1

2
 Cuprins

1. Introducere ...........................................................................................................4

2. Ce sunt antioxidantii ............................................................................................4

3. Clasificarea compusilor polifenolici....................................................................6

4. Tipuri de polifenoli identificati in frunzele de catina si anghinare ...................11

5. Metode de extractie a polifenolilor....................................................................12

5.1. Metode convenționale de extracție a polifenolilor ............................................12

5.2. Metode neconvenționale de extracție a polifenolilor ........................................14

6. Procedura de extractie .......................................................................................21

7. Concluzii ............................................................................................................22

8. Bibliografie ........................................................................................................23

3
 1. Introducere

Polifenolii sunt nişte molecule organice conţinute de elementele vegetale. Aceştia sunt
produşi în mod natural de către plante pentru a se proteja de ultraviolete. Importanţa compuşilor
polifenolici a fost evidenţiată încă din anul 1964 de către Ribéreau-Gayon un mare oenolog
francez. De aici au evoluat numeroase studii privind domeniul medical, alimentar, cosmetic care
pun în evidenţă caracterul antioxidant al acestora. Polifenolii se găsesc în fructe, în legume şi în
plantele medicinale. La fel ca vitaminele, polifenolii au acţiune benefică asupra sănătăţii.
Polifenolii sunt un grup de substanţe chimice aromatice, în a căror structura se întâlnesc
unul sau mai multe nuclee aromatice simple sau condensate; sunt substanţe cu certe proprietăţi
antioxidante, antibacteriene şi antifungice foarte răspândite în regnul vefetal. Polifenolii sunt
antioxidanţi naturali, de mare interes în ultimii ani, datorită acţiunii radioprotectoare pe care o
manifestă, alături de alte component.
Numeroase studii experimentale au demonstrat că antioxidanţii prezenţi în alimente pot
inhiba cancerigeneza prin influenţa lor la nivel molecular în etapa de iniţiere, promovare şi
progresie. Dintre aceşti compuşi în ultimii ani s-au studiat polifenolii, constituenţi ai frunzelor de
cătină. Polifenolii sunt captatori eficienţi ai radicalilor liberi în diferite sisteme în vitro. Abilitatea
compuşilor de a capta radicalii este parţial determinată de potenţialul de reducere a unui electron,
care este o măsură a reactivităţii antioxidanţilor, ca donori de hidrogen sau electron.
În ultimul timp, o serie de produse naturale obţinute din plante au fost tot mai mult cercetate
şi investigate din punct de vedere chimic şi biologic pentru efectele lor de stimulare a unor funcţii
ale organismului. O categorie aparte de astfel de extracte obţinute din plante o ocupa cele cu calităţi
imunomodulatoare, antiinflamatoare, antioxidante şi care în medicină tradiţională a unor ţări
reprezintă concept de bază în tehnicile şi metodologiile terapeutice ale unor boli.

2. Ce sunt antioxidantii

4
 Oxigenul sta la baza tuturor plantelor si animalelor. El este cel mai important nutriment de
care are nevoie in fiecare secunda fiecare celula din organism.Fara el nu putem sa eliberam
energiadin hrana cu ajutorul careia se conduc toate procesele din organism.Dar oxigenul este o
substanta chimica reactiva si deosebit de periculoasa: in reactiile biochimice normale, oxigenul
poate sa devina instabil si poate „oxida” moleculele din jur. Acest proces pate duce la distrugerea
celulelor care sa fei punctul de pornire pentru cancer, inflamatii, lezari ale arterelor si imbaranire.
Cunoscut ca un radical liber oxidant, acest echivalent al unui deseu nuclear trebuie inlaturat pentru
a indeparta pericolul. Radicalii liberi se produc atunci cand au loc procese de combustie, cum ar fi
fumatul, arderea benzinei care produce gaze de esapament, radiatii, prajirea sau frigerea
alimentelor si procese normale ale organismului.Substantele chimice capabile sa faca inofensivi
radicalii liberi se numesc antioxidanti.
Echilibrul intre aportul dumneavoastra de antioxidanti si expunerea la radicali liberi poate
cu adevarat sa reprezinte echilibrul dintre viata si moarte.Puteti sa inclinati balanta in favoarea
dumneavoastra facand simple modificari in alimentatie si printr–o suplimentare a cantitatii de
antioxidanti.
Antioxidanţii pot fi definiţi simplu astfel: un complex de elemente nutritive (vitamine şi minerale)
şi enzime specifice care au rolul de a reduce efectele toxice ale radicalilor liberi, adică de a
neutraliza moleculele de oxigen instabile, ajutând corpul să nu-şi distrugă propriile celule.
Antioxidanţii mai sunt cunoscuţi ca nişte compuşi ce au capacitatea de a opri oxidarea altor
substanţe.
Radicalii liberi reprezintă atomi sau grupuri de atomi care, dacă nu sunt ţinuţi sub control de
antioxidanţi, pot afecta sistemul imunitar şi pot duce la boli de inimă, pulmonare, mentale,
degenerative, cancer şi îmbătrânirea prematură a organismului. Este imposibil pentru noi să evităm
complet acţiunea radicalilor liberi. Aceştia provin atât din surse interne corpului nostru (ca urmare
a proceselor respiratorii, de metabolism şi inflamatorii) cât şi din surse externe, datorită factorilor
de mediu (poluarea, radiaţiile, fumatul, stresul, lumina solară, alcoolul).
Sistemul nostru de luptă împotriva radicalilor liberi nu este perfect, de aceea pe măsură ce
îmbătrânim celulele se deteriorează prin oxidare. De aceea trebuie să suplinim această verigă slabă
cu o alimentaţie corespunzătoare, bogată în renumiţii antioxidanţi.

