricare ADN este unica si este determinata
de continutul de CG sau AT.
http://www.youtube.com/watch?v=qy8dk5iS1f0
 STRUCTURA ARN
 In cazul ARN, majoritatea moleculelor de
acest tip sunt monocatenare, prezentând
o structură primară rezultată prin
asamblarea ribonucleotidelor prin
legături fosfodiesterice.
 Structura primară a ARN este
reprezentată de ordinea ribonucleotidelor
din monocatena sa.
 In anumite cazuri, moleculele de ARN
pot prezenta și structură secundară
care se referă la formarea unor
duplexuri în interiorul monocatenei ca
urmare a stabilirii de legături de
hidrogen între regiuni complementare ale
acesteia.
Sunt, astfel, posibile diferite tipuri de modele structurale:
 cu bucle exterioare, cu bucle interne, cu joncțiuni multi-ramificate și cu
bucle stem (numite si ace de păr).
 Aceste structuri conțin regiuni complementare ce alterneaza cu regiuni de
necomplementare.
 Principiile fundamentale ale ADN
În conformitate cu modelul dublu helical al moleculei de ADN, această structură are la
bază două caracteristici sau principii fundamentale:

 Principiul complementarităţii şi

 Principiul antiparalelismului.

PRINCIPIUL COMPLEMENTARITĂŢII
Fenomenul de complementaritate este determinat de faptul că cele două catene
polinucleotidice sunt menţinute împreună prin legături de hidrogen intercatenare,
care se stabilesc între bazele azotate:

A=T, T=A, respectiv G≡C, C≡G,

• astfel ca, secvenţa bazelor din una dintre catene specifică obligatoriu secvenţa
bazelor în catena opusă, cele două catene ale ADN avand astfel secvenţe
complementare.
Principiul complementaritatii : secvenţa bazelor din una dintre catene
specifică obligatoriu secvenţa bazelor în catena opusă
 Spre deosebire de ARN , care este format de regula dintr-o singura catena
polinucleotidica, ADN este alcatuit din 2 catene antiparalele legate intre ele
intotdeauna printr-o legatura intre o baza azotata purinica si una pirimidinica.

 Ca urmare in molecula de ADN nu exista decat urmatoarele tipuri de legaturi:

Adenina şi timina se pot împerechea spaţial prin stabilirea a două legături de hidrogen, iar
citozina şi guanina prin trei legături de hidrogen.

Datorită acestui fapt legăturile G-C sunt mai stabile, ceea ce influenţează proprietăţile
fizice, chimice şi biologice ale moleculei.

Complementaritatea bazelor reprezintă particularitatea cea mai importantă a moleculei

de ADN. Explică:

 mecanismul de replicare corectă a ADN, cât şi capacitatea de transmitere fidelă a

informaţiei genetice.
 mecanismele transcrierii şi traducerii informaţiei genetice.

Stă la baza unor procese fundamentale cum sunt cele de recombinare genetică şi de
reparare a leziunilor ADN produse de factorii de mediu.
 PRINCIPIUL ANTIPARALELISMULUI

 Derivă din modul de orientare a legăturilor fosfodiesterice 3'→5' în cele două

catene cu polaritate opusă:
 Ele sunt orientate în direcţii opuse, adică sunt antiparalele una faţă de cealaltă .

Antiparalele:cele două catene polinucleotidice sunt orientate în direcţii opuse,

5'→3', 3'→5'
 Această particularitate explică şi replicarea ADN a cărui sinteză începe de la
extremitatea liberă 5' spre cea 3', pentru fiecare catenă, determinând o creştere a
catenei în formare în direcţia 5'→3'.

