Aglutinarea directă a

hematiilor Hemaglutinarea
imună
Grupele de sânge, sistemul AB0
 Hemaglutinarea imună
Grupele de sânge, sistemul AB0
Hemaglutinarea poate fi:

• imună - este o reacție Ag-Ac, între Ag eritrocitare și

anticorpii corespunzători
și
• neimună - nu este o reacție Ag-Ac, este aplicată în
virologie
 Hemaglutinarea imună
Principiu. Hemaglutinarea imună este o reacție directă Ag-
Ac, între Ag eritrocitare și Ac specifici față de aceste Ag.

Ilustrarea schematică a principiului reacţiei de hemaglutinare

în prezenţa aglutininelor de grup sanguin de tip IgM
Antigenele de grup sanguin
• Ag prezente pe suprafața hematiei: grupate
în 17 sisteme: AB0 (ABH), Rh, P, Lewis, Duffy,
Kid etc.
• Din punct de vedere clinic, cele mai
importante sunt antigenele sistemelor AB0
(ABH) şi Rh.
• Sistemul A B 0 K. Landsteiner (1901),
• Imunohematologia
Grupele sangvine • Antigene A şi B (aglutinogene), pe suprafața
hematiei
in sistemul A, B, • Anticorpi (α și β) din plasmă (aglutinine),
0 aparţin izotipului IgM.

Sistemul de grup sangvin ABO (ABH)

Antigenele de grup sanguin din sistemul AB0 sunt sunt foarte
importante pentru transfuzia sângelui şi pentru transplant.

Oligozaharidele cu rol de epitopi determinanţi ai grupelor sanguine ABO.

Oligozaharidul este ancorat în membrana eritrocitului prin intermediul
sfingomielinei, denumită ceramidă (reprezentată prin pătratul negru).
 Compatibilitatea de grup sangvin
între donor și receptor
• Antigenele și aglutininele corespunzătoare nu pot coexista, întâlnirea
întâmplătoare prin transfuzie este incompatibilă cu viața (are loc o
reacție de aglutinare rapidă)
• Indivizii cu sânge de tip 0 se numesc "donatori universali"
• Indivizii cu sânge tip AB pozitiv sunt numiți "primitori universali"
 Compatibilitatea de grup sangvin între
donor și receptor
• Factorul antigenic Rh
• Factorul antigenic Rh = un sistem complex, format din mai multe
subunităţi antigenice notate cu A B C D F.
• Antigenul D (sau Rh0) este cel important pentru laboratorul clinic.
• Indivizii Rh- trebuie transfuzaţi numai cu sânge Rh-.
• Eritroblastosis foetalis - poate să apară în sarcini ulterioare dacă
tatăl este Rh + și mama este Rh -. Rhogam se administrează prin
injectare la mamele Rh- în această situație pentru a preveni
problemele de incompatibilitate Rh cu sarcini viitoare.
Factorul Rh (Macaccus rhesus)

Anticorpii de tip imun aparţin:

 izotipului IgM, cu efect aglutinant asupra eritrocitelor
 izotipului IgG , care nu produce aglutinarea dar
traverseasa bariera placentara.

IgM – produc aglutinare

- nu traverseaza bariera placentara

IgG – nu produc aglutinare

- traverseaza bariera placentara;
- determina liza hematiilor fetale

Maladia hemolitica a
nou-nascutului
Determinarea compatibilităţii în sistemul
AB0 și Rh
• Aglutinarea directă este testul standard pentru serologia
grupelor de sânge.

• Receptorul trebuie să primească sânge izogrup.

• Testele Beth-Vincent şi Simonin.