5
 Dintre aceşti antioxidanţi, cei mai importanţi sunt reprezentaţi de 4 enzime: superoxid
dismutaza (SOD), glutation peroxidaza, catalaza şi metionina reductaza, pe care organismul le
poate produce singur. Există însă şi vitamine şi nutrienţi care se găsesc în anumite plante, care
joacă rol antioxidant deosebit de puternic, printre acestea amintind: vitamina A (morcovi, spanac,
verdeaţă), betacarotenul şi alte carotenoide (spanac, roşii, cartofi dulci, morcovi, pepenen galben,
porumb, mango, dovleac, sfeclă, piersici), flavonoizii, vitamina C (ardei gras, căpşuni, roşii, fructe
de pădure, conopidă, broccoli,citrice), vitamina E (legume de culoare verde, ouă, ficat, nuci,
germeni de grâu, seminţe de floarea-soarelui), zincul ( carne roşie, fasole, fructe de mare, cereale
integrale, carne de pasăre) şi seleniul (carne de vită, ton, carne de pui, cereale, ţelină, usturoi,
mazăre, peşte).
Numeroase studii experimentale şi epidemiologice au demonstrat că antioxidanţii prezenţi în
alimente pot inhiba cancerigeneza prin influenţa lor la nivel molecular în etapa de iniţiere,
promovare şi progresie. Dintre aceşti compuşi în ultimii ani s-au studiat polifenolii, constituenţi ai
plantelor. Activitatea antioxidantă a polifenolilor este determinată de prezenţa grupelor hidroxilice
în inelul B în poziţiile 3' şi 4' şi, într-o măsură mai mică de grupa hidroxilică din inelul C în poziţia
4'. Flavonolii, în special catehina, cvercetina, kempferolul şi glucozidele lor, sunt constituenţi ai
ceaiului verde şi negru, vinului roşu. Dietele bogate în fructe şi legume, struguri, posedă efect
protector în bolile cardiovasculare, în diferite forme de cancer, methe-moglobinemie, au efecte
antiinflamatoare, antimutagene ş.a. Aceste efecte protectoare au fost atribuite în mare măsură
antioxidanţilor ce includ, în afară de flavo-noizi, de asemenea caratenoizi, vitaminele C şi B.
Majoritatea constituenţilor polifenolici din produsele alimentare (flavonoli – ca cvercetina şi
kempferolul, flavone – ca luteolina, flavanoli – ca (+)-catehina, antocianidinele – de exemplu,
cianidina, malvidina şi glicozidele lor) prezintă eficienţă majoră în comparaţie cu antioxidanţii
nutrienţi: vitamina C, E, β-carotene, care sunt uşor adsorbiţi în intestine.

3. Clasificarea compusilor polifenolici

6
 Compușii fenolici (polifenolii) constituie o parte esențială din dieta umană. Structura
chimică este caracterizată de prezența a cel puțin un inel aromatic cu unul sau mai multe grupe
funcționale hidroxil. Clasificarea compușilor polifenolici propusă de Crozier este următoarea:
 flavonoide
 non-flavonoide
Non-flavonoidele includ acizi fenolici simpli, alcooli fenilici, stilbene, calcone și lignani.
Acizii fenolici sunt împărțiți la rândul lor în derivați ai acidului benzoic, derivați care au o structură
de forma C6-C1 (acidul vanilic și acidul galic), derivați ai acidului cinamic, derivați care au o
structură de forma C6-C3 (acidul cafeic și acidul ferulic), derivați ai acidului hidroxifenilacetic
(acidul hidroxifenilacetic) și derivați ai acidului hidroxifenilpropanoic (acidul hidroxifenilcafeic).
De exemplu acidul vanilic se găsește în ierburi (oregano) și măsline, acidul galic în vin, ceai și
castane, acidul cafeic se găsește în fructe (scoruș negru), ierburi (oregano și cimbru) și condimente
(ghimbir), acidul ferulic se găsește în cereale, ciocolată și ierburi (cimbru), iar acizii dihidrocafeic
și hidroxifenilacetic se găsesc în măsline.
Alcoolii fenolici, cum ar fi hidroxitirosolul și tirosolul se găsesc în măsline și ulei de
măsline.
Stilbenele, cum ar fi resveratrolul, au o structură de forma C6-C2C6 cu diferite grupări
hidroxilice și se găsesc în vinul roșu. Calconele au o structură de forma C 6-C3-C6 având un inel
dechis, însă lipsindu-i un inel heterociclic și o grupare fenolică. Calconele se găsesc în fructe
(mere, citrice), legume (roșii, cartofi) și condimente (lemn dulce).
Lignanii, cum ar fi matairesinolul și secoisolariciresinolul, sunt formați din două grupări
fenilpropanoide legate de o punte de hidrogen. Lignanii se găsesc în cantități mari în semințele de
in și susan. De asemenea, aceștia se găsesc în cereale și în uleiurile din semințe.