Pentru scrierea unei secvenţe de baze dintr-o anumită moleculă de ADN există o
anumită convenţie:

 se utilizează literele corespunzătoare bazelor azotate ce alcătuiesc nucleotidele din

secvenţa de interes

 Notarea începe întotdeauna cu nucleotidele de la capătul 5’ al ADN (în partea

stângă), uneori nefiind necesară specificarea capătului 5’ şi 3’.
5’ C A T G T G C 3’
3’ G T A C A C G 5’
 Proprietăţile fizico-chimice ale ADN
Particularităţile moleculelor de acizi nucleici, a ADN în special, pot fi determinate prin
utilizarea unor tehnici variate aplicarea acestora depinzând de scopul cercetărilor:
• microscopie electronică,
• ultracentrifugare,
• electroforeză,
• spectrofotometrie etc,

Dpdv al structurii chimice molecula de ADN dublu catenară este stabilizată de cel
puţin trei categorii de forţe:
 LEGĂTURILE DE HIDROGEN
• asigură împerecherea bazelor si, cu toate ca sunt slabe, contribuie la stabilizarea
moleculei datorită numărului lor mare (energia necesară pentru ruperea acestor legături
de hidrogen este de ~ 5,6 cal/mol);
 INTERACŢIUNILE ELECTRONICE: legăturile Van der Waals şi atracţiile dipol-
dipol dintre planurile bazelor suprapuse
părţile hidrofile ale moleculei (pentoza + fosfat) sunt îndreptate spre exteriorul dublei
elice, iar cele hidrofobe (bazele azotate) sunt situate spre interiorul ei, conferind
maximum de stabilitate moleculei.
Masa moleculară şi dimensiuni
Sub raportul masei moleculare sunt cele mai
mari molecule din sistemele vii,
ajungând la 107 – 4 x 109 daltoni. Genome Sizes (in base pairs)
In cazul ADN viral acesta poate conţine
câteva sute de perechi de baze, iar ADN SV40 (monkey 5,243
al bacteriei Escherichia coli are virus)
aproximativ 4 milioane de perechi de
baze. Lambda 48,502
La om lungimea ADN per complement (bacterial virus)
haploid (genom, n = 23 cromozomi),
corespunde la 3,3 x 109 perechi baze sau Escherichia coli 4,639,221
3,3 x 106 Kbaze = 1m lungime. (bacterium)
Dacă ţinem cont că în organismul uman
există aproximativ 1013 celule diploide şi Saccharomyces 12,070,521
se calculează lungimea totală a ADN cerevisiae
conţinut în aceste celule, se poate ajunge (yeast)
la o valoarea astronomică, de ordinul Human 2.9 billion
diametrului sistemului solar (Elliott şi
Elliott, 1997).
 Conformaţia moleculară a moleculelor poate fi
determinată prin utilizarea electroforezei în gel de
agaroză şi a microscopiei electronice.

Datorită metodelor de purificare a ADN, lungimea

corectă a unei molecule se poate aprecia numai prin
corelarea datelor obţinute prin 2-3 metode, dintre
care sunt de amintit:
• microscopia electronică,
• autoradiografia,
• coeficientul de sedimentare,
• densitatea de plutire.

Studiul difracţiei razelor X la trecerea prin soluţii de

ADN a demonstrat existenţa unor tipuri
conformaţionale, uşor diferite, care au fost notate cu A,
B, şi C.
 Conformaţia de tip B este cea mai apropiată de
modelul Watson-Crick, având pasul elicei de 3,4 nm,
10 pb per tur de elice şi planul de orientare al bazelor
perpendicular pe axul dublului helix.
 Conformaţia de tip A şi conformaţia de tip C prezintă
uşoare abateri faţă de conformaţia de tip B, ele
întâlnindu-se la grupuri restrânse de sisteme
biologice.
 Pe lângă conformaţiile moleculare menţionate, s-a mai
descris şi o a patra modalitate de răsucire a catenelor de
ADN: conformaţia de tip Z. Conformaţia Z corespunde
unor molecule de ADN care se abat de la modelul
clasic descris de Watson şi Crick .
Reprezentarea schematică a conformaţiilor Z şi B ale ADN
 Compoziţia în baze a ADN şi semnificaţia acesteia
Analiza conţinutului în baze azotate din ADN de diferite origini, a arătat o variaţie
relativă a cantităţii acestora în funcţie de sursa de provenienţă a materialului
genetic.

• Compoziţia în baze se exprimă în general în procente de G+C din cantitatea totală

de ADN, sau sub forma raportului A+T/G+C.

Deşi raportul este variabil de la o specie la alta, la organismele pluricelulare acest

raport este acelaşi indiferent de natura celulelor sau ţesutului de origine.