Metode de determinare a grupelor sangvine:
Metoda directă (Beth-Vincent)
• Utilizează seruri anti-A, anti-B şi anti-AB.
• Pentru metoda de aglutinare pe carduri o
reacţie pozitivă se validează numai dacă
microtubul de control este negativ.
Reactia pozitivă se apreciază în funcţie de
mărimea aglutinatelor de la + la ++++.
La fiecare testare se utilizează un sânge de
control de grup şi Rh cunoscute.
Pe o lamă se pune succesiv, cu pipete diferite ,
câte o picătură de hemotest în ordine: A, B şi
AB; se omogenizându-se.
Picătura de sânge ar trebui să fie de 10 ori mai
mică decât cea de hemotest.
Se imprimă mişcări circulare uşoare lamei
urmărindu-se apariţia aglutinării în primele 2-
3 minute.
Metoda indirectă plasmatică (Simonin),
• Evidenţiază anticorpii din plasma
analizată cu ajutorul eritrocitelor test,
aglutinarea având loc în godeurile
necăptuşite ale stripului de lucru. Un
godeu de pe strip include controlul
negativ al reacţiei.
Pe o lamă de sticlă/carduri se pun trei
picături din serul de cercetat ; în prima
picătura de ser se adaugă eritrocite test
A, în a doua eritrocite B. Se omogenizeză.
Raportul între eritrocite şi ser trebuie să
fie de aproximativ 1 la 10.
Citirea se face prin rotirea lentă a lamei în
primele 2- 3 minute.
11
Grupele de sânge, sistemul
AB0
Protocolul 3 Determinarea compatibilităţii în sistemul AB0 și Rh

Principiu. Testul Beth-Vincent evidenţiază aglutinogenele necunoscute pe suprafaţa

eritrocitelor de cercetat, după contactul lor cu serurile hemotest anti-AB, anti-A,
anti-B, anti-D, care conţin aglutininele corespunzătoare.
Procedură de lucru
Proba de sânge recoltat: a) sânge capilar din pulpa degetului;
b) sânge venos.
Cauze de respingere a probei: sânge hemolizat.
Analiza se efectuează imediat, dacă acest lucru nu este posibil, proba se păstrează 48 ore
la 2-8°C; pentru metoda automată proba de sânge are o stabilitate de 7 zile la 2-8°C.

Etape de lucru
• Fiecare student va utiliza în procedura de lucru carduri tip cu godeuri
prestabilite
• Depuneți câte o picătură din fiecare din cele 4 seruri hemotest: anti-
AB, anti-A, anti-B, anti-D in godeuri separate.
• Depuneți o picătură mică de sânge de cercetat lângă fiecare picătură
de antiser, la volumul de 1/10 din volumul picăturii de ser, cu pipeta
Pasteur.
• Omogenizați cu ajutorul baghetelor. Atenție!!! folosiți pentru fiecare
antiser baghete diferite.
• Se imprimă mişcări circulare uşoare cardului de citire urmărindu-se
Interpretarea rezultatelor
P1 P2 P3 P4
Anti A

Anti B

Anti AB

Anti D
Aglutinarea pasivă
Hemaglutinarea pasivă
Latex-aglutinarea
Aglutinarea pasivă
 Hemaglutinarea pasivă
Principiu
• Anticorpii din serul de cercetat reacţionează cu antigenele adsorbite pe
hematii, rezultând o reacţie de hemaglutinare. Hemaglutinarea este pasivă,
deoarece hematiile nu participă direct la reacţia imună, ci au numai rolul
de sistem indicator, fiind antrenate în reacţia specifică prin intermediul
antigenelor fixate în prealabil pe suprafaţa lor.

Ag adsorbite și aplicații
- Polizaharide de E. coli, N. meningitidis,
Toxoplasma
- Hematiile tapetate cu proteine sau
polizaharide se utilizează pentru
evidenţierea anticorpilor anti-toxină
difterică şi anti-tetanică, anticorpii anti-
Treponema.
 Principiul și aplicaţiile reacţiei de latex-
aglutinare
Principiu
• Particulele de latex (sfere mici de polistiren) tapetate cu Ac cu specificitate
cunoscută sau Ag standardizate, se leagă moleculele de Ag / Ac de cercetat,
consecinţa fiind aglutinarea.
• Particulele de latex = sistem indicator pentru detectarea reacţiei Ag-Ac.

Aplicații practice
• Testul Waaler-Rose - detectarea factorului reumatoid
• Detectarea Ac anti-nucleari la pacienţii cu lupus eritematos diseminat (LED)
• Testul antiglobulinic direct (testul Coombs)
• Detectarea Ac anti-rubela, anti-streptococi de grup A, anti-Trichinella spiralis,
anti- T. pallidum, anti-CMV, anti-VZV, anti-HIV-1/HIV-2 etc.