7
 Figura 1. Non-Flavonoide

Flavonoidele sunt caracterizate de un nucleu fenilcroman C15, care este compus din două
inele aromatice legate de o punte de forma C6-C3-C6). Acestea sunt cei mai răspândiți compuși
polifenolici. Flavonoidele sunt clasificate la rândul lor în flavonoli, flavone, izoflavone, flavanone,
antocianidine, flavanonoli și flavanoli.
Cu toate că anumite flavonoide se găsesc doar în unele alimente, cum ar fi izoflavonele
daidzeina și genisteina care se găsesc în soia, majoritatea acestor compuși polifenolici sunt
distribuiți într-o mare varietate de alimente și anume: quercetina, principalul flavonol din dieta
umană, se găsește în foarte multe legume și fructe. Dintre flavonoide, flavonolii sunt cei mai
răspândiți. Principalii flavonoli întâlniți în regimul alimentar sunt kaempferolul, quercetina,
izoramnetina și miricetina. Majoritatea fructelor roșii și violet conțin cantități mari de antocianine,
polifenoli care dau culoarea roșie, violet sau albastră a multor fructe sau legume. Cele mai întâlnite
antocianidine sunt pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina și malvidina.
Atunci când aceste tipuri de compuși polifenolici se găsesc legați de compuși de tipul zaharurilor
sunt denumiți antocianine.
Flavonele se găsesc în cantități mai mici în fructe și legume. Aceste sunt cel mai des
întâlnite în pătrunjel și țelină. Anumite cereale, cum ar fi grâul și mei, și ierburi conțin cantități
mari de derivați glicozidici ai flavonelor. Flavonele, care includ luteolina și apigenina, sunt

8
prezente în uleiul de măsline virgin, în măsline, ierburi (oregano și salvie) și legume (anghinare).
Flavanonele (eriodictiolul și naringenina) și flavononolii (taxifolin) se găsesc în oregano și cimbru.
Flavanolii sunt compușii cu structura cea mai complexă clasa flavonoidelor. Catechinele
se găsesc în cacao și fructe roșii. Ierburile medicinale reprezintă o altă sursă abundentă în flavanoli.
Flavanolii cuprind monomeri simpli (catechina și izomerul său epicatechina), cât și compuși cu
structuri complexe cum ar fi oligomerii sau procianidinele (dimeri, trimeri) și proantocianidinele
polimerice care sunt denumite și taninuri condensate. În plus, monomerii catechină și epicatechină
pot fi hidroxilați formând galocatechinele care pot fi mai departe esterificare cu acid galic (cum ar
fi epigalocatechina).
În cele din urmă, taninurile pot fi la rândul lor clasificate în taninuri condesate, taninuri
complexe și taninuri hidrolizabile, care includ galotaninurile și elagitaninurile. Taninurile sunt
reprezentate și de esterii acidului galic si derivații acestora, în care grupările galoil sau derivații
lor sunt legați de o varietate de nuclee de forma poliol-, catechin- și triterpenoid- (galotaninuri,
elagitaninuri și taninuri complexe). De asemenea, taninurile pot fi reprezentate și de
proantocianidine oligomerice sau polimerice care posedă diferite grupări inter-flavanil. Taninurile
condensate sunt flavonoide polimerice ce conțin grupări flavanol (catechin-); galotaninurile sunt
taninuri hidrolizabile cu un inel poliolic substituite de 10-12 resturi de acid galic; elagitaninurile
sunt tot taninuri hidrolizabile derivate din pentagaloilglucoză, însă, spre deosebire de galotaninuri,
acestea conțin încă o legătură C-C între grupările galoil adiacente în molecula de
pentagaloilglucoză; taninurile complexe sunt taninurile în care o grupare catechin este legată
glicozidic fie de o gruparegalotanin, fie de o grupare elagitanin. Taninurile se găsesc în anumite
fructe, frunze și coji lemnoase (rodii, căpșune, vanilie, hamei, scorțișoară, nuci).
Datorită complexității structurii polifenolilor și a țesuturilor plantelor care-i conțin
analizarea acestora necesită o serie de etape și anume: extracția, izolarea, explicarea structurii și
apoi cuantificarea.