Unele dintre proprietăţile ADN sunt puternic influenţate de procentul G+C.

Aprecierea conţinutului în G+C se poate face in functie de:
• Densitatea de plutire
• densitatea unei soluţii de ADN este cu atât mai mare cu cât cantitatea de G+C
creşte.
• Determinarea punctului de “topire” (Tm = “melting point temperature”
temperatura medie de topire).
• Tm este influentata si de proportia bazelor GC. Aceste baze azotate, fiind legate prin
legături triple de hidrogen asigură structurii dublu catenare o mai mare stabilitate,
deci ruperea lor necesită o temperatură mai ridicată (un punct de topire mai ridicat)
comparativ cu bazele AT.
Valoarea punctului de topire va da deci indicaţii asupra proporţiei de baze GC ce intră în
compoziţia ADN dublu catenar, variind în funcţie de specie şi constituind astfel un
criteriu taxonomic, cel puţin pentru bacterii.
 Denaturarea şi renaturarea ADN

Moleculele de ADN dublu catenar pot suferi modificări ale proprietăţilor lor fizice
ca rezultat al acţiunii unor factori fizici sau chimici.

Conditiile care favorizeaza denaturarea pot fi:

 Temperatura ridicata;

 Concentratia scazuta de saruri;

 pH ridicat

Experimental s-a demonstrat că prin încălzirea soluţiilor ce conţin ADN, la

temperaturi cuprinse între 63°C şi 100°C (în funcţie de natura şi provenienţa
moleculelor de ADN) acestea suferă o rupere a legăturilor de hidrogen care leagă
în mod normal bazele.

In consecinţă, cele două catene ale ADN se separă, moleculele devenind

monocatenare.
Fenomenul se numeşte DENATURARE TERMICĂ, el fiind denumit şi “topire”,
deoarece este însoţit de o fluidizare a soluţiei, iar căldura furnizează energia
necesară pentru ruperea legăturilor de hidrogen.

 Fenomenul de denaturare se realizează în mai multe etape:

Topirea termică, derularea şi denaturarea

Topirea termică, derularea şi denaturarea încep în regiuni bogate în legături A-T

şi continuă cu cele cu conţinut crescut în G-C.

• Iniţial, cele două catene se derulează parţial dar rămân reunite prin anumite
segmente dublu catenare în care bazele continuă să formeze perechi.

• Când temperatura a atins punctul de topire are loc separarea completă a celor
două catene.

Temperatura de denaturare este influenţată de mai mulţi factori dintre care cel
mai important este proporţia de GC.

Temperatura de topire este cu atât mai mare cu cât procentul GC este mai ridicat.
Dacă soluţia de ADN denaturat este răcită brusc, catenele complementare rămân
separate, ceea ce înseamnă că procesul de denaturare a devenit permanent.

În schimb, dacă răcirea este lentă, are loc procesul de refacere a legăturilor de hidrogen
dintre bazele complementare ale catenelor şi deci refacerea moleculelor dublu
catenare.

Procesul a fost numit RENATURARE.

Procesul de renaturare se produce in doua etape.

 In prima etapa, catena de ADN din solutie se imperecheaza cu alta catena, la

intamplare, formandu-se scurte regiuni bicatenare.

 In etapa urmatoare regiunea de baze imperecheate se extinde de-a lungul

moleculei, intreaga molecula devenind bicatenara.
DENATURAREA TERMICĂ a ADN este insotita de EFECTUL HIPERCROMIC
adica de cresterea intensitatii absorbtiei razelor UV de catre solutia de ADN
denaturat datorita expunerii bazelor azotate la exterior, in contact direct cu
radiatiile UV.
 se manifestă printr-o creştere progresivă a capacităţii de absorbţie a
radiaţiilor UV cu lungimea de undă de 260 nm.
Această creştere este corelată cu conţinutul în baze de tipul A-T şi va fi în final
cu aproximativ 40% mai mare faţă de absorbţia moleculelor normale bicatenare.