Identificare serogrup Streptococcus

• Utilizarea particulelor inerte de latex ca sistem
indicator al reacției Ag-Ac, în locul hematiilor are
avantajul uniformităţii şi stabilităţii reactantului.
• Reacţiile de latex aglutinare - rapide, 3-5 min.
• Sensibile ca şi reacţiile de hemaglutinare
(detectează concentraţii de ng/ml).
 Protocolul 4.
Detectarea serologică a proteinei C reactive (CRP)
prin reacția de latex-aglutinare
 Protocolul 4. Detectarea serologică a proteinei C reactive
(CRP) prin reacția de latex-aglutinare
Principiu
Proteina C reactivă reactant de fază acută care creşte rapid, dar nespecific,
ca răspuns la leziuni tisulare şi inflamaţie (febra reumatismala, artrita
reumatoida), fiind un indicator mai sensibil şi mai prompt decât VSH.
Ac cu specificitate cunoscută fixați pe suprafața particulelor de latex
recunosc și leagă proteina C reactivă (rol de antigen) din serul de testat
consecința fiind agregarea particulelor de latex și apariția în mediul de
reacția a aglutinatelor.
Testul CRP-Latex
Principiu
• Este o reacție de latex aglutinare în care suspensia de particule
de latex acoperite cu anticorpi anti-umani CRP este pusă în
contact față de serul necunoscut (Ag de testat).
• Prezența sau absența unei aglutinari vizibile indică o creștere a
nivelului de CRP în proba de testat peste limita cea mai înaltă de
referință.
Procedura de lucru

https://www.youtube.com/watch?v=zDyETxcAO0Y
Hemaglutinarea neimună (virală)
(HA))
(Protocolul 5)
 Reacția de hemaglutinare virală
(HA)
• Virusuri hemaglutinante, virusuri cu proprietatea de a determina / produce
aglutinarea hematiilor (hemaglutinare virală), fenomen datorat unor
componente virale (hemaglutinine) prezente fie la nivelul învelișurilor virale
(mixovirusuri, paramixovirusuri, ortomixovirusuri) fie la nivelul capsidei virale
(reovirusuri).

• Reacția hemaglutininei virale cu hematiile are ca rezultat formarea unei

rețele hematii aglutinate care se vor dispune neregulat în tubul sau godeul
din placa de microtitrare în care se efectuează reacția. Hematiile neaglutinate
se vor depune pe fundul tubului sau godeului sub forma unui buton
compact (bănuț).
 Reacția de hemaglutinare virală necesită cunoașterea:

• Structurii chimice a hemaglutininelor virale (glicoproteine la virusurile gripale,

lipoproteine la poxvirusuri)
• Hemaglutinarea se realizează cu hematii provenite de la diferite specii în funcție de
virusul studiat (ex antigenele gripale produc aglutinarea hematiilor de om de grup 0,
cobai sau cocoș)
• Vârsta donatorului de hematii (unele antigene necesită hematii provenite de la
organisme adulte, altele de organisme tinere)
• Concentrația suspensiei de hematii (ex. 0.5% hematii de cocoș, este suspensia optimă
pentru evidențierea antigenului gripal).
• Condițiile de reacție (pH și temperatură): pentru evidențierea Ag gripal, amestecul de
reacție se incubează la temperatura camerei.
Protocolul 5. Reacția de hemaglutinare
neimună (virală)
Protocolul 5. Reacția de hemaglutinare neimună
Principiul reacției. Reacția are la bază capacitatea unor antigenelor virale de a se
fixa de receptorii de pe suprafața hematiilor, determinând aglutinarea acestora
(agregare în rețea).
Este o reacție de adsorbție reversibilă a antigenelor pe suprafața hematiilor (nu
este imună). În anumite condiții de temperatură și pH se produce eluția virusului.

Agregare în rețea a hematiilor

Aplicații
Hemaglutinarea este utilizată pentru = Reacția de
determinarea titrului antigenului gripal, hemaglutinare
relevarea prezenței de virusuri
hemaglutinante în culturi celulare infectate.
Reacția de hemaglutinare
• Diluții seriale, binare ale Ag virale în diluent adecvat, care se pun în
contact cu hematiile.
• Ultima diluție a Ag (cea mai mică cantitate de Ag) la care mai are loc
reacția de hemaglutinare = 1 unitate hemaglutinantă (1 UHA) =
titrul antigenelor virale.
• HA este urmată de reacția de hemaglutinoinhibare (reacția de
inhibiție a hemaglutinării) pentru determinarea în serul pacientului
a anticorpilor cu specificitate față de antigenele virale.
• În reacția HAI se va utiliza Ag viral la 4 UHA.
Procedură de lucru