9
Figura 2. Flavonoide

10
4. Tipuri de polifenoli identificati in frunzele de catina si anghinare

11
 5. Metode de extractie a polifenolilor

5.1. Metode convenționale de extracție a polifenolilor

Printre metodele conventionale de extracție a polifenolilor din probe solide se enumeră

extracția Soxhlet respectiv macerarea. Extracția Soxhlet se desfășoară de obicei la 90oC pe durata
a câteva ore, în timp ce macerarea are loc la temperatură ambientală însă la timpi foarte mari.
Aceste metode sunt simple, necesită aparatură relativ ieftină, iar gradul de extracție al polifenolilor
este ridicat.
Macerarea constă în tratarea produsului vegetal măruntit cu o cantitate necesară de solvent,
menținerea în contact pe o durata determinată (concomitent cu agitare continuă sau intermitența și
apoi separarea soluțieiextractive de reziduu prin filtrare sau decantare; în cazul maceratelor în
soluțiide altă natură (alcool, ulei), timpul de macerare se măreşte, putând ajunge la câteva

12
saptămâni.Macerarea se aplică mai ales în cazul extracției principiilor ușor solubile la rece și
termolabile. Macerarea se poate face fie la rece (extragerea principiilor active din plante în solvent
la temperatura camerei, fie la cald (se realizează cu solventul încâlzit la 40-60°C, în general la o
temperatura inferioară aceleia la care solventul fierbe, astfel încât, principiile active pot trece în
solutie încet, fără a fi degradatede temperatura prea înaltă sau de încălzirea bruscă) (Păun, 2011).
Extracția Soxhletse bazează pe diferența dintre punctele de fierbere ale solventului și cele
ale analiţilor extrași. Pe baza acestei proprietățiextrasul este adus la temperatura de fierbere a
solventului, care va condensa într-un refrigerent și va reveni în cartușul care conține proba de
extras. Prinrealizarea mai multor cicluri de extracție, randamentul procesului poate fi controlat
astfel încat randamentul de extracție să fie maxim. Extractorul Soxhlet (figura 3) se compune dintr-
un balon, un corp de extracțieși unrefrigerent ascendent, legate între ele. Materialul solid, mărunțit
în prealabil pentru ca solventul să vinăîn contact cu o suprafata cât mai mare, se asează în spațiul
de extracție, fie introdus într-un cartuș special de hârtie de filtru, fie pus direct în spatiul de
extracție prevăzut cuun fund de sticlă poroasă. Faza extractoare (solventul) din balonul de fierbere
distilă printr-un tub lateral, prevăzut eventual cu o izolație termică, iar vaporii condensați în
refrigerentul de reflux picură peste materialul din cartuș. Când spațiul de extracție se umple până
la înaltimea stratului de preaplin, soluția cu extract trece prin sifonare în balonul de fierbere și
procesul se repetă.

Figura 3. Schema extractor Soxhlet

13
 Avantajele extracției Soxhlet sunt următoarele: este un proces continuu, dupăprocesul
extractiv nu mai este necesară filtrarea, consumul de solvent este mai micdecat în cazul macerării.
Dezavantajele cele mai importante ale extractorului Soxhlet sunt: timp indelungat de extracție (24
÷ 48 ore), cantitate mare de solvent utilizat,necesitatea aplicării procesului de evaporare a probei
obținute dupa extracție (pentru purificarea și îndepărtarea compușilor secundari) (Păun, 2011).

5.2. Metode neconvenționale de extracție a polifenolilor

Extracția reprezintă una din cele mai importante etape în procesul de obținere a compușilor
polifenolici din plante.Astfel, în prezent se pune foarte mult accent pe optimizarea acestei etape în
vederea reducerii consumului de solvent, accelerarea extracției compușilor de interes, etc. Astfel,
în acest sens au fost dezvoltate metode noi de extracție a polifenolilor printre care extracția asistată
de micounde şi respectiv extracția cu ultasunete.

 Extracția asistată de ultrasunete

Ultrasunetele, având frecvențe mai mari de 20 kHz, facilitează extracția compușilor

organici și anorganici din matricile solide utilizând solvenți. Extracția asistată de ultrasunete se
bazează pe fenomenul de cavitație acustică care se produce de fiecare dată când un lichid este
supus ultrasunetelor. Atunci, când ultrasunetele trec printr-un lichid, determină dilatări și
comprimari extrem de rapide. Daca intensitatea este suficient de mare, în interiorul lichidului va
aparea un vid (o bula cavitațională).Astfel, bulele produse de cavitația acustică favorizează ruperea
peretelui celular și eliberarea compușilor activi, determinând creșterea randamentului de extracție.
Randamentul extracției este influențat nu numai de tipul solventului, timpul de expunere la
ultrasunte cât și de frecvența și distribuția undelor ultrasonice (Lijun Wang, Curtis L. Weller,
2006)..

14
 Figura 4. Extractia asistata de ultrasunete
Extracția asistată de ultrasunete a fost utilizată atât în regim static cît și dinamic pentru
extracția de polifenoli din probele de plantă.Un sistem static este un vas închis de extracție în care
nu are loc circulația continuă al solventului. Pe de altă parte, în extracția desfășurată în regim
dinamic, solventul proaspăt este introdus în mod continuu în sistem ceea ce permite adsorbția
eficientă a analiților și transferul acestora din vasul de extracție. Cele mai uzuale metode de a
supune probele iradierii cu ultrasunete este de a utiliza fie sonde special, fie sisteme de tip baie.
Sondele de ultrasunete sunt în contact direct cu proba ceea ce face ca reproductibilitatea
experimentelor să fie dificilă; de asemenea, există riscul ca proba să fie contaminată și să se
producă spumă în timpul procesului de extracție. Spre deosebire de utilizarea sondelor cu
ultrasunete, sistemele de tip baie asigura o bună reproductibilitate a experimentelor și permit
analiza simultană a mai multor probe (Patricia Garcia-Salas et. al, 2010).
Extracția polifenolilor utilizând ultrasunetele este o alternativă simplă și eficientă a
metodelor convenționale. Principalele avantaje ale utilizării ultrasunetelor în extracția solid-lichid
constau în creșterea eficienței extracției respectiv accelerarea procesului. Drept exemplu, extractia
utilizând ultrasunete este mai rapidă decât extracția Soxhlet (30 - 60 min. pe proba) și permite