• RENATURAREA TERMICĂ a ADN este insotita de EFECTUL

HIPOCROMIC adica de scaderea absorbtiei razelor UV datorita
refacerii structurii dublu catenare.
 Hibridarea moleculară
Una dintre cele mai importante aplicaţii ale
procesului de denaturare – renaturare este
hibridarea moleculară.
Hibridarea implica refacerea structurii
dublu catenare a ADN, pornind de la
catene de ADN de origine diferita, sau
de la o catena de ADN si o catena de
ARN.

Ea permite renaturarea prin combinarea unor

molecule de ADN monocatenare (ADN
– ADN ) sau de ADN monocatenar şi
ARN (ADN – ARN).
Se formează molecule hibride de tip ADN –
ADN sau ADN – ARN, indiferent de
provenienţa lor, cu condiţia existenţei
unui grad de înrudire, respectiv de
complementaritate în secvenţa bazelor.
A. ADN dublu catenar este transcris intr-o molecula de ARN monocatenar
(transcript), complementar, cu una dintre cele 2 catene ale ADN.
B. Denaturarea termica a ADN si racirea lenta impreuna cu ARN.
 Fenomenul de denaturare-renaturare ADN, se poate utiliza in studiul relatiilor
filogenetice dintre specii sau in tehnologia ADN- recombinat.

• Astfel s-a stabilit ca procentul de renaturare intre monocatene de ADN de la om si

monocatene ADN de la cimpanzeu este de 75%. Omul are in comun cu cimpanzeul
75% din ADN, cu soarecele 25% si numai 5% cu pestii.

 Hibridarea moleculară poate fi utilizată pentru a aprecia gradul de similaritate în

secvenţa bazelor între ADN provenit de la două organisme diferite.

Detectarea moleculelor hibride se poate face prin microscopie electronică deoarece

regiunile dublu catenare prezintă un contur mai gros.

 In tehnologia ADN recombinant, hibridarea moleculara ajuta la stabilirea exacta

si rapida a transferului unei gene eucariote in celula bacteriana (prin marcarea
radioactiva a unei moncatene de ADN sau ARN complementare segmentului genei
eucariote transferate).
Studiul hibrizilor ADN-ARN a permis elucidarea unor aspecte legate de funcţiile
acizilor nucleici, de particularităţile de structură ale genelor (de exemplu
structura discontinuă a genelor de la eucariote) sau de localizarea unor gene la
nivelul ADN (de exemplu a genelor pentru ARNr 28S, 18S, 5S).

Cercetările efectuate asupra acestor hibrizi au demonstrat rolul de matriţă al

ADN pentru sinteza ARNm
DNA, the molecule of life
Trillions of cells
Each cell contains:
 46 human chromosomes,
found in 23 pairs
 2 meters of DNA
 Approximately 3 billion
DNA base pairs per set of
chromosomes, containing the
bases A, T, G, and C
 Approximately 20.000 to
25.000 genes coding for proteins
that perform most life functions
 Tehnici utilizate in biologia moleculara bazate pe hibridare
moleculara
Categoriile de tehnici de biologie moleculară, bazate pe reacţii de hibridare-
amplificare:
 Reacţia de amplificare (multiplicare) genică în lanţ mediată de ADN
polimerază sau de ADN ligază (Polimerase Chain Reaction -PCR),

 Hibridizările ADN-ADN (de tip Southern)

 Hibridizarile ARN-ADN (de tip Northern)

Reacţia de amplificare genică în lanţ mediată de DNA-polimeraza (Polimerase

Chain Reaction - PCR).
Această tehnică a fost optimizată în anul 1980 de catre Karry Mullis (citat de Strauss,
1985-90) şi reprezintă o aplicaţie a fenomenului de hibridare de tip ADN-ADN.

PCR are la baza o tehnologie in vitro care imita capacitatea naturala de replicare a
ADN si care consta in generarea rapida a unor copii multiple a unei secvente
nucleotidice tinta (ADN sau ARN) dintr-o gena de interes .

Produsul amplificat (amplicon) este apoi detectat prin diverse metode.

 Reactia PCR este o metodă de amplificare enzimatică in vitro a unei anumite
secvenţe de ADN.

• Tehnologia PCR care este folosită într-o varietate foarte mare de domenii: biologie
moleculară, ştiinţele mediului, criminalistică, ştiinţe medicale, biotehnologie,
microbiologie, industria alimentară, epidemiologie etc.