Notați rezultatele testului de HA astfel:

Pozitive(+) = godeuri cu hemaglutinare completă (văl)
Negative (-) = godeuri hemaglutinare absentă (bănuț)
I = hemaglutinare incompletă, godeuri cu formare de bănuț parțial, cu
margini ondulte, sau aspect donat-like.
 Reacțiile de seroneutralizare
Definiție
• Reacții Ag-Ac în care Ag este reprezentat de o moleculă care
induce o anumită modificare a unui sistem biologic (toxine,
virusuri, enzime), care nu se mai produce în prezența Ac specifici,
deoarece Ac determină in vivo și in vitro neutralizarea activității
acestora.
• Anticorpii tipic neutralizanți - IgG.

Aplicațiile reacțiilor de seroneutralizare:

• stabilirea eficienței unor vaccinuri
• izolarea și identificarea unor virusuri (enterovirusuri)
• decelarea și titrarea anticorpilor anti-streptolizină O prin testul ASLO.
 Reacția de hemaglutinoinhibare
(HAI) (Protocol 5 cont.)
Principiu. Reacția HAI se bazează pe capacitatea Ac specifici față de
hemaglutininele virale, denumiți Ac hemaglutinoinhibanți, de a
preveni atașarea virusului gripal la hematii ale diferitor specii (om,
găină, cal, cobai).
Reacția se realizează cu diluții seriale de ser, iar diluția cea mai mare
care previne hemaglutinarea reprezintă titrul HAI al serului respectiv.

• Pentru diagnosticul serologic se lucrează cel puțin 2 seruri:

• Primul în faza acută (2 – 3 zile de la debut)
• Al doilea în faza de convalescență (2 – 3 săptămâni)
• Se realizează diluții binare ale serului de testat. Trecerea prin boală este
evidențiată printr-o creștere de 4x a titrului serului al doilea față de primul.
Schema reacției de HAI
Aplicații ale reacției HAI

• Diagnosticul serologic al infecției cu virus gripal

• Evaluarea rezultatului vaccinării (determinarea titrului)
• Epidemiologie

o Determinarea titrurilor Ac hemaglutinoinhibanți, alături de

ratele de incidență a infecției în populație permit estimări
privind sensibilitatea populației la infecția gripală

https://www.youtube.com/watch?v=nwYlk4eB7yA
 Reacțiile de
seroneutralizare.
Testul ASLO (Anticorpi anti-Streptolizină O)
 Streptolizina O (SLO)
• Exotoxina produsă de streptococi beta-hemolitici din grupul A
• Streptococcus pyogenes
• Infecţii la nivelul mucoaselor, tractului respirator (amigdalite, faringită, pneumonie),
• Infecții ale pielii şi ţesuturilor profunde (impetigo/pioderma, celulite, fasciite necrozante),
sindromul toxic streptococic, scarlatina, septicemie, meningită
• Sechele post-streptococice - febra reumatică, glomerulonefrita.

SLO determină apariția în

organismul infectat a anticorpilor
anti-streptolizină O (Ac anti-SLO)
Testul ASLO
Diagnosticul serologic al infecţiei streptococice se face prin
evidenţierea anticorpilor anti-SLO.

Un titru ASLO crescut (>225U ASLO) poate avea următoarele

semnificații:
• O infecție recentă cu S. pyogenes
• Existența unor complicații tardive ale infecțiilor cu streptococi β
hemolitici (ex. febră reumatoidă, glomerulonefrita acută post-
streptococice).
Protocolul 6. Testul ASLO
Testul ASLO
Principiu. Se bazează pe proprietatea SLO de a produce liza
hematiilor provenite de la diverse specii de animale și constă în
inhibarea hemolizei prin neutralizarea SLO de către anticorpii
anti SLO.

Ilustrarea principiului reacţiei de seroneutralizare ASLO.

Titrul ASLO
• Titrul serului de testat exprimat ca unități ASLO (U ASLO) este
dat de inversul ultimei diluții care nu mai produce hemoliza.

• Titrul ASLO crește după 2 – 3 săptămâni de la debutul unei

infecții streptococice, atinge maximum la 4-6 săptămâni și
revine la normal după 6 luni.

• Titrurile > 225 U ASLO sunt considerate patologice.