15
folosirea unei cantități mai mari de probă, determinând un costrelativ scazut. Folosirea
ultrasunetelor poate de asemenea reduce temperatura de operare ușurând extracția compușilor
termolabili. Comparativ cu alte metode neconvenționale de extracție precum extracția asistată de
microunde, aparatele ce utilizează ultrasunete sunt mai ieftine iar modul lor de operare este mai
simplu. În plus, această metodă permite utilizarea oricărui tip de solvent în vederea extragerii unei
game largi de compuși. Efectul ultrasunetelor asupra eficienței extracției poate fi însă afectat de
natura matricei probei. Prezența unei faze dispersate determină atenuarea undelor iar zona în care
intensitatea undelor va fi cea mai puternică se va limita la regiunea aflată în vecinătatea sursei
generatoare de ultrasunete. Drept urmare, acești doi factori trebuie luați în considerare atunci când
se realizează designul sistemelor de extracție pe bază de ultrasunete (Lijun Wang, Curtis L. Weller,
2006).

 Extracția asistată de microunde

Microundele sunt radiații electromagnetice neionizante cu frecvențe cuprinse între 300

MHz și 300 GHz, fiind poziționate în spectrul electromagnetic între razele X și razele
infraroșii.Microundele sunt formate din două câmpuri oscilante perpendiculare: câmpul electric și
câmpul magnetic. Principiul încălzirii utilizând microundele se bazează pe impactul direct asupra
substanțelor/solvenților polari, fiind determinat de două procese principale și anume: rotaţia
dipolilor şi conducţia ionică, care în majoritatea cazurilor au loc simultan.
Există două tipuri de sisteme pentru extracția asistată de microunde și anume: extracția în
sistem închis (figura 2) și extracția în sistem deschis (figura 3). Ambele sisteme de extracție pot
avea aplicatoare rezonante monomod, multimod sau focusate.
Principalele componente ale unui dispozitiv cu microunde
Atât sistemele multimod, cât și cele focusate includ patru componente principale și anume:
 generatorul de microunde - magnetronul care generează energia microundelor;
 ghidul de unde - utilizat pentru a propaga microundele de la sursă în cavitatea
rezonantă;
 aplicatorul - unde se pune proba;
 circulatorul - determină direcționarea microundelor doar în sensul de trecere.

16
 Figura 5. Sistem închis MAE

Figura 6. Sistem deschis MAE (Ying Li et al., 2013)

Principiul extracției.Deși pentru extracția diverșilor compuși se utilizează de obicei probe

de plante care au fost uscate, celulele acestor plante conțin totuși urme de apă; în timpul extracției
asistată de microunde, aceasta apă se evaporă și generează o presiune mare asupra pereților celulei
care în cele din urmă se vor rupe favorizând eliberarea compușilor de interes din celulele plantei
în solvent. Acest fenomen poate fi intensificat dacă se utilizează solvent cu eficiență mare a
încălzirii sub influența MW ( solvent cu o valoare mare a tanδ). Atingerea de temperaturii ridicate

17
ca urmare a utilizarii MW poate conduce la dehidratarea celulozei ceea ce îi slabește rezistența
mecanica, facilitând accesul solventului la compușii din interiorul pereților celulari ai plantei.

Factori care influențează MAE

Tipul solventului și volumul de solvent utilizat.Pentru ca procesul de extracțiesă fie optim