• Amplificarea se realizeaza intr-un analizor special (thermal cycler).

• Din punct de vedere chimic, reacţia PCR este constituită din cicluri succesive de
replicare ADN in vitro, folosind 2 primeri oligonucleotidici ce hibridizează cu cele
2 catene ale secvenţei originale (folosită ca matriţă în replicare).

• Diferenţa esenţială între o asemenea reacţie de replicare şi un proces de replicare

ADN in vivo, îl reprezintă faptul că în reacţia PCR etapa de desfacere a dublului
helix matriţă şi, respectiv, cea de ataşare a primerilor, nu sunt realizate enzimatic, ci
prin parcurgerea unor trepte de temperatură, iar singura enzimă folosită în reacţie
este o ADN polimerază ADN-dependentă (cu funcţie de replicază).
 Principalele componente ale reacţiei sunt :
• ADN matriţă,
• o ADN polimerază termostabilă,
• primeri oligonucleotidici,
• Deoxinucleotid-trifosfati (dNTP): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
• tamponul de reacţie, ioni de Mg++.

O reacţie PCR este formată din n cicluri (între 25 şi 40), în fiecare ciclu fiind
parcurse 3 etape principale:
• denaturarea termică a matriţei (deci, desfacerea dublului helix ADN),
• ataşarea primerilor şi polimerizarea propriu-zisă.
La terminarea unui ciclu de replicare in vitro (de amplificare), cantitatea de ADN
rezultată este dublă faţă de matriţă. Mai mult, produsele rezultate într-un
ciclu sunt folosite ca matriţă în ciclul urmator.
Este de subliniat faptul că moleculele acumulate exponenţial reprezintă copii
ale matriţei care la capete au incorporaţi primerii.
Produsul de reactie este analizat apoi in gel de agaroza.
• In concluzie, reacţia PCR este o metodă prin care se obţin cantităţi mari
dintr-o anumită secvenţă ADN.
2. Tehnica Southern Blot.
Acest procedeu tehnic a fost imaginat în 1975 de către Edward M. Southern.
• Este o metoda utilizata in biologia moleculara pentru detectia unei secvente specifice de ADN
dintr-o proba. Metoda permite localizarea unei gene specifice dintr-un genom (Khalsahttp,
2000)

Principalele etape ale acestui procedeu sunt, în principiu, următoarele:

• Molecula de ADN este fragmentata cu ajutorul unor enzime de restrictie
• Fragmentele de ADN sunt separate apoi prin electroforeză în gel de agaroză;
• Gelul de agaroza este plasat intr-o solutie alcalina pentru denaturarea ADNdc si
obtinere de ADN monocatenar;
• Pe suprafata gelului este plasata o membrana de nitroceluloză sau nylon, peste care,
pentru presiune si un contact bun intre gel si folie, se plaseaza prosoape de hartie si o
greutate; Fragmentele de ADN din gel sunt transferate prin imbibiţie şi osmoză pe
membrana de nitroceluloza;
• Membrana este detasata apoi de pe gel si expusa unei temperaturi de 800C (ptr
nitrocelulaza) sau expusa la radiatii UV (ptr nylon) pentru atasarea permanenta a ADN
pe membrana;
• Membrana este apoi supusa hibridizarii cu un fragment de ADN marcat, pentru
identificarea prezentei unei secvente de nucleotide din ADN tinta complementara cu
fragmentul utilizat;

• Vizualizarea hibrizilor ADN-ADN este posibilă deoarece fragmentul de ADN utilizat este
întotdeauna marcat (cu izotopi radioactivi sau cu fluorocromi sau/şi enzime).
Vizualizarea se realizeaza prin autoradiografie (raze X).
http://www.accessexcellence.org/AB/GG/southBlotg.html
• Tehnica Northern Blot.
Această metoda a fost numită
arbitrar faţă de numele lui
Southern.
• Cu excepţia etapei de denaturare
care nu este necesară (ARN
fiind monocatenar) blotarea de
tip Northern se petrece
asemănător metodei Southern.
Deosebirea mai consta din
faptul ca molecula tinta nu este
ADN ci ARN.