este importantă alegerea corectă a solventului. În ceea ce privește MAE alegerea solventului
trebuie facutăîn funcție de solubilitatea analitului, de interacțiunea dintre solvent și plantă și de
proprietățile de absorbție în câmp de microunde ale solventului. Este de preferat să se utilizeze un
solvent cu selectivitate mare față de analit.
Cel mai important factor care determină eficienta și selctivitatea MAE este reprezentat de
constanta dielectrică a solventului (amestecului de solvenți) de extracție. În general, pentru
extracția în câmp de microunde se utilizează amestecuri de solvenți care au un randament termic
mare. Astfel, un exemplu ar fi amestecul de etanol-apă sau metanol-apă. Adăugarea unor cantitati
mici de apă facilitează pătrunderea solventului de extracțieîncelulele plantei. Astfel este
îmbunătățit transferul de masă al constituenților activi în solventul de extracție.
Un alt factor important în ceea ce privește solventul de extracție este reprezentat de volumul
acestuia. Cantitatea optimă de solvent utilizată este determinată de faptul că planta trebuie să fie
imersatăîn solvent pe întreaga perioadă de iradiere. În cazul MAE utilizarea unui raport mare
solvent-plantă poate conduce uneori la randamente mai mici de extracție, din cauza agitării
insuficiente.
Timpul de extracție. Un alt parametru care trebuie luat în considerare în cazul extracției
asistată de microunde este timpul de extracție. În principiu, cantitatea de analit extrasă crește odată
cu creșterea timpului de extracție; totuși utilizarea unor timpi de extracție prea mari poate conduce
la degradarea analitului. Adesea, în cazul MAE sunt suficiente 15-20 de minute pentru orice tip de
analit.Este necesara efectuarea unor studii pentru optimizarea timpului de extracție, deoarece
timpul de extracție poate varia în funcție de ce parte a plantei se utilizează.
Puterea microundelor. Puterea microundelor și timpul de iradiere depind unul de celălalt
într-o mare măsură. Combinarea unei puteri mici sau medii cu un timp de iradiere mare poate
conduce la obținerea unor randamente mari de extracție. Cu toate acestea, o astfel de combinare a
celor doi factori poate conduce la degradarea termică a analitului. La temperaturi mari și putere
mare a microundelor au loc rupturi rapide ale peretelui celular, însă odata cu analitul sunt eliberate
în solvent și impurități. Astfel că la puteri mici rupturile peretelui celular au loc succesiv, ceea ce
18
facilitează selectivitatea MAE. Puterea microundelor trebuie aleasă corespunzător pentru a evita
temperaturi foarte mari care ar putea conduce astfel la degradarea solutului și la suprapresiune în
interiorul recipientului.
Caracteristicile matricei probei. Marimea particulelor probei poate avea un impact
semnificativ asupra extracției asistată de microunde. Mărimea particulelor este de obicei în
intervalul 100 µm – 2 mm. Mărunțirea materialului sub formă de pulbere fină poate conduce la
creșterea eficienței datorită faptului că se creează o suprafață mai mare de contatct între matricea
plantei și solvent și, de asemenea, particulele fine pot permite o penetrare mai bună a MW în
matricea plantei. Unul din dezavantajele asociate utilizării de particule fine este dificultatea
separării acestora de solvent ulterior iradierii cu microunde. De obicei, pentru îndepărtarea
particulelor se utilizează centrifugarea și filtrarea, însă particule prea fine (mai mici de 250 µm)
pot cauza probleme în timpul filtrarii.
De asemenea, caracteristicile maricei plantei trebuie evaluate și în timpul procesului de
extracție. Pretrarea probei de plantă înainte de MAE poate conduce la încălzirea selectivă a
matricei plantei. Aceasta metodă se poate aplica pentru extracția de compuși termolabili. În multe
cazuri, apa prezentăîn mod natural în celulele plantelor a condus la creșterea randamentelor în
compușii de interes extrași din plantele respective. De asemenea, impregnarea probelor de plantă
uscată cu solventul de extracție înaintea extracției propriu-zise a condus de asemenea la creșterea
eficientei extracției.
Temperatura. În cazul MAE, temperatura este un factor foarte important de care trebuie să
se țină cont, în special în cazul în care se lucreazăîn sisteme închise. Spre exemplu, pentru
sistemele închise temperatura poate atinge valori mai mari decât temperatura de fierbere a
solventului. Valori ridicate ale temperaturii vor conduce la creșterea eficienței procesului de
extracție din moment ce desorbția analitului din siturile active ale matricei probei va crește. De
asemenea, la temperaturi ridicate solvenții pot solubiliza mult mai bine compușii de interes ca
urmare a scăderii vâscozității solventului ceea ce determină o mai bună umectare și penetrare a
matricei plantei. Pe de altă parte, creșterea temperaturii determină o creștere a presiunii, ceea ce
poate ridica probleme de siguranță. În cazul sistemelor deschise, temperatura poate fi controlată
prin utilizarea combinată a solvenților de extracțieîn funcție de diferențele în ceea ce privește
comportarea la încălzire.

19
  Pretratamentul enzimatic
Extracția compușilor bioactivi utilizând enzime reprezintă o potențială alternativă la
metodele convenționale de extracție bazate pe utilizarea solvenților. Enzimele reprezintă
catalizatori ideali ce pot asista extracția respectiv sinteza compușilor bioactivi de origini naturale.
Principiul extracțiilor pe bază de enzime se axează pe capacitatea inerentă a enzimelor de a cataliza
reacții în condiții blânde, având specificitate si regioselectivitate ridicate. Această metodă oferă de
asemenea posibilitatea de a ne axa pe chimia verde, dat fiind fapul că există o presiune din ce în
ce mai mare asupra industriei alimentare și farmaceutice de a identifica metode mai „curate”de
extracție a compușilor de interes, cu un impact redus asupra mediului .
Utilizarea pretratamentului enzimatic în cazul probelor ce urmează a fi supuse extracției
convenționale cu solvent are rolul de a reduce volumul de solvent utilizatși de a crește eficiența
extracției. Spre exemplu,o metodă favorabilă pentru eliberarea compușilor polifenolici din plante
este reprezentată de pretratamentul enzimatic al probelor. Polifenolii sunt legați de pereții celulari
ai plantelor atât prin legături hidrofilice, cât și prin legături hidrofobice. Adăugarea de enzime
poate conduce la ruperea legăturilor polifenol-perete celular din matricea plantei, facilitând astfel
extracția polifenolilor. În plus, aplicarea unui pretratament enzimatic poate facilita extracția
polifenolilor care se află în plante sub formă de complecși.
Cele mai utilizate enzime în extracția polifenolilor din plante sunt pectinazele, celulazele
și hemicelulazele sau o combinație între acestea. În general pretratamentul enzimatic are o
eficiență mai mare atunci când se utilizează un amesctec de enzime. Astfel, cel mai important
factor îl constituie compoziția amestecului respectiv, deoarece natura activității enzimelor, cât și
raportul în care sunt amestecate determină eficiența procesului. În plus, natura activității enzimelor
determină selectivitatea față de compușii de interes.
Un factor important în ceea ce privește creșterea activității enzimatice și a eficienței
extracției polifenolilor asistată de enzime îl constituie mărimea particulelor probei.
Principalele avantaje ale pretratamentului enzimatic sunt:
 eficiență mare de extracție,
 solubilitatea în apă,
 minimizarea poluării mediului,
 nu presupune utilizarea unor solvenți toxici,
 consum mic de energie,

20
  condiții blânde de operare.
Cu toate acestea, principalul dezavantaj al utilizării enzimelor la scară industrială în
extracția polifenolilor îl constituie costul ridicat al acestora. În plus, comportarea diferită a
enzimelor în funcție de parametri determină, de asemenea, dificultatea ridicării acestei metode la
scară industrială.

6. Procedura de extractie

Materia prima- Frunzele de cătină (Hippophae Rhamnoides L.) şi frunzele de anghinare

(Cynara scolymusL.) sunt măcinate şi sortate la dimensiuni < 0.8 mm.

După prelucrare, materiile prime sunt depozitate în pungi ce conţineau săculeţi cu

silicagel, închise ermetic şi pastrate la racoare şi întuneric pentru a le protejade umiditate și lumină.

a) Extracţia polifenolilor prin metoda convenţionala cu solvent

Experimentele de extracţie conventionala cu solvent se realizeaza în mod discontinuu, în

fiole cu agitare magnetica. Procesele de extracţie se urmăresc la temperaturi diferite (40, 60°Cşi
reflux). Drept solvent se utilizeaza amestec etanol-apă în diferite, utilizând un raport planta :
solvent = 1 : 20 (w/v).

Mod de lucru. Se cântăreşte aproximativ 1 g de planta şi se introduce într-o fiola ce conţine

20 mL solvent. Extracţia se realizează prin încălzirea amestecului solvent – planta sub agitare
puternică la temperatura dorită. Dupa finalizarea procesului de extracţie partea solidă se separă
prin centrifugare timp de 10 minute. Supernatantul se supune analizei de determinare a
continutului totali de polifenoli prin metoda Folin-Ciocâlteu şi determinarea compoziţiei chimice
a polifenolilor prin analiză HPLC cuplată cu detector UV-Vis.

b) Extracţia în câmp de microunde

Condiţiile de extracţie sunt similare cu condiţiile experimentărilor prin metoda

convenţională utilizând aceleași proporții, respectiv 1 g plantă şi 20 mL solvent.Fiolele au fost
plasate în cuptorul cu microunde cu agitare și iradiate pentru perioade diferite de timp,la diferite
temperaturi. Dupa extracţia asistată de microunde probele sunt centrifugate şi analizate prin
aceleeaşi metode ca în cazul extracţiei convenţionale (analiza Folin-Ciocâlteu şi analiza HPLC
cuplata cu detector UV-Vis).

21
 Determinarea conținutului total de polifenoli (TPC)

Testul Folin-Ciocâlteu se bazează pe transferul de electroni în mediu alcalin de la compușii

fenolici la complexul acid fosfomolibdic fosfowolframic formându-se complecși albaştri, care sunt
determinaţi spectroscopic la 760 nm. Conţinutul total de polifenoli (TPC) se exprimă ca miligrame
acid cafeic echivalent pe gram de planta (mgCAE/g plantă).

Conținutul total de polifenoli a fost determinat în toate extractele și fracțiile conform

metodei Folin-Ciocâlteu, utilizând o ecuație liniară în funcție de curba de calibrare a acidului cafeic
de la 1mg/Lla 5 mg / L. Astfel 0,5 mLsolutie de analizat se introduc într-un balon cotat de 10 mL
ce conține0,5 mL reactiv Folin-Ciocâlteu şi 5 mL apă. Solutia astfel obtinută se agită timp de 1
minut pentru a permite reactia dintre polifenoli şi reactivul Folin-Ciocâlteu. Apoi, se introduc 1,5
mLsoluţie 200 g/L Na2CO3, se agită puternic și se completează cu apă până la semn.Se lasă 30 de
minute și se măsoră absorbanța la 760 nm, față de o probă blank.

Conținutul total de polifenoli a fost estimat utilizând curba de calibrare a acidului cafeic,
domeniul de concentrație de la 1 la 5 mg/L. Pentru determinarea curbei de calibrare s-au preparat
8 soluţii de acid cafeic astfel: se iau cate: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 mL soluţie etalon de
acid cafeic de concentratie 0,1 g/L, la care se adauga 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5; 1,0 si 0,5 mL
apa.Fiecare determinare a fost realizată în triplicat.

7. Concluzii

Numeroase studii experimentale şi epidemiologice au demonstrat că antioxidanţii prezenţi

în alimente pot inhiba cancerigeneza prin influenţa lor la nivel molecular în etapa de iniţiere,
promovare şi progresie. Dintre aceşti compuşi în ultimii ani s-au studiat polifenolii, constituenţi ai
plantelor.
Cele mai utilizate metode de extracție a polifenolilor implică utilizarea de solvenți, organici
sau anorganici. Extracția polifenolilor utilizând solvenți se poate face fie utilizând metode
convenționale precum macerarea sau extracția Soxhlet, fie utilizând metode neconvenționale
precum extracția asistată de microunde sau extracția asistată de ultrasunete.

22
 Atât în cazul metodelor convenționale cât și a celor neconvenționale, extracția polifenolilor
este influențată într-o mare măsură de factori precum tipul solventului, raportul solvent:probă,
timp, temperatură respectiv mărimea particulelor și matricea probei. Printre metodele
convenţionale de extracție a polifenolilor din probe solide se enumeră extracția Soxhlet respectiv
macerarea. Extracția Soxhlet se desfășoară de obicei la 90oC pe durata a câteva ore, în timp ce
macerarea are loc la temperatură ambientală însă la timpi foarte mari. Aceste metode sunt simple,
necesită aparatură relativ ieftină, iar gradul de extracție al polifenolilor este ridicat.
Ultrasunetele, având frecvențe mai mari de 20 kHz, facilitează extracția compușilor
organici și anorganici din mătricile solide utilizând solvenți. Extracția asistată de ultrasunete se
bazează pe fenomenul de cavitație acustică care se produce de fiecare dată când un lichid este
supus ultrasunetelor
Extracţia asistată de microunde este o tehnologie curentă pentru extragerea materialelor
biologice fiind o alternativă importantă în procesul de extracţie datorită avantajelor sale cum sunt:
reducerea timpului de extracţie, selectivitate și controlul procesul de încălzire.

8. Bibliografie

23
1. Maria-Jose Motilva, Aida Serra, Alba Macia, “Analysis of food polyphenols by ultra
high-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry”, Journal of
Chromatography A, 1292 (2013) 66– 82.
2. Vinay Kant, Madhuri Mehta, Chandresh Varshneya, “Antioxidant potential and total
phenolic contents of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) pomace”, Free Radicals and
Antioxidants Vol.2 / Issue 4 / Oct–Dec, 2012.
3. Fraga, C.G., Galleano, M., Verstraeten, S.V., Oteiza, P.I., 2010. Basic biochemical
mechanisms behind the health benefits of polyphenols. Mol. Aspects Med. 31, 435–445.
4. Thomas Michel, Emilie Destandau , Claire Elfakir, “Evaluation of a simple and
promising method for extraction of antioxidants fromsea buckthorn (Hippophaë
rhamnoides L.) berries: Pressurised solvent-free microwave assisted extraction”, Food
Chemistry 126 (2011) 1380–1386
5. Mertz, C., Gancel, A-L., Punata, Z., Alter, P., Dhuique-Mayer, C., Vaillant, F., Perez,
A.M., Ruales, J., Prat, P.” Phenolic compounds, carotenoids and antioxidant activity of
three tropicalfruits”, J. Food. Compos. Anal. 2009, 22, 381-387.
6. Liazid, A., Palma, M., Brigui, J., Barroso, G.C.,” Investigation on phenolic compounds
stability during microwave-assisted extraction” J. Chromatogr. A. 2007, 1140, 29-34.
7. Sandrine Périno-Issartier, Zill-e-Huma & Maryline Abert-Vian, Farid Chemat, Solvent
Free Microwave-Assisted Extraction of Antioxidants from Sea Buckthorn (Hippophae
rhamnoides) Food By-Products, Food Bioprocess Technol (2011) 4:1020–1028.
8. Lijun Wang, Curtis L. Weller, Recent advances in extraction of nutraceuticals from plants,
Trends in Food Science & Technology 17 (2006) 300–312
9. Ronald Ross Watson, Polyphenols in Plants: Isolation, Purification and Extract
Preparation, 2014 Elsevier
10. Gaetano Pandino, Sara Lombardo, Gary Williamson, Giovanni Mauromicale, Polyphenol
profile and content in wild and cultivated Cynara cardunculus L., Italian Journal of
Agronomy 2012; 7:e35
11. Anna Ciancolinia, Marion Alignanc,d, Mario Augusto Pagnottab, Julie Miquelc, Gérard
Vilaremc, Paola Crinòa, Morphological characterization, biomass and pharmaceutical

24
compounds in Italian globe artichoke genotypes, Industrial Crops and Products 49 (2013)
326– 333

25